一种 C 型口蹄疫亚单位疫苗及其制备方法 【技术领域】
本发明涉及一种疫苗及其制备方法， 本发明所涉及的疫苗是 C 型口蹄疫疫苗及制 备方法， 特别是一种是 C 型口蹄疫亚单位基因工程疫苗及其制备方法。背景技术
口蹄疫 (Foot-and-Mouth Disease， FMD) 是一种能够感染包括牛、 羊、 猪等主要 家畜在内的多种偶蹄动物的一种急性、 烈性、 高度接触性的传染病， 其病原体为口蹄疫病毒 (Foot-and-Mouth Disease Virus， FMDV)。 FMDV 属于微 RNA 科 (Picornaviridae)、 口蹄疫病 毒属 (Aphthovirus)， 共包括 A、 C、 O、 AsiaI、 SAT I、 SAT II 及 SAT III 型 7 个血清型， 各血 清型之间无交叉保护力。FMDV 的病毒粒子直径 20-25nm， 为正二十面体结构， 近似圆形 ； 基 因组为全长 8500(nt) 的正链 RNA， 包括一个开放阅读框 (open reading frame， ORF)， 5’ -非 编码区 (5’ -Untraslated Region， 5’ -UTR) 和 3’ - 非编码区 (3’ -Untraslated Region， 3’ -UTR) ； ORF 编码病毒多聚蛋白， 依赖于自身编码的蛋白酶 (L、 2A、 3C) 及少数的宿主因子， 在经过 3 级裂解后， 形成 4 种病毒结构蛋白 (VP4、 VP2、 VP3 和 VP1) 和 9 种非结构蛋白 (Lab、 Lb、 2A、 2B、 2C、 3A、 3B、 3C 和 3D) ； 四种结构蛋白各 60 分子构成病毒颗粒， VP1 靠近由五个原 粒组成病毒表面的小洞， VP2 和 VP3 位于远端， VP4 则完全位于衣壳里面。其中 VP1 是 FMDV 最主要的结构蛋白， 其上含有一个高度保守的精氨酸 - 甘氨酸 - 天冬氨酸 (Arg-Gly-Asp) (RGD) 基序的 G-H 环 (G-H Loop)， 是细胞的吸附位点的主要成分， 又是重要的中和位点， 一 般位于 VP1 的 140-160 位氨基酸残基。另外在 VP1 的 C 端还存在一个主要的连续性抗原位 点。
C 型 FMDV 共有 4 个抗原位点， 位点 A 位于 VP1 的 G-H 环上， 位点 C 位于 VP1 的 C 末端 ( 约 15 个氨基酸残基 )， 是一个独立的连续性位点， 位点 D 是 C 型 FMDV 的很重要的位 点， 是位于衣壳蛋白三重轴周围的一个不连续性位点， 另外 VP1 的 C 端部分氨基酸也参与位 点 D 的构成。位点 B 位于 VP1 的 βB-C 和 VP1 的 βH-I 环上。C 型 FMDV 的抗原位点与 O 型 FMDV 的抗原位点相比， O 型 FMDV 的位点 A 与位点 C 共同构成位点 1， 而 C 型 FMDV 位点 A 和 C 是两个独立的连续性位点。C 型 FMDV 的 VP3 上包括了 B-B knob 在内的多个抗原位点， 并 且与其他小 RNA 病毒一样， VP3 是结构蛋白中结构最为保守的。因此， VP3 也可以作为基因 工程疫苗制备的基点。
口蹄疫病毒各型之间抗原性不同， 彼此之间不能交互免疫。尽管目前国内外对口 蹄疫的病原学、 血清分型、 诊断和疫苗等方面做了大量的研究， 但是对 C 型口蹄疫的疫苗研 究并没有很大的进展。 C 型 FMD 较其它血清型的 FMD 流行范围较小， 但在我国周边国家都有 过流行史， 因此有必要对其疫苗加强研究， 以作为战略储备。
使用灭活疫苗仍是控制 FMD 的主要手段， 但是其在生产、 运输、 使用中存在着安全 问题和不便， 因此开发新型疫苗是解决这些问题的有效途径。 发明内容本发明提供一 C 型口蹄疫亚单位基因工程疫苗及其制备方法。
本发明的 C 型口蹄疫亚单位疫苗的主要组成为由 C 型口蹄疫的结构蛋白 VP1 和 VP3 按蛋白含量 1 ∶ 1 构成的混合物。
本发明的一个实施例中， 在疫苗中还混合有 206 油佐， 其中 C 型口蹄疫病毒的重组 结构蛋白 VP1 和 VP3 体积之和与 206 油佐的体积比为 1 ∶ 1 即 VP1+VP3( 体积 )/206 佐剂 体积＝ 1 ∶ 1 ； 而 C 型口蹄疫病毒的结构蛋白 VP1 和 VP3 为重组蛋白。
本发明的 C 型口蹄疫亚单位疫苗中的重组 C 型口蹄疫病毒的结构蛋白 VP1 和 VP3 均为 C 型口蹄疫病毒基因 VP1 和 VP3 的真核表达产物， 本发明的 C 型口蹄疫的结构蛋白 VP1 和 VP3 优选为 C 型口蹄疫抗原基因 VP1 和 VP3 在中国仓鼠卵巢细胞 ( 即胞 CHO/dhfr- 细 胞 ) 表达系统表达的产物。
本发明的 C 型口蹄疫的结构蛋白 VP1 和 VP3 的制备方法是 ： 以 C 型口蹄疫病毒为 模板， 分别采用 VP1 引物和 VP3 引物进行 PCR 扩增， 再由将 PCR 得到的产物分别与 pCI-neo 真核表达载体连接， 分别得到重组质粒 pCI-VP1 和 pCI-VP3， 再用重组质粒 pCI-VP1 和 pCI-VP3 分别转染仓鼠卵巢细胞 CHO/dhfr- 细胞得到表达产物。
在本发明所述的 C 型口蹄疫的结构蛋白基因 VP1 和 VP3 的制备方法中所用的扩增 VP1 和 VP3 的引物分别为 ： VP1 引物
上游引物 ： 5′ -GCGAATTCACCACGACCACTGGTGAATCT-3′
下游引物 ： 5′ -GCCTCGAGCTGCTTCGCGGGCGCGATGAG-3′ ；
所用 VP3 引物分别是 ：
VP3 引物
上游引物 ：： 5′ -GCGAATTCGGAATCTTTCCCGTCGCGTGC-3′
下游引物 ：： 5′ -GCCTCGAGTTGTTGTCTAGCGTCCACCG-3′。
本发明所述的 C 型口蹄疫的结构蛋白 VP1 和 VP3 的最佳制备方法是将 C 型口蹄 疫病毒模板 100ng， dNTP(10mM)5μl， 10×pfu buffer 5μl， pfu DNA polymerase 5U 分 别和 VP1 和 VP3 的上下游引物各 50pmol、 补无菌的超纯水至总体积为 50μl， 混合均匀， 按 以下的扩增条件扩增 ： 94℃ 10min， 然后于以下条件进行 30 个循环 ： 94℃ 1min， 56℃ 1min， 72℃ 40s， 最后 72℃延伸 8min ； 再将得到的 VP1 和 VP3 基因片段与 pCI-neo 真核表达载体 连接， 得到重组质粒 pCI-VP1 和 pCI-VP3 ； 将 pCI-VP1 和 pCI-VP3 重组质粒分别转染中国仓 鼠卵巢细胞 (CHOdhfr- 细胞 )， 筛选重组的高表达单克隆细胞株后得到表达产物。
本发明的疫苗由于采用了 C 型口蹄疫的结构蛋白 VP1 和 VP3 按蛋白含量 1 ∶ 1 构 成的混合物， 使其有良好的免疫效果 ； 特别是当疫苗中还混合有 206 油佐， 且其中 C 型口蹄 疫病毒的重组结构蛋白 VP1 和 VP3 与 206 油佐的体积比为 1 ∶ 1 时其免疫效果为最佳。
基因工程亚单位疫苗 (Subunit Vaccine) 又被称为重组亚单位疫苗或生物重组亚 单位疫苗， 主要是采用各种基因工程手段制备病原体亚单位成分， 以此作为抗原来制备疫 苗。目前使用的策略主要是使用各种表达系统 ( 如大肠杆菌表达系统、 真核表达系统、 昆 虫表达系统等 ) 表达抗原的亚单位成分， 以此来制备免疫原。现有技术中大肠杆菌往往是 以包涵体的形式表达外源重组蛋白， 这类蛋白质由于缺乏正常的折叠， 不能形成类似于天 然蛋白质的构象， 所以， 以这类重组蛋白作为抗原制备疫苗， 很难取得理想的保护效果。本
发明中由于采用了哺乳动物细胞进行表达， 所得到的蛋白经翻译加工后， 其结构与生物学 特性更接近于天然蛋白， 故此， 由其制备的疫苗免疫原性更强。 为了提高重组蛋白的免疫原 性， 本发明的最佳实施例中使用了中国仓鼠卵巢细胞 (CHO dhfr- 细胞 )， 与其它表达系统 相比， CHO 具有以下一些优点 ： 1) 具有准确的翻译后折叠及修饰功能， 被表达的蛋白在分子 结构、 理化特性和生物学功能方面最接近于天然蛋白分子。2) 具有产物胞外分泌功能， 便 于下游产物分离纯化。3) 具有重组基因的高效扩增和表达能力。4) 具有贴壁生长特性， 具 有较高的耐受剪切力和渗透压能力。也可以进行悬浮培养， 表达水平较高。5)CHO 属于成 纤维细胞， 很少分泌自身的内源蛋白质， 利于外源蛋白的分离。在 CHO 细胞表达载体中有两 类选择标记。neo 等是非扩增基因， 这种选择标记对目的基因的拷贝数没有影响。另一类 选择标记具有扩增基因的功能， 也称共扩增基因， 如二氢叶酸还原酶 (dhfr)、 谷氨酰胺合成 酶 (GS) 等。当携带共扩增基因的表达载体转染 CHO 细胞后， 随着培养基中选择性药物浓度 的逐渐增加， 共扩增基因的拷贝数不断增加 ； 同时， 其侧翼的 DNA 片段也会相应得到扩增， 使目的基因的拷贝数增加几百到几千倍， 从而达到目的基因的高效表达。目前应用较多的 是 CHO/dhfr- 表达系统， 在 dhfr 基因与目的基因共转化的细胞中， 随着培养基中 MTX 浓度 的增加， dhfr 基因与外源基因均明显扩增。本发明以 C 型口蹄疫病毒为模板， 分别采用 VP1 引物和 VP3 引物进行 PCR 扩增， 再由将 PCR 得到的产物分别与 pCI-neo 真核表达载体连接， 分别得到重组质粒 pCI-VP1 和 pCI-VP3， 再用重组质粒 pCI-VP1 和 pCI-VP3 分别转染仓鼠 卵巢细得到表达产物， 由于 pCI-neo 哺乳动物表达载体携带有人类巨细胞病毒 (CMV) 的即 刻早期增强子 / 启动子区域， 能够产生高度的组成型表达， 位于增强子 / 启动子区域下游的 β-globin/IgG 嵌合内含子也能够进一步增加表达 ； 此外， 此载体含有一种哺乳动物细胞 的选择性标志物 ---- 新霉素磷酸转移酶基因， 所以， 通过 G-418 抗性筛选能够获得稳定转 染的细胞。
本发明所涉及的 C 型口蹄疫 VP1 基因序列和 C 型口蹄疫 VP1 氨基酸序列已经公开 于 GenBank(accession number ： EU 553893.1)、 C 型口蹄疫 VP3 基因序列和 C 型口蹄疫 VP3 氨基酸序列已经公开于 GenBank(accession number ： M90368.1)， 还可参见基因序列表。
本发明选取 C 型 FMDV 的 VP1 和 VP3 蛋白作为亚单位疫苗的研制对象是基于以下 原因 ： 首先， C 型 FMDV 的 VP1 其最主要的结构蛋白， 其上含有一个高度保守的精氨酸 - 甘氨 酸 - 天冬氨酸 (Arg-Gly-Asp)(RGD) 基序的 G-H 环 (G-HLoop)， 是细胞的吸附位点的主要成 分， 又是重要的中和位点， 一般位于 VP1 的 140-160 位氨基酸残基。另外在 VP1 的 C 端还存 在一个主要的连续性抗原位点， 接种动物可以产生中和抗体。其次， C 型 FMDV 的 VP3 上包 括了 B-B knob 在内的多个抗原位点， 并且与其他小 RNA 病毒一样， VP3 是结构蛋白中结构 最为保守的。因此， 以 C 型 FMDV 的 VP1 和 VP3 蛋白作为亚单位疫苗可以有最佳的效果。
本发明中采用的 VP1 引物和 VP3， 在以 C 型口蹄疫病毒模板进行扩增时可得到特异 性的扩增产物， 特别是当采用最佳的扩增条件， 即权利要求 7 所的条件时， 可筛选出重组的 高表达单克隆细胞株， 得到最佳的表达产物。
用本发明给出的方法研制的疫苗不存在传统灭活疫苗灭活不彻底而造成毒力返 强， 从而导致口蹄疫的爆发问题 ； 也不存在传统疫苗生产的大规模生物安全设备和设施， 从 而使其生产成本低于灭活疫苗 ； 同时本发明给出的方法的真核表达系统的表达量较高， 表 达产物十分接近天然蛋白质， 从而免疫动物能够获得较高的免疫保护力 ； 比起原核表达系统， 它不需要蛋白的复性、 纯化等步骤， 具有简单易行的特点 ； 动物实验表明本发明提供的 基因工程亚单位疫苗进行豚鼠和小鼠免疫时， 不存在传统疫苗发热、 红肿等副反应， 免疫产 前 1 周豚鼠的结果表明， 接种该疫苗妊娠动物没有引起流产、 早产和死胎现象， 安全性显著 高于传统疫苗， 具有很好的应用前景。 附图说明
图 1.PCR 扩增 C 型口蹄疫 VP1 目的基因， 其中 ： M.DL 2000marker。
图 2.PCR 扩增 C 型口蹄疫 VP3 目的基因， 其中 ： M.DL 2000marker。
图 3. 双酶切和 PCR 鉴定 VP1 重组载体的结果， 其中 ： M.DL 2000marker。
图 4.VP3 重组载体双酶切和 PCR 鉴定， 其中 ： M 1DL10000Marker， 1 EcoR I、 Xho I 双酶切 pET-VP3 产物， 2PCR 扩增 VP3 产物， M 2DL2000Marker。
图 5.SDS-PAGE 检测 VP1 蛋白结果， 其中 ： M 为蛋白 Marker ； 泳道 1 ： 未浓缩 VP1 融 合蛋白 ； 泳道 2 ： 浓缩后的 VP1 融合蛋白。
图 6.SDS-PAGE 检测 VP3 表达， 其中 ： M： 蛋白 Marker ； 泳道 1 和 3 ： VP3 融合蛋白细 胞上清 ； 泳道 2 ： VP3 融合蛋白全细胞 ； 泳道 ： 4 阴性对照 ； 泳道 5 和 6 ： VP3 融合蛋白细胞沉 淀。 图 7.VP1 蛋白 Western-blotting 分析， 其中 ： M， 蛋白 Marker ； 1， VP1 融合蛋白和 anti-FMDVC 型血清 IgG 反应。2， 阳性对照。
图 8.VP3 纯化产物 Western-blot 检测， 其中 ： M 蛋白质分子量标准， 1 纯化产物 Western-Blotting。
图 9.ELISA 检测疫苗免疫小鼠后的抗体水平。
图 10.ELISA 检测疫苗免疫豚鼠后的抗体水平。
图 11.ELISA 检测疫苗免疫猪后的抗体水平。
具体实施方式
实施例 1 C 型口蹄疫抗原基因 VP1 和 VP3 的扩增及在中国仓鼠卵巢细胞表达系统 的表达
1. 目的基因与质粒连接转化
分别以 VP1 引物
上游引物 ： 5′ -GCGAATTCACCACGACCACTGGTGAATCT-3′ ( 下划线标记为 EcoR I 酶 切位点 )
下游引物 ： 5′ -GCCTCGAGCTGCTTCGCGGGCGCGATGAG-3′ ( 下划线标记为 Xho I 酶 切位点 ) ；
和 VP3 引物
上游引物 ： ： 5′ -GCGAATTCGGAATCTTTCCCGTCGCGTGC-3′ ( 下划线标记为 Xho I 酶 切位点 )
下游引物 ：： 5′ -GCCTCGAGTTGTTGTCTAGCGTCCACCG-3′ ( 下划线标记为 Xho I 酶 切位点 ) ；
以 C 型口蹄疫病毒为模板进行扩增， 其中 ： 基因组模板 100ng， dNTP(10mM)5μl，10×pfu buffer 5μl， pfu DNA polymerase 5U 和 VP1 引物或 VP3 引物正反引物各 50pmol、 再补无菌的超纯水至总体积为 50μl， 混合均匀。
扩增条件 ： 94 ℃ 10min， 然后于以下条件进行 30 个循环 ： 94 ℃ 1min， 56 ℃ 1min， 72℃ 40s， 最后 72℃延伸 8min。
扩增分别得到的 VP1 和 VP3 基因进行凝胶电泳胶并回收目标 VP1 和 VP3 片段。
将上述的 C 型口蹄疫 VP1 和 VP3 扩增产物与 pCI-neo 真核表达载体连接， 具体步 骤为 ：
(1)VP1 或 VP3 目标 DNA 片段 (20ng)、 pCI-neo 真核表达载体 (50ng)、 T4DNA Ligase 5U、 10×T4DNA Ligase Buffer 1μl， 补无菌的超纯水至总体积 10μl。
(2)16℃连接 10 ～ 12 小时制备成连接好载体的基因。
(3) 对步骤 (2) 连接好的样品进行 PCR 检测 ； 连接产物 1ul， dNTP(10mM)5μl， 10×pfu buffer 5μl， pfu DNA polymerase 5U 和正反引物各 50pmol、 补无菌的超纯水 至总体积为 50μl， 混合均匀 ； 扩增条件 ： 94 ℃ 10min， 然后于以下条件进行 30 个循环 ： 94℃ 1min， 56℃ 1min， 72℃ 40s， 最后 72℃延伸 8min。
(4) 连接好的 VP1 和 VP3 重组基因 10ul， 10×H buffer 2ul， EcoR I(8-20U/μl) 和 Xho I(8-20U/μl) 各 1.5ul， ddH2O 定容至 20ul。 (5)1％ TBE 琼脂糖凝胶电泳检测， 紫外分析仪下观察 DNA 条带。
2. 上述的 C 型口蹄疫 VP1 和 VP3 重组基因质粒的表达， 具体如下 ：
上述的 C 型口蹄疫 VP1 或 VP3 重组基因质粒分别命名为 pCI-VP1 和 pCI-VP3， 将鉴 定为阳性的这两种重组质粒载体菌液 20μL 分别接种至 6mL LB 培养基中， 37℃、 200rpm 振 摇过夜。取过夜培养物 20μL 接种于 6mL LB 培养基中， 37℃振摇培养至 OD600 为 0.6-1.0 时， 加入 IPTG 至终浓度为 0.5mM， 37℃诱导 8h， SDS-PAGE 观察各重组菌表达情况。
具体方法是 ： 将所取菌液样 12,000rpm 离心 3min， 弃上清。用去离子水重悬菌体 至无大的细菌块残留， 12.000rpm 离心 3min， 弃去上清， 去离子水重悬菌体。反复冻融 3 次， 12,000rpm 离心 3min， 吸取上清， 菌体用去离子水重悬。取上清和重悬菌体各 20μL 加入 5μL5×Loading Buffer， 混匀后煮沸 7min。蛋白质 Marker 同样煮沸 7min。按预定顺序用 微量加样器吸取待分析样品 5μL， 缓慢加入加样孔。 每加完一个样品， 应在电极缓冲液中彻 底清洗微量加样器。加蛋白质分子量标准 Marker 作参照。200 伏电压电泳 40min 左右， 电 泳结束后， 染色和脱色， 待拍照， 记录结果。
3 C 型口蹄疫 VP1 或 VP3 在中国仓鼠卵巢细胞 (CHOdhfr) 表达系统表达， 具体如 下：
(1) 蛋白的制备
分别将 pCI-VP1 和 pCI-VP3 重组质粒分别转染 CHOdhfr- 细胞， 利用 G418 加压筛 选稳定的含有 pCI-VP1 和 pCI-VP3 重组载体的细胞， 每天传代 1 次， 收集细胞， -20℃。
(2) 未纯化蛋白检测
收集反复冻融的细胞使用 SDS-PAGE 观察结果。
(4)Western-blotting
对表达的所有纯化的蛋白进行 Western blotting 分析， 具体步骤如下 ：
(1) 电泳 ： 取所纯化的各种蛋白制样进行 SDS-PAGE。
(2) 转印 ： 将电泳完的凝胶切除浓缩胶后， 去离子水清洗表面， 然后在膜转移缓冲 液中平衡 30min。剪 1 块与凝胶相同大小的 PVDF 膜， 在 100％甲醇中浸泡 3min 左右后与凝 胶在缓冲液中平衡至 30min 结束。再剪取 8 块与所取 PVDF 大小相同滤纸， 并在转移缓冲液 中浸泡 10min。然后在正极板上按四层滤纸、 PVDF 膜、 凝胶、 四层滤纸的顺序叠放整齐， 用玻 璃棒轻轻挤压， 赶走各层间气泡， 确保各层完全接触后盖上负极板， 120mA 转移 150min。
(3) 封闭 ： 转印结束后， 取下 PVDF 膜， 按照预先标记剪下蛋白质分子量标准 Marker 所在区 PVDF 膜， 置于氨基黑染色液中浸染 2-3min， 取出后用漂洗液 (150mM NaCl， 50mM Tris-HCL， pH 7.5) 脱色， 直至背景兰色脱尽。其余 PVDF 膜用 PBS 冲洗， 加入 10-20mL 封闭 液， 室温轻轻振摇 2h， 或 4℃过夜 ( 配制封闭液时要保证脱脂奶粉充分溶解， 以免未溶解的 奶粉颗粒附着与膜上， 影响实验效果 )。
(4) 与一抗的结合 ： 封闭结束后， 用 PBST 清洗 PVDF 膜 3 次， 每次在摇床上振摇 10min， 加入用 PBST 适当稀释的各检测抗体 10mL， 室温振摇 1.5h， 用 PBST 冲洗 3 次， 每次在 摇床缓慢摇振 10min。
(5) 与二抗的反应 ： 加入适当稀释的辣根过氧化物酶标记的与一抗相对应的二 抗， 室温下轻摇孵育 1h， 取出用 PBST 冲洗 3 次， 每次在摇床缓慢摇振 10min。 (6) 显色 ： 将 PVDF 膜转移到 10-20mL 底物溶液中， 室温避光轻摇 3min 观察显色情 况， 待出现条带时， 立即转入 PBS 缓冲液中终止反应， 室温保存待图像采集。
4. 实验结果
(1) 目的基因 PCR 结果应用 PCR 技术， 扩增到了 VP1 与 VP3 基因预期大小相同的目 的 DNA 片段， 在电泳图中可以看到一条 600bp 和 650bp 左右的两条特异性条带 ( 附图 1 和 2)。
(2) 重组载体鉴定从琼脂糖凝胶中纯化的口蹄疫 VP1 和 VP3 基因 DNA 片段与 pCI-neo 真核表达载体重组载体质粒经 PCR 和酶切鉴定， 结果与预期结果相符 ( 附图 3 和 4)。
(3)SDS-PAGE 检测复性蛋白 SDS-PAGE 检测， VP1 和 VP3 融合蛋白复性及纯化成功。 复性后的 VP1 和 VP3 融合蛋白纯度均能达到 90％以上 ( 附图 5 和 6)。
(4)Western-blotting 检测复性后的蛋白 Western-blotting 检测结果表明， 复性 后的 VP1 及 VP3 重组蛋白能够和相应血清呈阳性反应 ( 附图 7 和 8)。说明复性后的 VP1 和 干扰素蛋白具有良好的反应原性。目标蛋白大小分别为 38Ka 和 50kDa。
实施例二 ： C 型口蹄疫亚单位基因工程疫苗的配制 ；
本实施中将前述得到的 VP1 和 VP3 真核表达产物与 206 没佐剂混合， 制造疫苗 ：
(1) 分别将 VP1 和 VP3 真核表达产物用灭菌水分别稀释至 50μg/ml， 水相。
(2) 将稀释好的 VP1 和 VP3 以蛋白含量 1 ∶ 1 构成的混合物， 再将所得的 VP1 和 VP3 混合物与 206 油佐剂以体积比 1 ∶ 1 混合， 先以 90 ～ 150r/m 慢速转动搅拌 2 分钟后， 再以 10000r/m 高速搅拌 20 分钟， 静置 5 分钟， 制成疫苗。
(3) 将所得乳剂在无菌条件下分装， 得到 C 型口蹄疫基因工程亚单位疫苗。
实施例三 ： C 型口蹄疫亚单位基因工程疫苗的效力试验 ( 包括小鼠、 豚鼠、 猪的免 疫抗体测定 ； 豚鼠的攻毒实验测定 )
实验 1 上述的一种 C 型口蹄疫基因工程亚单位疫苗免疫力试验， 具体如下 ：
1.1 材料与方法
1.1.1 疫苗为按实施例 2 制备的 C 型口蹄疫基因工程亚单位疫苗， 命名为批号 ： 20110305， 20110320， 20110401。
作为对照组 ：
C 型 VP1 口蹄疫基因工程亚单位疫苗由本实验制备， 命名为批号 ： 20110211 ； C型 VP3 口蹄疫基因工程亚单位疫苗由本实验制备， 命名为批号 ： 20110221 ； C 型口蹄疫灭活疫 苗由本实验制备， 批号 ： 20110410。 。
1.1.2 试验动物和毒株 体重约为 20g 的 Balb/C 成年雌性小鼠、 350 ～ 450g 的豚 鼠购自兰州生物制品所实验动物中心， 体重 40kg 的架子猪， 购于定西猪场。C 型 FMDV 毒株 AV104 由 BHK-21 细胞传代并由中国农业科学院兰州兽医研究所保存。
1.1.3 免疫动物 (1) 将 Balb/C 成年雌性小鼠和豚鼠随机进行分组， 每组 5 只， 猪5 只， 将制备好的免疫原于 0d、 14d 进行皮下注射， 小鼠、 豚鼠和猪的免疫剂量分别为 100μl/ 只、 200μl/ 只和 1ml/ 头。(2)C 型口蹄疫灭活疫苗按上述方式进行免疫， 同时设置阴性对 照。以上试验动物在免疫后 7d， 14d， 28d、 35d、 42d 采血并进行检测。
1.1.4 免疫动物抗体测定
1.1.4.1 主要试剂 山羊抗小鼠 IgG 抗体、 兔抗豚鼠 IgG 抗体购自 Sigma 公司。
1.1.4.2 间接 ELISA 检测血清样本中的抗 C 型 FMDV 抗体水平间接 ELISA 检测血清 样本中的抗 C 型 FMDV 抗体水平， 具体步骤如下 ：
(1) 抗原包被 ： 用 ELISA 包被缓冲液将 C 型 FMDV 细胞毒灭活抗原进行 1 ∶ 2 稀释， 然后每孔 50μL 加入 ELISA 微量反应板中， 4℃过夜。
(2) 封闭 ： 将包被抗原的 ELISA 反应板取出， 弃去孔中液体后， 用洗涤缓冲洗涤反 应板 3 次， 拍干。然后加入封闭液， 每孔 50μL， 37℃作用 2.5h。
(3) 加待检血清 ： 封闭结束后， 用洗涤缓冲液 (1×PBST， pH7.4) 洗涤反应板 3 次， 拍干反应板。将待检血清用 PBST 缓冲液进行 1 ∶ 200 稀释后加入反应板中， 每孔 50μL， 每 个样品重复三孔。同时将标准 FMDV 阴性和阳性血清进行同样稀释后加入反应板， 作为阴性 和阳性对照。37℃作用 1h。
(4) 加酶标二抗 ： 取出 ELISA 反应板， 弃去孔中液体后， 用洗涤缓冲洗涤反应板 3 次， 拍干反应板。将 HRP- 山羊抗小鼠 IgG 抗体按其棋盘法确定的最佳浓度进行稀释后加入 反应板。每孔 50μL， 37℃作用 45min。
(5) 显色 ： 取出 ELISA 反应板， 弃去孔中液体后， 用洗涤缓冲洗涤反应板 3 次， 拍干 反应板每孔加入 OPD 底物显色液 100μL， 37℃作用 20min。
(6) 终止 ： 显色反应结束后， 每孔中加入 100μL 终止液 (1.25M 硫酸 ) 终止反应。 用酶标仪在 490nm 处测定 OD 值。
1.2 实验结果
免疫后通过间接 ELSA 测定小鼠、 豚鼠和猪体内针对 C 型 FMD 的抗体效价。所有试 验组在免疫 7d 后可检测出抗体， 二免刺激后抗体水平进一步提升国， 参见附图 9、 10 和 11。 以 PBS 免疫阴性对照组小鼠体内一直未检测出针对 C 型 FMD 的抗体。
试验 2 豚鼠攻毒保护试验
2.1 材料与方法2.1.1 疫苗为按实施例 2 制备的 C 型口蹄疫基因工程亚单位疫苗， 命名为批号 ： 20110305， 20110320， 20110401。
作为对照组 ：
C 型 VP1 口蹄疫基因工程亚单位疫苗由本实验制备， 命名为批号 ： 20110211 ； C型 VP3 口蹄疫基因工程亚单位疫苗由本实验制备， 批号 ： 20110221 ； C 型口蹄疫灭活疫苗由本 实验制备， 命名为批号 ： 20110410。
2.1.2 试验动物和毒株 体重约为 350 ～ 450g 的豚鼠购自兰州生物制品所实验动 物中心。C 型 FMDV 毒株 AV104 由 BHK-21 细胞传代并由本室保存。
2.1.3 免疫动物 (1) 将成年雌性豚鼠随机进行分组， 每组 6 只， 制备好的免疫原于 0d、 14d 进行皮下注射， 免疫剂量为 200μl/ 只。(2)C 型 VP1 口蹄疫基因工程亚单位疫苗 ； C 型 VP3 口蹄疫基因工程亚单位疫苗和 C 型口蹄疫灭活疫苗按上述方式进行免疫， 同时设置 阴性对照。免疫 28 天后所有实验动物采用 100LD50 攻毒。
2.1.4 结果判定 病毒对照组 4/5 发病时免疫组 5/5 保护 ； 或对照组 4/5 发病时免 疫组 4/5 保护以上保护可判为疫苗合格。
2.2 试验结果与讨论 2.2.1 试验结果 分别用 50 和 100LD50/ 只型 FMDV 毒株 AV104 攻毒 14 天， 对照豚 鼠全部发病， 而 C 型口蹄疫基因工程亚单位疫苗免疫组的保护率为 83.3％， 详见表 1、 表 2。
表 1.C 型口蹄疫基因工程亚单位疫苗与灭活疫苗免疫力比较试验结果
表 2.C 型口蹄疫基因工程亚单位疫苗二免的效力试验结果2.2.2 结果
从试验结果可以看出， 由本实验制备 C 型口蹄疫灭活疫苗可以对 50 和 100LD50/ 只 C 型 FMDV 毒株 AV104 强毒攻击达到 100％保护 ； C 型 VP1 口蹄疫基因单疫苗可以对 50LD50C
型 FMDV 毒株 AV104 强毒攻击提供 33.3％保护力， 对 100LD50C 型 FMDV 毒株 AV104 强毒攻击 不能提供保护 ； C 型 VP3 口蹄疫单疫苗无论是对于 50LD50C 型 FMDV 毒株 AV104 强毒攻击还是 100LD50C 型 FMDV 毒株 AV104 强毒攻击均不能提供保护 ； C 型口蹄疫基因工程亚单位疫苗可 以对 50LD50C 型 FMDV 毒株 AV104 强毒攻击达到 100％保护， 对 100LD50C 型 FMDV 毒株 AV104 强毒攻击也能提供 83.3％保护率， 由此可知本发明所提供的由 VP1 和 VP3 组合的 C 型口蹄 疫基因工程亚单位疫苗均比单独的 VP1 或者 VP3 具有更好的免疫效力。
实验 3 本发明的 C 型口蹄疫基因工程亚单位疫苗安全性试验
3.1 材料与方法
3.1.1 疫苗为按实施例 2 制备的 C 型口蹄疫基因工程亚单位疫苗， 命名为批号 ： 20110305， 20110320， 20110401。
作为对照组 ：
C 型口蹄疫灭活疫苗由本实验制备， 命名为批号 ： 20110410。
3.1.2 试验动物和毒株 体重约为 350 ～ 450g 的豚鼠和体重约为 20g 的 Balb/C 成 年雌性小鼠购自兰州生物制品所实验动物中心。C 型 FMDV 毒株 AV104 由 BHK-21 细胞传代 并由本室保存。 3.1.3 动物试验 (1) 成年雌性豚鼠 9 只， 每只皮下注射 2ml ； Balb/C 成年雌性小鼠 15 只， 每只皮下注射 0.5ml。连续观察 7 天， 均不得出现因注射疫苗引起的死亡或明显的局 部不良反应或全身反应。(2) 挑去健康的产前 1 周豚鼠 6 只。每只皮下注射 2ml， 同时设置 对照 1 头。连续观察 7 天， 均不得出现因注射疫苗引起的死亡或明显的局部不良反应或全 身反应。
3.2 试验结果
3.2.1 疫苗对豚鼠和小鼠的安全性
成年雌性豚鼠 9 只， 每只皮下注射 2ml ； Balb/C 成年雌性小鼠 15 只， 每只皮下注 射 0.5ml。 连续观察 7 天， 均未出现因注射疫苗引起的死亡或明显的局部不良反应或全身反 应， 具体结果表 3。
表 3. 疫苗对豚鼠和小鼠的安全性试验结果
3.2.2 本发明的 C 型口蹄疫基因工程亚单位疫苗对产前 1 周豚鼠安全性
成年雌性豚鼠 6 只， 每只皮下注射 2ml 均未出现因注射疫苗引起的死亡或明显的 局部不良反应或全身反应， 具体结果表 4。
表 4. 疫苗对产前 1 周豚鼠安全性
2 号豚鼠注射疫苗后当时死亡
上述结果说明这些基因工程亚单位疫苗豚鼠和小鼠是安全的， 不像传统疫苗那样 存在发热、 红肿等副反应。同时免疫产前 1 周豚鼠的结果表明， 该疫苗对妊娠动物几乎没有 影响， 没有引起流产、 早产和死胎现象。说明疫苗的安全性良好。
由以上内容可知， 本发明的 C 型口蹄疫基因工程亚单位疫苗生产过程中无需接触 任何口蹄疫活病毒， 而且也不用病毒灭活剂， 因此安全可靠。同时使用的新型疫苗佐剂， 也 能增强接种动物的免疫应答。 通过以上实验还表明， 疫苗对豚鼠、 小鼠和妊娠动物的安全性 良好。
本发明涉及一种疫苗及其制备方法， 本发明所涉及的疫苗是 C 型口蹄疫疫苗及制 备方法， 特别是一种是 C 型口蹄疫亚单位基因工程疫苗及其制备方法。背景技术
口蹄疫 (Foot-and-Mouth Disease， FMD) 是一种能够感染包括牛、 羊、 猪等主要 家畜在内的多种偶蹄动物的一种急性、 烈性、 高度接触性的传染病， 其病原体为口蹄疫病毒 (Foot-and-Mouth Disease Virus， FMDV)。 FMDV 属于微 RNA 科 (Picornaviridae)、 口蹄疫病 毒属 (Aphthovirus)， 共包括 A、 C、 O、 AsiaI、 SAT I、 SAT II 及 SAT III 型 7 个血清型， 各血 清型之间无交叉保护力。FMDV 的病毒粒子直径 20-25nm， 为正二十面体结构， 近似圆形 ； 基 因组为全长 8500(nt) 的正链 RNA， 包括一个开放阅读框 (open reading frame， ORF)， 5’ -非 编码区 (5’ -Untraslated Region， 5’ -UTR) 和 3’ - 非编码区 (3’ -Untraslated Region， 3’ -UTR) ； ORF 编码病毒多聚蛋白， 依赖于自身编码的蛋白酶 (L、 2A、 3C) 及少数的宿主因子， 在经过 3 级裂解后， 形成 4 种病毒结构蛋白 (VP4、 VP2、 VP3 和 VP1) 和 9 种非结构蛋白 (Lab、 Lb、 2A、 2B、 2C、 3A、 3B、 3C 和 3D) ； 四种结构蛋白各 60 分子构成病毒颗粒， VP1 靠近由五个原 粒组成病毒表面的小洞， VP2 和 VP3 位于远端， VP4 则完全位于衣壳里面。其中 VP1 是 FMDV 最主要的结构蛋白， 其上含有一个高度保守的精氨酸 - 甘氨酸 - 天冬氨酸 (Arg-Gly-Asp) (RGD) 基序的 G-H 环 (G-H Loop)， 是细胞的吸附位点的主要成分， 又是重要的中和位点， 一 般位于 VP1 的 140-160 位氨基酸残基。另外在 VP1 的 C 端还存在一个主要的连续性抗原位 点。
C 型 FMDV 共有 4 个抗原位点， 位点 A 位于 VP1 的 G-H 环上， 位点 C 位于 VP1 的 C 末端 ( 约 15 个氨基酸残基 )， 是一个独立的连续性位点， 位点 D 是 C 型 FMDV 的很重要的位 点， 是位于衣壳蛋白三重轴周围的一个不连续性位点， 另外 VP1 的 C 端部分氨基酸也参与位 点 D 的构成。位点 B 位于 VP1 的 βB-C 和 VP1 的 βH-I 环上。C 型 FMDV 的抗原位点与 O 型 FMDV 的抗原位点相比， O 型 FMDV 的位点 A 与位点 C 共同构成位点 1， 而 C 型 FMDV 位点 A 和 C 是两个独立的连续性位点。C 型 FMDV 的 VP3 上包括了 B-B knob 在内的多个抗原位点， 并 且与其他小 RNA 病毒一样， VP3 是结构蛋白中结构最为保守的。因此， VP3 也可以作为基因 工程疫苗制备的基点。
口蹄疫病毒各型之间抗原性不同， 彼此之间不能交互免疫。尽管目前国内外对口 蹄疫的病原学、 血清分型、 诊断和疫苗等方面做了大量的研究， 但是对 C 型口蹄疫的疫苗研 究并没有很大的进展。 C 型 FMD 较其它血清型的 FMD 流行范围较小， 但在我国周边国家都有 过流行史， 因此有必要对其疫苗加强研究， 以作为战略储备。
使用灭活疫苗仍是控制 FMD 的主要手段， 但是其在生产、 运输、 使用中存在着安全 问题和不便， 因此开发新型疫苗是解决这些问题的有效途径。 发明内容本发明提供一 C 型口蹄疫亚单位基因工程疫苗及其制备方法。
本发明的 C 型口蹄疫亚单位疫苗的主要组成为由 C 型口蹄疫的结构蛋白 VP1 和 VP3 按蛋白含量 1 ∶ 1 构成的混合物。
本发明的一个实施例中， 在疫苗中还混合有 206 油佐， 其中 C 型口蹄疫病毒的重组 结构蛋白 VP1 和 VP3 体积之和与 206 油佐的体积比为 1 ∶ 1 即 VP1+VP3( 体积 )/206 佐剂 体积＝ 1 ∶ 1 ； 而 C 型口蹄疫病毒的结构蛋白 VP1 和 VP3 为重组蛋白。
本发明的 C 型口蹄疫亚单位疫苗中的重组 C 型口蹄疫病毒的结构蛋白 VP1 和 VP3 均为 C 型口蹄疫病毒基因 VP1 和 VP3 的真核表达产物， 本发明的 C 型口蹄疫的结构蛋白 VP1 和 VP3 优选为 C 型口蹄疫抗原基因 VP1 和 VP3 在中国仓鼠卵巢细胞 ( 即胞 CHO/dhfr- 细 胞 ) 表达系统表达的产物。
本发明的 C 型口蹄疫的结构蛋白 VP1 和 VP3 的制备方法是 ： 以 C 型口蹄疫病毒为 模板， 分别采用 VP1 引物和 VP3 引物进行 PCR 扩增， 再由将 PCR 得到的产物分别与 pCI-neo 真核表达载体连接， 分别得到重组质粒 pCI-VP1 和 pCI-VP3， 再用重组质粒 pCI-VP1 和 pCI-VP3 分别转染仓鼠卵巢细胞 CHO/dhfr- 细胞得到表达产物。
在本发明所述的 C 型口蹄疫的结构蛋白基因 VP1 和 VP3 的制备方法中所用的扩增 VP1 和 VP3 的引物分别为 ： VP1 引物
上游引物 ： 5′ -GCGAATTCACCACGACCACTGGTGAATCT-3′
下游引物 ： 5′ -GCCTCGAGCTGCTTCGCGGGCGCGATGAG-3′ ；
所用 VP3 引物分别是 ：
VP3 引物
上游引物 ：： 5′ -GCGAATTCGGAATCTTTCCCGTCGCGTGC-3′
下游引物 ：： 5′ -GCCTCGAGTTGTTGTCTAGCGTCCACCG-3′。
本发明所述的 C 型口蹄疫的结构蛋白 VP1 和 VP3 的最佳制备方法是将 C 型口蹄 疫病毒模板 100ng， dNTP(10mM)5μl， 10×pfu buffer 5μl， pfu DNA polymerase 5U 分 别和 VP1 和 VP3 的上下游引物各 50pmol、 补无菌的超纯水至总体积为 50μl， 混合均匀， 按 以下的扩增条件扩增 ： 94℃ 10min， 然后于以下条件进行 30 个循环 ： 94℃ 1min， 56℃ 1min， 72℃ 40s， 最后 72℃延伸 8min ； 再将得到的 VP1 和 VP3 基因片段与 pCI-neo 真核表达载体 连接， 得到重组质粒 pCI-VP1 和 pCI-VP3 ； 将 pCI-VP1 和 pCI-VP3 重组质粒分别转染中国仓 鼠卵巢细胞 (CHOdhfr- 细胞 )， 筛选重组的高表达单克隆细胞株后得到表达产物。
本发明的疫苗由于采用了 C 型口蹄疫的结构蛋白 VP1 和 VP3 按蛋白含量 1 ∶ 1 构 成的混合物， 使其有良好的免疫效果 ； 特别是当疫苗中还混合有 206 油佐， 且其中 C 型口蹄 疫病毒的重组结构蛋白 VP1 和 VP3 与 206 油佐的体积比为 1 ∶ 1 时其免疫效果为最佳。
基因工程亚单位疫苗 (Subunit Vaccine) 又被称为重组亚单位疫苗或生物重组亚 单位疫苗， 主要是采用各种基因工程手段制备病原体亚单位成分， 以此作为抗原来制备疫 苗。目前使用的策略主要是使用各种表达系统 ( 如大肠杆菌表达系统、 真核表达系统、 昆 虫表达系统等 ) 表达抗原的亚单位成分， 以此来制备免疫原。现有技术中大肠杆菌往往是 以包涵体的形式表达外源重组蛋白， 这类蛋白质由于缺乏正常的折叠， 不能形成类似于天 然蛋白质的构象， 所以， 以这类重组蛋白作为抗原制备疫苗， 很难取得理想的保护效果。本
发明中由于采用了哺乳动物细胞进行表达， 所得到的蛋白经翻译加工后， 其结构与生物学 特性更接近于天然蛋白， 故此， 由其制备的疫苗免疫原性更强。 为了提高重组蛋白的免疫原 性， 本发明的最佳实施例中使用了中国仓鼠卵巢细胞 (CHO dhfr- 细胞 )， 与其它表达系统 相比， CHO 具有以下一些优点 ： 1) 具有准确的翻译后折叠及修饰功能， 被表达的蛋白在分子 结构、 理化特性和生物学功能方面最接近于天然蛋白分子。2) 具有产物胞外分泌功能， 便 于下游产物分离纯化。3) 具有重组基因的高效扩增和表达能力。4) 具有贴壁生长特性， 具 有较高的耐受剪切力和渗透压能力。也可以进行悬浮培养， 表达水平较高。5)CHO 属于成 纤维细胞， 很少分泌自身的内源蛋白质， 利于外源蛋白的分离。在 CHO 细胞表达载体中有两 类选择标记。neo 等是非扩增基因， 这种选择标记对目的基因的拷贝数没有影响。另一类 选择标记具有扩增基因的功能， 也称共扩增基因， 如二氢叶酸还原酶 (dhfr)、 谷氨酰胺合成 酶 (GS) 等。当携带共扩增基因的表达载体转染 CHO 细胞后， 随着培养基中选择性药物浓度 的逐渐增加， 共扩增基因的拷贝数不断增加 ； 同时， 其侧翼的 DNA 片段也会相应得到扩增， 使目的基因的拷贝数增加几百到几千倍， 从而达到目的基因的高效表达。目前应用较多的 是 CHO/dhfr- 表达系统， 在 dhfr 基因与目的基因共转化的细胞中， 随着培养基中 MTX 浓度 的增加， dhfr 基因与外源基因均明显扩增。本发明以 C 型口蹄疫病毒为模板， 分别采用 VP1 引物和 VP3 引物进行 PCR 扩增， 再由将 PCR 得到的产物分别与 pCI-neo 真核表达载体连接， 分别得到重组质粒 pCI-VP1 和 pCI-VP3， 再用重组质粒 pCI-VP1 和 pCI-VP3 分别转染仓鼠 卵巢细得到表达产物， 由于 pCI-neo 哺乳动物表达载体携带有人类巨细胞病毒 (CMV) 的即 刻早期增强子 / 启动子区域， 能够产生高度的组成型表达， 位于增强子 / 启动子区域下游的 β-globin/IgG 嵌合内含子也能够进一步增加表达 ； 此外， 此载体含有一种哺乳动物细胞 的选择性标志物 ---- 新霉素磷酸转移酶基因， 所以， 通过 G-418 抗性筛选能够获得稳定转 染的细胞。
本发明所涉及的 C 型口蹄疫 VP1 基因序列和 C 型口蹄疫 VP1 氨基酸序列已经公开 于 GenBank(accession number ： EU 553893.1)、 C 型口蹄疫 VP3 基因序列和 C 型口蹄疫 VP3 氨基酸序列已经公开于 GenBank(accession number ： M90368.1)， 还可参见基因序列表。
本发明选取 C 型 FMDV 的 VP1 和 VP3 蛋白作为亚单位疫苗的研制对象是基于以下 原因 ： 首先， C 型 FMDV 的 VP1 其最主要的结构蛋白， 其上含有一个高度保守的精氨酸 - 甘氨 酸 - 天冬氨酸 (Arg-Gly-Asp)(RGD) 基序的 G-H 环 (G-HLoop)， 是细胞的吸附位点的主要成 分， 又是重要的中和位点， 一般位于 VP1 的 140-160 位氨基酸残基。另外在 VP1 的 C 端还存 在一个主要的连续性抗原位点， 接种动物可以产生中和抗体。其次， C 型 FMDV 的 VP3 上包 括了 B-B knob 在内的多个抗原位点， 并且与其他小 RNA 病毒一样， VP3 是结构蛋白中结构 最为保守的。因此， 以 C 型 FMDV 的 VP1 和 VP3 蛋白作为亚单位疫苗可以有最佳的效果。
本发明中采用的 VP1 引物和 VP3， 在以 C 型口蹄疫病毒模板进行扩增时可得到特异 性的扩增产物， 特别是当采用最佳的扩增条件， 即权利要求 7 所的条件时， 可筛选出重组的 高表达单克隆细胞株， 得到最佳的表达产物。
用本发明给出的方法研制的疫苗不存在传统灭活疫苗灭活不彻底而造成毒力返 强， 从而导致口蹄疫的爆发问题 ； 也不存在传统疫苗生产的大规模生物安全设备和设施， 从 而使其生产成本低于灭活疫苗 ； 同时本发明给出的方法的真核表达系统的表达量较高， 表 达产物十分接近天然蛋白质， 从而免疫动物能够获得较高的免疫保护力 ； 比起原核表达系统， 它不需要蛋白的复性、 纯化等步骤， 具有简单易行的特点 ； 动物实验表明本发明提供的 基因工程亚单位疫苗进行豚鼠和小鼠免疫时， 不存在传统疫苗发热、 红肿等副反应， 免疫产 前 1 周豚鼠的结果表明， 接种该疫苗妊娠动物没有引起流产、 早产和死胎现象， 安全性显著 高于传统疫苗， 具有很好的应用前景。 附图说明
图 1.PCR 扩增 C 型口蹄疫 VP1 目的基因， 其中 ： M.DL 2000marker。
图 2.PCR 扩增 C 型口蹄疫 VP3 目的基因， 其中 ： M.DL 2000marker。
图 3. 双酶切和 PCR 鉴定 VP1 重组载体的结果， 其中 ： M.DL 2000marker。
图 4.VP3 重组载体双酶切和 PCR 鉴定， 其中 ： M 1DL10000Marker， 1 EcoR I、 Xho I 双酶切 pET-VP3 产物， 2PCR 扩增 VP3 产物， M 2DL2000Marker。
图 5.SDS-PAGE 检测 VP1 蛋白结果， 其中 ： M 为蛋白 Marker ； 泳道 1 ： 未浓缩 VP1 融 合蛋白 ； 泳道 2 ： 浓缩后的 VP1 融合蛋白。
图 6.SDS-PAGE 检测 VP3 表达， 其中 ： M： 蛋白 Marker ； 泳道 1 和 3 ： VP3 融合蛋白细 胞上清 ； 泳道 2 ： VP3 融合蛋白全细胞 ； 泳道 ： 4 阴性对照 ； 泳道 5 和 6 ： VP3 融合蛋白细胞沉 淀。 图 7.VP1 蛋白 Western-blotting 分析， 其中 ： M， 蛋白 Marker ； 1， VP1 融合蛋白和 anti-FMDVC 型血清 IgG 反应。2， 阳性对照。
图 8.VP3 纯化产物 Western-blot 检测， 其中 ： M 蛋白质分子量标准， 1 纯化产物 Western-Blotting。
图 9.ELISA 检测疫苗免疫小鼠后的抗体水平。
图 10.ELISA 检测疫苗免疫豚鼠后的抗体水平。
图 11.ELISA 检测疫苗免疫猪后的抗体水平。
具体实施方式
实施例 1 C 型口蹄疫抗原基因 VP1 和 VP3 的扩增及在中国仓鼠卵巢细胞表达系统 的表达
1. 目的基因与质粒连接转化
分别以 VP1 引物
上游引物 ： 5′ -GCGAATTCACCACGACCACTGGTGAATCT-3′ ( 下划线标记为 EcoR I 酶 切位点 )
下游引物 ： 5′ -GCCTCGAGCTGCTTCGCGGGCGCGATGAG-3′ ( 下划线标记为 Xho I 酶 切位点 ) ；
和 VP3 引物
上游引物 ： ： 5′ -GCGAATTCGGAATCTTTCCCGTCGCGTGC-3′ ( 下划线标记为 Xho I 酶 切位点 )
下游引物 ：： 5′ -GCCTCGAGTTGTTGTCTAGCGTCCACCG-3′ ( 下划线标记为 Xho I 酶 切位点 ) ；
以 C 型口蹄疫病毒为模板进行扩增， 其中 ： 基因组模板 100ng， dNTP(10mM)5μl，10×pfu buffer 5μl， pfu DNA polymerase 5U 和 VP1 引物或 VP3 引物正反引物各 50pmol、 再补无菌的超纯水至总体积为 50μl， 混合均匀。
扩增条件 ： 94 ℃ 10min， 然后于以下条件进行 30 个循环 ： 94 ℃ 1min， 56 ℃ 1min， 72℃ 40s， 最后 72℃延伸 8min。
扩增分别得到的 VP1 和 VP3 基因进行凝胶电泳胶并回收目标 VP1 和 VP3 片段。
将上述的 C 型口蹄疫 VP1 和 VP3 扩增产物与 pCI-neo 真核表达载体连接， 具体步 骤为 ：
(1)VP1 或 VP3 目标 DNA 片段 (20ng)、 pCI-neo 真核表达载体 (50ng)、 T4DNA Ligase 5U、 10×T4DNA Ligase Buffer 1μl， 补无菌的超纯水至总体积 10μl。
(2)16℃连接 10 ～ 12 小时制备成连接好载体的基因。
(3) 对步骤 (2) 连接好的样品进行 PCR 检测 ； 连接产物 1ul， dNTP(10mM)5μl， 10×pfu buffer 5μl， pfu DNA polymerase 5U 和正反引物各 50pmol、 补无菌的超纯水 至总体积为 50μl， 混合均匀 ； 扩增条件 ： 94 ℃ 10min， 然后于以下条件进行 30 个循环 ： 94℃ 1min， 56℃ 1min， 72℃ 40s， 最后 72℃延伸 8min。
(4) 连接好的 VP1 和 VP3 重组基因 10ul， 10×H buffer 2ul， EcoR I(8-20U/μl) 和 Xho I(8-20U/μl) 各 1.5ul， ddH2O 定容至 20ul。 (5)1％ TBE 琼脂糖凝胶电泳检测， 紫外分析仪下观察 DNA 条带。
2. 上述的 C 型口蹄疫 VP1 和 VP3 重组基因质粒的表达， 具体如下 ：
上述的 C 型口蹄疫 VP1 或 VP3 重组基因质粒分别命名为 pCI-VP1 和 pCI-VP3， 将鉴 定为阳性的这两种重组质粒载体菌液 20μL 分别接种至 6mL LB 培养基中， 37℃、 200rpm 振 摇过夜。取过夜培养物 20μL 接种于 6mL LB 培养基中， 37℃振摇培养至 OD600 为 0.6-1.0 时， 加入 IPTG 至终浓度为 0.5mM， 37℃诱导 8h， SDS-PAGE 观察各重组菌表达情况。
具体方法是 ： 将所取菌液样 12,000rpm 离心 3min， 弃上清。用去离子水重悬菌体 至无大的细菌块残留， 12.000rpm 离心 3min， 弃去上清， 去离子水重悬菌体。反复冻融 3 次， 12,000rpm 离心 3min， 吸取上清， 菌体用去离子水重悬。取上清和重悬菌体各 20μL 加入 5μL5×Loading Buffer， 混匀后煮沸 7min。蛋白质 Marker 同样煮沸 7min。按预定顺序用 微量加样器吸取待分析样品 5μL， 缓慢加入加样孔。 每加完一个样品， 应在电极缓冲液中彻 底清洗微量加样器。加蛋白质分子量标准 Marker 作参照。200 伏电压电泳 40min 左右， 电 泳结束后， 染色和脱色， 待拍照， 记录结果。
3 C 型口蹄疫 VP1 或 VP3 在中国仓鼠卵巢细胞 (CHOdhfr) 表达系统表达， 具体如 下：
(1) 蛋白的制备
分别将 pCI-VP1 和 pCI-VP3 重组质粒分别转染 CHOdhfr- 细胞， 利用 G418 加压筛 选稳定的含有 pCI-VP1 和 pCI-VP3 重组载体的细胞， 每天传代 1 次， 收集细胞， -20℃。
(2) 未纯化蛋白检测
收集反复冻融的细胞使用 SDS-PAGE 观察结果。
(4)Western-blotting
对表达的所有纯化的蛋白进行 Western blotting 分析， 具体步骤如下 ：
(1) 电泳 ： 取所纯化的各种蛋白制样进行 SDS-PAGE。
(2) 转印 ： 将电泳完的凝胶切除浓缩胶后， 去离子水清洗表面， 然后在膜转移缓冲 液中平衡 30min。剪 1 块与凝胶相同大小的 PVDF 膜， 在 100％甲醇中浸泡 3min 左右后与凝 胶在缓冲液中平衡至 30min 结束。再剪取 8 块与所取 PVDF 大小相同滤纸， 并在转移缓冲液 中浸泡 10min。然后在正极板上按四层滤纸、 PVDF 膜、 凝胶、 四层滤纸的顺序叠放整齐， 用玻 璃棒轻轻挤压， 赶走各层间气泡， 确保各层完全接触后盖上负极板， 120mA 转移 150min。
(3) 封闭 ： 转印结束后， 取下 PVDF 膜， 按照预先标记剪下蛋白质分子量标准 Marker 所在区 PVDF 膜， 置于氨基黑染色液中浸染 2-3min， 取出后用漂洗液 (150mM NaCl， 50mM Tris-HCL， pH 7.5) 脱色， 直至背景兰色脱尽。其余 PVDF 膜用 PBS 冲洗， 加入 10-20mL 封闭 液， 室温轻轻振摇 2h， 或 4℃过夜 ( 配制封闭液时要保证脱脂奶粉充分溶解， 以免未溶解的 奶粉颗粒附着与膜上， 影响实验效果 )。
(4) 与一抗的结合 ： 封闭结束后， 用 PBST 清洗 PVDF 膜 3 次， 每次在摇床上振摇 10min， 加入用 PBST 适当稀释的各检测抗体 10mL， 室温振摇 1.5h， 用 PBST 冲洗 3 次， 每次在 摇床缓慢摇振 10min。
(5) 与二抗的反应 ： 加入适当稀释的辣根过氧化物酶标记的与一抗相对应的二 抗， 室温下轻摇孵育 1h， 取出用 PBST 冲洗 3 次， 每次在摇床缓慢摇振 10min。 (6) 显色 ： 将 PVDF 膜转移到 10-20mL 底物溶液中， 室温避光轻摇 3min 观察显色情 况， 待出现条带时， 立即转入 PBS 缓冲液中终止反应， 室温保存待图像采集。
4. 实验结果
(1) 目的基因 PCR 结果应用 PCR 技术， 扩增到了 VP1 与 VP3 基因预期大小相同的目 的 DNA 片段， 在电泳图中可以看到一条 600bp 和 650bp 左右的两条特异性条带 ( 附图 1 和 2)。
(2) 重组载体鉴定从琼脂糖凝胶中纯化的口蹄疫 VP1 和 VP3 基因 DNA 片段与 pCI-neo 真核表达载体重组载体质粒经 PCR 和酶切鉴定， 结果与预期结果相符 ( 附图 3 和 4)。
(3)SDS-PAGE 检测复性蛋白 SDS-PAGE 检测， VP1 和 VP3 融合蛋白复性及纯化成功。 复性后的 VP1 和 VP3 融合蛋白纯度均能达到 90％以上 ( 附图 5 和 6)。
(4)Western-blotting 检测复性后的蛋白 Western-blotting 检测结果表明， 复性 后的 VP1 及 VP3 重组蛋白能够和相应血清呈阳性反应 ( 附图 7 和 8)。说明复性后的 VP1 和 干扰素蛋白具有良好的反应原性。目标蛋白大小分别为 38Ka 和 50kDa。
实施例二 ： C 型口蹄疫亚单位基因工程疫苗的配制 ；
本实施中将前述得到的 VP1 和 VP3 真核表达产物与 206 没佐剂混合， 制造疫苗 ：
(1) 分别将 VP1 和 VP3 真核表达产物用灭菌水分别稀释至 50μg/ml， 水相。
(2) 将稀释好的 VP1 和 VP3 以蛋白含量 1 ∶ 1 构成的混合物， 再将所得的 VP1 和 VP3 混合物与 206 油佐剂以体积比 1 ∶ 1 混合， 先以 90 ～ 150r/m 慢速转动搅拌 2 分钟后， 再以 10000r/m 高速搅拌 20 分钟， 静置 5 分钟， 制成疫苗。
(3) 将所得乳剂在无菌条件下分装， 得到 C 型口蹄疫基因工程亚单位疫苗。
实施例三 ： C 型口蹄疫亚单位基因工程疫苗的效力试验 ( 包括小鼠、 豚鼠、 猪的免 疫抗体测定 ； 豚鼠的攻毒实验测定 )
实验 1 上述的一种 C 型口蹄疫基因工程亚单位疫苗免疫力试验， 具体如下 ：
1.1 材料与方法
1.1.1 疫苗为按实施例 2 制备的 C 型口蹄疫基因工程亚单位疫苗， 命名为批号 ： 20110305， 20110320， 20110401。
作为对照组 ：
C 型 VP1 口蹄疫基因工程亚单位疫苗由本实验制备， 命名为批号 ： 20110211 ； C型 VP3 口蹄疫基因工程亚单位疫苗由本实验制备， 命名为批号 ： 20110221 ； C 型口蹄疫灭活疫 苗由本实验制备， 批号 ： 20110410。 。
1.1.2 试验动物和毒株 体重约为 20g 的 Balb/C 成年雌性小鼠、 350 ～ 450g 的豚 鼠购自兰州生物制品所实验动物中心， 体重 40kg 的架子猪， 购于定西猪场。C 型 FMDV 毒株 AV104 由 BHK-21 细胞传代并由中国农业科学院兰州兽医研究所保存。
1.1.3 免疫动物 (1) 将 Balb/C 成年雌性小鼠和豚鼠随机进行分组， 每组 5 只， 猪5 只， 将制备好的免疫原于 0d、 14d 进行皮下注射， 小鼠、 豚鼠和猪的免疫剂量分别为 100μl/ 只、 200μl/ 只和 1ml/ 头。(2)C 型口蹄疫灭活疫苗按上述方式进行免疫， 同时设置阴性对 照。以上试验动物在免疫后 7d， 14d， 28d、 35d、 42d 采血并进行检测。
1.1.4 免疫动物抗体测定
1.1.4.1 主要试剂 山羊抗小鼠 IgG 抗体、 兔抗豚鼠 IgG 抗体购自 Sigma 公司。
1.1.4.2 间接 ELISA 检测血清样本中的抗 C 型 FMDV 抗体水平间接 ELISA 检测血清 样本中的抗 C 型 FMDV 抗体水平， 具体步骤如下 ：
(1) 抗原包被 ： 用 ELISA 包被缓冲液将 C 型 FMDV 细胞毒灭活抗原进行 1 ∶ 2 稀释， 然后每孔 50μL 加入 ELISA 微量反应板中， 4℃过夜。
(2) 封闭 ： 将包被抗原的 ELISA 反应板取出， 弃去孔中液体后， 用洗涤缓冲洗涤反 应板 3 次， 拍干。然后加入封闭液， 每孔 50μL， 37℃作用 2.5h。
(3) 加待检血清 ： 封闭结束后， 用洗涤缓冲液 (1×PBST， pH7.4) 洗涤反应板 3 次， 拍干反应板。将待检血清用 PBST 缓冲液进行 1 ∶ 200 稀释后加入反应板中， 每孔 50μL， 每 个样品重复三孔。同时将标准 FMDV 阴性和阳性血清进行同样稀释后加入反应板， 作为阴性 和阳性对照。37℃作用 1h。
(4) 加酶标二抗 ： 取出 ELISA 反应板， 弃去孔中液体后， 用洗涤缓冲洗涤反应板 3 次， 拍干反应板。将 HRP- 山羊抗小鼠 IgG 抗体按其棋盘法确定的最佳浓度进行稀释后加入 反应板。每孔 50μL， 37℃作用 45min。
(5) 显色 ： 取出 ELISA 反应板， 弃去孔中液体后， 用洗涤缓冲洗涤反应板 3 次， 拍干 反应板每孔加入 OPD 底物显色液 100μL， 37℃作用 20min。
(6) 终止 ： 显色反应结束后， 每孔中加入 100μL 终止液 (1.25M 硫酸 ) 终止反应。 用酶标仪在 490nm 处测定 OD 值。
1.2 实验结果
免疫后通过间接 ELSA 测定小鼠、 豚鼠和猪体内针对 C 型 FMD 的抗体效价。所有试 验组在免疫 7d 后可检测出抗体， 二免刺激后抗体水平进一步提升国， 参见附图 9、 10 和 11。 以 PBS 免疫阴性对照组小鼠体内一直未检测出针对 C 型 FMD 的抗体。
试验 2 豚鼠攻毒保护试验
2.1 材料与方法2.1.1 疫苗为按实施例 2 制备的 C 型口蹄疫基因工程亚单位疫苗， 命名为批号 ： 20110305， 20110320， 20110401。
作为对照组 ：
C 型 VP1 口蹄疫基因工程亚单位疫苗由本实验制备， 命名为批号 ： 20110211 ； C型 VP3 口蹄疫基因工程亚单位疫苗由本实验制备， 批号 ： 20110221 ； C 型口蹄疫灭活疫苗由本 实验制备， 命名为批号 ： 20110410。
2.1.2 试验动物和毒株 体重约为 350 ～ 450g 的豚鼠购自兰州生物制品所实验动 物中心。C 型 FMDV 毒株 AV104 由 BHK-21 细胞传代并由本室保存。
2.1.3 免疫动物 (1) 将成年雌性豚鼠随机进行分组， 每组 6 只， 制备好的免疫原于 0d、 14d 进行皮下注射， 免疫剂量为 200μl/ 只。(2)C 型 VP1 口蹄疫基因工程亚单位疫苗 ； C 型 VP3 口蹄疫基因工程亚单位疫苗和 C 型口蹄疫灭活疫苗按上述方式进行免疫， 同时设置 阴性对照。免疫 28 天后所有实验动物采用 100LD50 攻毒。
2.1.4 结果判定 病毒对照组 4/5 发病时免疫组 5/5 保护 ； 或对照组 4/5 发病时免 疫组 4/5 保护以上保护可判为疫苗合格。
2.2 试验结果与讨论 2.2.1 试验结果 分别用 50 和 100LD50/ 只型 FMDV 毒株 AV104 攻毒 14 天， 对照豚 鼠全部发病， 而 C 型口蹄疫基因工程亚单位疫苗免疫组的保护率为 83.3％， 详见表 1、 表 2。
表 1.C 型口蹄疫基因工程亚单位疫苗与灭活疫苗免疫力比较试验结果
表 2.C 型口蹄疫基因工程亚单位疫苗二免的效力试验结果2.2.2 结果
从试验结果可以看出， 由本实验制备 C 型口蹄疫灭活疫苗可以对 50 和 100LD50/ 只 C 型 FMDV 毒株 AV104 强毒攻击达到 100％保护 ； C 型 VP1 口蹄疫基因单疫苗可以对 50LD50C
型 FMDV 毒株 AV104 强毒攻击提供 33.3％保护力， 对 100LD50C 型 FMDV 毒株 AV104 强毒攻击 不能提供保护 ； C 型 VP3 口蹄疫单疫苗无论是对于 50LD50C 型 FMDV 毒株 AV104 强毒攻击还是 100LD50C 型 FMDV 毒株 AV104 强毒攻击均不能提供保护 ； C 型口蹄疫基因工程亚单位疫苗可 以对 50LD50C 型 FMDV 毒株 AV104 强毒攻击达到 100％保护， 对 100LD50C 型 FMDV 毒株 AV104 强毒攻击也能提供 83.3％保护率， 由此可知本发明所提供的由 VP1 和 VP3 组合的 C 型口蹄 疫基因工程亚单位疫苗均比单独的 VP1 或者 VP3 具有更好的免疫效力。
实验 3 本发明的 C 型口蹄疫基因工程亚单位疫苗安全性试验
3.1 材料与方法
3.1.1 疫苗为按实施例 2 制备的 C 型口蹄疫基因工程亚单位疫苗， 命名为批号 ： 20110305， 20110320， 20110401。
作为对照组 ：
C 型口蹄疫灭活疫苗由本实验制备， 命名为批号 ： 20110410。
3.1.2 试验动物和毒株 体重约为 350 ～ 450g 的豚鼠和体重约为 20g 的 Balb/C 成 年雌性小鼠购自兰州生物制品所实验动物中心。C 型 FMDV 毒株 AV104 由 BHK-21 细胞传代 并由本室保存。 3.1.3 动物试验 (1) 成年雌性豚鼠 9 只， 每只皮下注射 2ml ； Balb/C 成年雌性小鼠 15 只， 每只皮下注射 0.5ml。连续观察 7 天， 均不得出现因注射疫苗引起的死亡或明显的局 部不良反应或全身反应。(2) 挑去健康的产前 1 周豚鼠 6 只。每只皮下注射 2ml， 同时设置 对照 1 头。连续观察 7 天， 均不得出现因注射疫苗引起的死亡或明显的局部不良反应或全 身反应。
3.2 试验结果
3.2.1 疫苗对豚鼠和小鼠的安全性
成年雌性豚鼠 9 只， 每只皮下注射 2ml ； Balb/C 成年雌性小鼠 15 只， 每只皮下注 射 0.5ml。 连续观察 7 天， 均未出现因注射疫苗引起的死亡或明显的局部不良反应或全身反 应， 具体结果表 3。
表 3. 疫苗对豚鼠和小鼠的安全性试验结果
3.2.2 本发明的 C 型口蹄疫基因工程亚单位疫苗对产前 1 周豚鼠安全性
成年雌性豚鼠 6 只， 每只皮下注射 2ml 均未出现因注射疫苗引起的死亡或明显的 局部不良反应或全身反应， 具体结果表 4。
表 4. 疫苗对产前 1 周豚鼠安全性
2 号豚鼠注射疫苗后当时死亡
上述结果说明这些基因工程亚单位疫苗豚鼠和小鼠是安全的， 不像传统疫苗那样 存在发热、 红肿等副反应。同时免疫产前 1 周豚鼠的结果表明， 该疫苗对妊娠动物几乎没有 影响， 没有引起流产、 早产和死胎现象。说明疫苗的安全性良好。
由以上内容可知， 本发明的 C 型口蹄疫基因工程亚单位疫苗生产过程中无需接触 任何口蹄疫活病毒， 而且也不用病毒灭活剂， 因此安全可靠。同时使用的新型疫苗佐剂， 也 能增强接种动物的免疫应答。 通过以上实验还表明， 疫苗对豚鼠、 小鼠和妊娠动物的安全性 良好。
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