穿心莲提取物及其化学成份在制备治疗病理性血管新生疾 病的药物中的应用 【技术领域】
本发明涉及一种具有调控血管新生作用的穿心莲提取物及其化学成份的医药新用途。 背景技术 血管生成是指通过血管内皮细胞迁移、 增殖， 在原有的血管上以出芽的方式生长 出新的血管网， 是机体严格控制的一个多因素、 级联、 整体、 动态的过程。在病理因素作用 下， 促血管生成因子异常表达， 打破了机体对血管形成的动态调控平衡， 原来静止的血管内 皮细胞将迅速增生， 新生血管异常形成， 常常出现在慢性炎症与纤维化、 肿瘤生长与转移、 肥胖、 糖尿病视网膜疾病、 糖尿病肾病、 银屑病、 风湿性关节炎、 子宫内膜异位症等疾病中。
穿心莲为爵床科植物穿心莲 Andrograpis panniculata Nees 的全草或叶， 主产于 中国、 印度和部分南亚地区。味苦， 性寒， 归肺、 胃、 肝经。功效清热解毒， 凉血消肿。古代常 用于治疗感冒发热， 咽喉肿痛， 口舌生疮， 顿咳劳嗽， 泄泻痢疾， 热淋涩痛， 痈肿疮疡， 毒蛇咬 伤等。 穿心莲的主要成分有内酯、 甾醇、 多种黄酮类化合物、 生物碱， 还有少量蛋白质和维生 素等， 其活性成分主要是以穿心莲内酯为代表的二萜内酯类化合物及其葡萄糖苷衍生物。 国内外研究表明， 穿心莲内酯及其衍生物对中毒性肝损害的抵抗活性， 利胆活性， 对机体非 特异免疫功能的调节作用， 抗 HIV 活性， 对心、 脑缺血的保护作用， 抗生育作用均有良好的 活性。近年来， 在抗肿瘤方面的研究更突显出了穿心莲内酯的作用， 对胃癌、 肝癌、 肺癌、 乳 癌、 恶性葡萄胎及绒毛膜上皮癌等均具有良好的抗肿瘤作用。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提出穿心莲提取物及其化学成份的医药新用途。
通过体内体外实验研究， 发明人首次发现穿心莲提取物及其化学成份能够显著性 地抑 制血管内皮生长因子诱导的血管新生， 其中穿心莲内酯类化合物， 尤其是穿心莲内酯 活性最强， 并阐明其分子机制。穿心莲内酯首次被确认为潜在性的血管内皮生长因子抑制 剂， 可以作为治疗病理性血管新生疾病的候选者。
本发明的穿心莲提取物的制备过程并无特别之处。将中药穿心莲叶打粉， 用水、 20％～ 95％乙醇、 丙酮、 乙酸乙酯、 汽油或石油醚回流提取， 加入常见药用辅料制成任何一 种药学上所说的剂型， 优选浸膏、 流浸膏、 酒剂、 酊剂、 口服液、 丸剂、 散剂、 滴丸、 片剂或胶囊 剂。
本发明的穿心莲提取物具有防治病理性血管新生疾病的作用很可能与如下物质 的作用密切相关 ： 穿心莲中的二萜内酯类物质， 尤其是穿心莲内酯、 异穿心莲内酯、 新穿心 莲内酯、 14- 去氧穿心莲内酯、 脱水穿心莲内酯、 8- 甲基穿心莲内酯苷元、 新穿心莲内酯苷 元以及它们的衍生物。
随后的药效实验将证明， 穿心莲提取物及穿心莲中的二萜内酯类化合物可治疗糖尿病视网膜病、 肿瘤、 风湿性关节炎、 子宫内膜异位症、 糖尿病肾病、 银屑病等多种病理性血 管新生疾病。穿心莲是药食兼用的纯天然的植物提取物， 具有高效的调控血管新生作用并 治疗病理性血管新生疾病。 附图说明
图 1 是穿心莲内酯对血管内皮生长因子 (VEGF) 诱导人脐静脉内皮细胞 ERK1/2 磷 酸化的影响图。
图 2 是穿心莲内酯对血管内皮生长因子 (VEGF) 诱导人脐静脉内皮细胞 p38 磷酸 化的影响图。
图 3 是穿心莲内酯对血管内皮生长因子 (VEGF) 诱导人脐静脉内皮细胞 JNK/SAPK 磷酸化的影响图。
图 4 是穿心莲内酯对血管内皮生长因子 (VEGF) 诱导人脐静脉内皮细胞 VEGFR2 磷 酸化的影响图。 具体实施方式 下面结合附图和具体实施例进一步阐述本发明。 这些实施例应理解为仅用于说明 本发明而不用于限制本发明的保护范围。在阅读了本发明记载的内容之后， 本领域技术人 员可以对本发明作各种改动或修改， 这些等效变化和修饰同样落入本发明权利要求所限定 的范围。
实施例 1( 穿心莲提取物抑制血管内皮生长因子 VEGF 诱导人脐静脉内皮细胞 HUVECs 的生长、 迁移和管腔形成 )
本发明首先考察穿心莲提取物对 VEGF 诱导 HUVECs 生长、 迁移和管腔形成的影响。
1.1 实验材料 ：
1.1.1. 新生儿脐带
由上海国际和平妇婴保健院提供。在无菌条件下， 于健康产妇分娩后立即取新生 胎儿脐带， 长度 20cm 左右， 置于 4℃ HBSS 中， 1 小时内送细胞培养室。
1.1.2. 药物及其制备
穿心莲水提物 ： 采用穿心莲叶粗粉， 用 10 倍量水提取三次， 每次 3h， 滤液合并后减 压浓缩至穿心莲生药计浓度 2g/mL， 即得穿心莲水提物。
I 型胶原酶、 肝素、 明胶和溴化 -3(4， 5- 二甲基噻唑 -2)2， 5- 二甲苯基四氮唑 (MTT) 购自美国 Sigma 公司， 胎牛血清 (FBS)、 Matrigel、 M199 培养液、 0.25％胰蛋白酶和促 内皮细胞生长添加物 (ECGS) 购自美国 Invitrogen 公司。血管内皮生长因子 (VEGF) 购自 美国 PeproTech 公司。实验中所用其它试剂均为国产分析纯。
1.2 实验方法 ：
1.2.1 人脐静脉内皮细胞的分离与原代培养
无菌条件下取健康产妇正常娩出的胎盘端游离脐带置， 15-20cm， 4℃保存于 HBSS 中。脐静脉一端插入灌胃针头并固定， 注入 HBSS 液冲洗干净静脉腔内血迹和血块 ； 用止 血钳夹闭脐静脉另一端， 灌胶原酶液使管腔充盈， 顶端封闭， 37℃水浴 15 分钟， 消化后取出 脐带， 轻柔按摩血管以增加内皮细胞脱落， 消化液转入含血清的培养液中， 终止胶原酶， 用
HBSS 灌洗消化后的血管， 收集并与消化液一并离心， 1000r/min， 5 分钟， 弃上清收集 沉淀 细胞， 并用含 20％胎牛血清的 M199 培液重悬， 移入培养皿中， 用 2ml 培液重悬， 用含 20％胎 牛血清的 M199 培液基， 并添加 10ng/ml EGF， 30ng/ml ECGS 和 5U/ml 肝素， 于 37℃， 5％ CO2 及饱和湿度的培养箱中培养， 用 0.25％胰蛋白酶 -0.04％ EDTA 消化传代， 取对数生长期细 胞用于实验。对分离所得的人脐静脉内皮细胞进行鉴定， 由专职老师在倒置显微镜下观察 细胞形态鉴定， 并通过免疫荧光检测细胞 VWF 表达， 鉴定为原代 HUVEC 细胞。
1.2.2 药物抑制细胞增殖实验
取对数生长期的细胞， 将细胞制成细胞悬液， 按一定的浓度铺入 96 孔板中， 待 细胞贴壁生长状态良好时加入待测药物与细胞共孵 48 小时后， 加入 10μl MTT( 终浓度 0.5mg/ml) 置培养箱反应 4 小时， 加入 50μl 三联剂 (10％ SDS-5％异丁醇 -0.01M HCL) 于 培养箱中充分溶解 12 小时以上， 最后在 OD570/630nm 处测定吸光值。细胞存活率 (％ ) ＝ 给药组 OD(570nm-630nm)/ 对照组 OD(570nm-630nm)×100％， 对照组加含等量 DMSO 的细胞 培养液而不加任何药物。
1.2.3 药物抑制生长因子诱导细胞增殖实验
取对数生长期的细胞， 将细胞制成细胞悬液， 按一定的浓度铺入 96 孔板中， 待细 胞贴壁生长状态良好时， 弃原培养基， 换含 1％胎牛血清的 M199 培养基， 加入待测药物 15 分 钟后， 加入生长因子 (VEGF 或 bFGF) 与细胞共孵 48 小时后， 加入 10μl MTT( 终浓度 0.5mg/ ml) 置培养箱反应 4 小时， 加入 50μl 三联剂 (10％ SDS-5％异丁醇 -0.01M HCL) 于培养箱 中充分溶解 12 小时以上， 最后在 OD570/630nm 处测定吸光值。细胞存活率 (％ ) ＝给药组 OD(570nm-630nm)/ 对照组 OD(570nm-630nm)×100％， 对照组加含等量 DMSO 的细胞培养液 而不加任何药物。
1.2.4 迁移实验
Transwell 小室用 0.1％明胶包被 1h 后， 取出晾干， 将消化好的人脐静脉内皮细胞 5 用无血清培液洗 3 次， 稀释为 4×10 /ml， 于上室加入 100ul(4×104cells/well) 细胞悬液。 下室加入 600μl 的无血清培液， 并加入 VEGF(10ng/ml)， 穿膜 8 小时。吸去上下室培液， 以 4℃ 4％多聚甲醛室温固定 30min， 用棉签擦去内室上层未迁移细胞， 0.1％结晶紫常温染色 10min。以 PBS 漂洗多余染。显微镜下拍照并计数， 最后用 10％乙酸 100ul/ 孔抽提 10min， 用酶标仪 600nm 下测定 OD 值。
1.2.5 管腔形成实验
96 孔板每孔铺上冷的液体基质胶 30μl， 在 37℃下固化 45 分钟。每孔加 100μl 4 细胞悬液 (1×10 cells/well) 同时加不同浓度的药物或对照， 孵育 4 小时。用倒置差像显 微镜记录图像， 计算完整的管腔形成数。
1.2.6 统计学处理
实验数据均用平均值 ± 标准误表示， 采用 SPSS 11.5 统计软件进行分析， 以 One-WayANOVA 方式进行方差分析， 两两比较采用 LSD 法， P ＜ 0.05 为具有统计学显著性差 异标准。
1.3 实验结果
1.3.1 穿心莲提取物对 HUVEC 人脐静脉内皮细胞静息期和血管内皮生长因子 (VEGF) 诱导的增殖影响由表 1 可见， 穿心莲提取物于 0-17.5μg/ml， 对静息期人脐静脉内皮细胞的增殖 无影响， 说明对人脐静脉内皮细胞无明显的细胞毒性。穿心莲提取物于 3.5μg/ml 时， 能够 显著性地抑制 VEGF 诱导人脐静脉内皮细胞的增殖， 并呈剂量依赖性
表 1 穿心莲提取物对人脐静脉内皮细胞 HUVECs 静息期和血管内皮生长因子 (VEGF) 诱导的增殖影响 (n ＝ 15)
** *** 与溶媒组比较， P ＜ 0.01 ； P ＜ 0.001 ； 1.3.2 穿心莲提取物对血管生长因子 VEGF 诱导人脐静脉内皮细胞 HUVECs 迁移的影响。 由表 2 可见， 穿心莲提取物于 0-17.5μg/ml， 穿心莲提取物于 1.75μg/ml 时， 能够 显著性地抑制 VEGF 诱导人脐静脉内皮细胞的迁移， 并呈剂量依赖性。
表 2 穿心莲提取物对血管生长因子 VEGF 诱导人脐静脉内皮细胞 HUVECs 迁移的影 响 (n ＝ 6)
* ** *** 与溶媒组比较， P ＜ 0.05 ； P ＜ 0.01 ； P ＜ 0.001 ；1.3.3 穿心莲提取物对血管生长因子 VEGF 诱导人脐静脉内皮细胞 HUVECs 管腔形 成的影响。
由表 3 可见， 穿心莲提取物于 0-17.5μg/ml， 穿心莲提取物于 0.7μg/ml 时， 能够 显著性地抑制 VEGF 诱导人脐静脉内皮细胞的管腔形成， 并呈剂量依赖性。
表 3 穿心莲提取物对血管生长因子 VEGF 诱导人脐静脉内皮细胞 HUVECs 管腔形成 的影响 (n ＝ 9)
* *** 与溶媒组比较， P ＜ 0.05 ； P ＜ 0.001 ；
实施例 2( 穿心莲植物中二萜内酯类化合物对血管内皮生长因子 (VEGF) 所诱导的 人脐静脉内皮细胞的生长、 迁移和管腔形成的影响 )。
在确定了穿心莲提取物具有较强的抑制血管内皮生长因子 (VEGF) 诱导的人脐静 脉内皮细胞 HUVECs 生长、 迁移和管腔形成的作用， 本发明进一步考察了穿心莲植物中二萜 内酯类化合物对血管内皮生长因子 (VEGF) 所诱导的人脐静脉内皮细胞的生长、 迁移和管 腔形成的影响
2.1 实验材料 ：
2.1.1 新生儿脐带
由上海国际和平妇婴保健院提供。在无菌条件下， 于健康产妇分娩后立即取新生 胎儿脐带， 长度 20em 左右， 置于 4℃ HBSS 中， 1 小时内送细胞培养室。
2.1.2 药物
穿心莲植物中二萜内酯类代表化合物从穿心莲叶中分离提取的单体化合物， 均由 1 13 上海中医药大学中药研究所提供， 其结构主要经 HNMR 和 CNMR 鉴定， 纯度 98％以上 ( 结构 如式 1 所示 )。
2.1.3 试剂
I 型胶原酶、 肝素、 明胶和溴化 -3(4， 5- 二甲基噻唑 -2)2， 5- 二甲苯基四氮唑 (MTT) 购自美国 Sigma 公司， 胎牛血清 (FBS)、 Matrigel、 M199 培养液、 0.25％胰蛋白酶和促 内皮细胞生长添加物 (ECGS) 购自美国 Invitrogen 公司。血管内皮生长因子 (VEGF) 购自 美国 PeproTech 公司。实验中所用其它试剂均为国产分析纯。
2.2 实验方法 ：
2.2.1 药物配制
穿心莲植物中二萜内酯类代表化合物用二甲基亚枫 (DMSO) 溶解， 配成母液浓度 为 0.1mol/L， 母液均用一次性灭菌滤器 (0.22μM) 过滤灭菌。 加药时用无血清 M199 培养基 配制浓度 ： 25μM， 使 DMSO 在培养中总浓度不超过 0.1％。
2.2.2 人脐静脉内皮细胞的分离与原代培养
无菌条件下取健康产妇正常娩出的胎盘端游离脐带置， 15-20cm， 4℃保存于 HBSS 中。脐静脉一端插入灌胃针头并固定， 注入 HBSS 液冲洗干净静脉腔内血迹和血块 ； 用止 血钳夹闭脐静脉另一端， 灌胶原酶液使管腔充盈， 顶端封闭， 37℃水浴 15 分钟， 消化后取出 脐带， 轻柔按摩血管以增加内皮细胞脱落， 消化液转入含血清的培养液中， 终止胶原酶， 用 HBSS 灌洗消化后的血管， 收集并与消化液一并离心， 1000r/min， 5 分钟， 弃上清收集沉淀细 胞， 并用含 20％胎牛血清的 M199 培液重悬， 移入培养皿中， 用 2ml 培液重悬， 用含 20％胎牛 血清的 M199 培液基， 并添加 10ng/ml EGF， 30ng/ml ECGS 和 5U/ml 肝素， 于 37℃， 5％ CO2 及 饱和湿度的培养箱中培养， 用 0.25％胰蛋白酶 -0.04％ EDTA 消化传代， 取对数生长期细胞 用于实验。对分离所得的人脐静脉内皮细胞进行鉴定， 由专职老师在倒置显微镜下观察细 胞形态鉴定， 并通过免疫荧光检测细胞 VWF 表达， 鉴定为原代 HUVEC 细胞。 2.2.3 药物抑制细胞增殖实验
取对数生长期的细胞， 将细胞制成细胞悬液， 按一定的浓度铺入 96 孔板中， 待 细胞贴壁生长状态良好时加入待测药物与细胞共孵 48 小时后， 加入 10μl MTT( 终浓度 0.5mg/ml) 置培养箱反应 4 小时， 加入 50μl 三联剂 (10％ SDS-5％异丁醇 -0.01M HCL) 于 培养箱中充分溶解 12 小时以上， 最后在 OD570/630nm 处测定吸光值。细胞存活率 (％ ) ＝ 给药组 OD(570nm-630nm)/ 对照组 OD(570nm-630nm)×100％， 对照组加含等量 DMSO 的细胞 培养液而不加任何药物。
2.2.4 药物抑制生长因子诱导细胞增殖实验
取对数生长期的细胞， 将细胞制成细胞悬液， 按一定的浓度铺入 96 孔板中， 待细 胞 贴壁生长状态良好时， 弃原培养基， 换含 1 ％胎牛血清的 M199 培养基， 加入待测药物 15 分钟后， 加入生长因子 (VEGF 或 bFGF) 与细胞共孵 48 小时后， 加入 10μl MTT( 终浓度 0.5mg/ml) 置培养箱反应 4 小时， 加入 50μl 三联剂 (10％ SDS-5％异丁醇 -0.01M HCL) 于 培养箱中充分溶解 12 小时以上， 最后在 OD570/630nm 处测定吸光值。细胞存活率 (％ ) ＝ 给药组 OD(570nm-630nm)/ 对照组 OD(570nm-630nm)×100％， 对照组加含等量 DMSO 的细胞 培养液而不加任何药物。
2.2.5 迁移实验
Transwell 小室用 0.1％明胶包被 1h 后， 取出晾干， 将消化好的人脐静脉内皮细胞 5 用无血清培液洗 3 次， 稀释为 4×10 /ml， 于上室加入 100ul(4×104cells/well) 细胞悬液。 下室加入 600μl 的无血清培液， 并加入 VEGF(10ng/ml)， 穿膜 8 小时。吸去上下室培液， 以 4℃ 4％多聚甲醛室温固定 30min， 用棉签擦去内室上层未迁移细胞， 0.1％结晶紫常温染色 10min。以 PBS 漂洗多余染。显微镜下拍照并计数， 最后用 10％乙酸 100ul/ 孔抽提 10min， 用酶标仪 600nm 下测定 OD 值。
2.2.6 管腔形成实验
96 孔板每孔铺上冷的液体基质胶 30μl， 在 37℃下固化 45 分钟。每孔加 100μl 4 细胞悬液 (1×10 cells/well) 同时加不同浓度的药物或对照， 孵育 4 小时。用倒置差像显 微镜记录图像， 计算完整的管腔形成数。
2.2.7 统计学处理
实 验 数 据 均 用 平 均 值 土 标 准 误 表 示， 采 用 SPSS 11.5 统 计 软 件 进 行 分 析， 以 One-WayANOVA 方式进行方差分析， 两两比较采用 LSD 法， P ＜ 0.05 为具有统计学显著性差 异标准。
2.3 实验结果 ：
2.3.1 穿心莲植物中二萜内酯类代表化合物对人脐静脉内皮细胞 (HUVECs) 静息 期和血管内皮生长因子 (VEGF) 诱导的增殖影响。
由表 4 可见， 中药穿心莲中二萜内酯类化合物新穿心莲内酯、 脱水穿心莲内酯、 14- 去氧穿心莲内酯、 新穿心莲内酯苷元、 8- 甲基穿心莲内酯苷元和穿心莲内酯于 25μM 时， 均对静息期人脐静脉内皮细胞的增殖无影响， 说明对人脐静脉内皮细胞无明显的细胞 毒性， 但同时能够显著性地抑制 VEGF 诱导人脐静脉内皮细胞的增殖。
表 4 穿心莲植物中二萜内酯类代表化合物对 HUVECs 静息期和 VEGF 诱导期生长抑 制率 (％ ) 的影响
*** 与溶媒组比较， P ＜ 0.001 ；
2.3.2 穿心莲植物中二萜内酯类化合物对血管内皮生长因子 (VEGF) 诱导人脐静 脉内皮细胞迁移的影响。
由表 5 可见， 中药穿心莲中二萜内酯类化合物新穿心莲内酯、 脱水穿心莲内酯、 14- 去氧穿心莲内酯、 新穿心莲内酯苷元、 8- 甲基穿心莲内酯苷元和穿心莲内酯于 25μM 时， 能够显著性地抑制 VEGF 诱导人脐静脉内皮细胞的迁移。
表 5 穿心莲植物中二萜内酯类代表化合物对 VEGF 诱导 HUVECs 迁移抑制率 (％ ) 的影响
*** 与溶媒组比较， P ＜ 0.001 ；2.3.3 穿心莲植物中二萜内酯类化合物对血管内皮生长因子 (VEGF) 诱导人脐静 脉内皮细胞管腔形成的影响。
由表 6 可见， 中药穿心莲中二萜内酯类化合物新穿心莲内酯、 脱水穿心莲内酯、 14- 去氧穿心莲内酯、 新穿心莲内酯苷元、 8- 甲基穿心莲内酯苷元和穿心莲内酯于 25μM 时， 能够显著性地抑制 VEGF 诱导人脐静脉内皮细胞的管腔形成。
表 6 穿心莲植物中二萜内酯类代表化合物对 VEGF 诱导 HUVECs 管腔形成抑制率 (％ ) 的影响
*** 与溶媒组比较， P ＜ 0.001 ；
实施例 3( 穿心莲内酯抑制血管内皮生长因子 (VEGF) 所诱导的人脐静脉内皮细胞 的生长、 迁移和管腔形成的药效药理试验 )。
在确定了穿心莲植物中二萜内酯类代表化合物均具有较强的抑制血管内皮生长 因子 (VEGF) 诱导的人脐静脉内皮细胞 HUVECs 生长、 迁移和管腔形成的作用， 本发明进一步 考察了穿心莲内酯不同浓度对血管内皮生长因子 (VEGF) 所诱导的人脐静脉内皮细胞的生 长、 迁移和管腔形成的影响。
3.1 实验材料 ：
3.1.1 新生儿脐带
由上海国际和平妇婴保健院提供。在无菌条件下， 于健康产妇分娩后立即取新生 胎儿脐带， 长度 20cm 左右， 置于 4℃ HBSS 中， 1 小时内送细胞培养室。
3.1.2 药物
穿心莲内酯是从穿心莲叶中分离提取的单体化合物， 均由上海中医药大学中药研 1 13 究所提供， 其结构主要经 HNMR 和 CNMR 鉴定， 纯度 98％以上 ( 结构如式 1 所示 )。
3.1.3 试剂
I 型胶原酶、 肝素、 明胶和溴化 -3(4， 5- 二甲基噻唑 -2)2， 5- 二甲苯基四氮唑 (MTT) 购自美国 Sigma 公司， 胎牛血清 (FBS)、 Matrigel、 M199 培养液、 0.25％胰蛋白酶和促 内皮细胞生长添加物 (ECGS) 购自美国 Invitrogen 公司。血管内皮生长因子 (VEGF) 购自 美国 PeproTech 公司。实验中所用其它试剂均为国产分析纯。 3.2 实验方法 ：
3.2.1 药物配制
穿心莲内酯用二甲基亚枫 (DMSO) 溶解， 配成母液浓度为 0.1mol/L， 母液均用一次 性灭菌滤器 (0.22μM) 过滤灭菌。加药时用无血清 M199 培养基配制所需的 5 个浓度， 使 DMSO 在培养中总浓度不超过 0.1％。
3.2.2 人脐静脉内皮细胞的分离与原代培养
无菌条件下取健康产妇正常娩出的胎盘端游离脐带置， 15-20cm， 4℃保存于 HBSS 中。脐静脉一端插入灌胃针头并固定， 注入 HBSS 液冲洗干净静脉腔内血迹和血块 ； 用止 血钳夹闭脐静脉另一端， 灌胶原酶液使管腔充盈， 顶端封闭， 37℃水浴 15 分钟， 消化后取出 脐带， 轻柔按摩血管以增加内皮细胞脱落， 消化液转入含血清的培养液中， 终止胶原酶， 用 HBSS 灌洗消化后的血管， 收集并与消化液一并离心， 1000r/min， 5 分钟， 弃上清收集沉淀细 胞， 并用含 20％胎牛血清的 M199 培液重悬， 移入培养皿中， 用 2ml 培液重悬， 用含 20％胎牛 血清的 M199 培液基， 并添加 10ng/ml EGF， 30ng/ml ECGS 和 5U/ml 肝素， 于 37℃， 5％ CO2 及饱和湿度的培养箱中培养， 用 0.25％胰蛋白酶 -0.04％ EDTA 消化传代， 取对数生长期细 胞用于实验。对分离所得的人脐静脉内皮细胞进行鉴定， 由专职老师在倒置显微镜下观察 细胞形态鉴定， 并通过免疫荧光检测细胞 VWF 表达， 鉴定为原代 HUVEC 细胞。
3.2.3 药物抑制细胞增殖实验
取对数生长期的细胞， 将细胞制成细胞悬液， 按一定的浓度铺入 96 孔板中， 待 细胞贴壁生长状态良好时加入待测药物与细胞共孵 48 小时后， 加入 10μl MTT( 终浓度 0.5mg/ml) 置培养箱反应 4 小时， 加入 50μl 三联剂 (10％ SDS-5％异丁醇 -0.01M HCL) 于 培养箱中充分溶解 12 小时以上， 最后在 OD570/630nm 处测定吸光值。细胞存活率 (％ ) ＝ 给药组 OD(570nm-630nm)/ 对照组 OD(570nm-630nm)×100％， 对照组加含等量 DMSO 的细胞 培养液而不加任何药物。
3.2.4 药物抑制生长因子诱导细胞增殖实验
取对数生长期的细胞， 将细胞制成细胞悬液， 按一定的浓度铺入 96 孔板中， 待细 胞贴壁生长状态良好时， 弃原培养基， 换含 1％胎牛血清的 M199 培养基， 加入待测药物 15 分 钟后， 加入生长因子 (VEGF 或 bFGF) 与细胞共孵 48 小时后， 加入 10μl MTT( 终浓度 0.5mg/ ml) 置培养箱反应 4 小时， 加入 50μl 三联剂 (10％ SDS-5％异丁醇 -0.01M HCL) 于培养箱 中充分溶解 12 小时以上， 最后在 OD570/630nm 处测定吸光值。细胞存活率 (％ ) ＝给药组 OD(570nm-630nm)/ 对照组 OD(570nm-630nm)×100％， 对照组加含等量 DMSO 的细胞培养液 而不加任何药物。
3.2.5 迁移实验
Transwell 小室用 0.1％明胶包被 1h 后， 取出晾干， 将消化好的人脐静脉内皮细胞 5 用无血清培液洗 3 次， 稀释为 4×10 /ml， 于上室加入 100ul(4×104cells/well) 细胞悬液。 下室加入 600μl 的无血清培液， 并加入 VEGF(10ng/ml)， 穿膜 8 小时。吸去上下室培液， 以 4℃ 4％多聚甲醛室温固定 30min， 用棉签擦去内室上层未迁移细胞， 0.1％结晶紫常温染色 10min。 以 PBS 漂洗多余染。 显微镜下拍照并计数， 最后用 10％乙酸 100ul/ 孔抽 提 10min， 用酶标仪 600nm 下测定 OD 值。 3.2.6 管腔形成实验
96 孔板每孔铺上冷的液体基质胶 30μl， 在 37℃下固化 45 分钟。每孔加 100μl 4 细胞悬液 (1×10 cells/well) 同时加不同浓度的药物或对照， 孵育 4 小时。用倒置差像显 微镜记录图像， 计算完整的管腔形成数。
3.2.7 统计学处理
实验数据均用平均值 ± 标准误表示， 采用 SPSS 11.5 统计软件进行分析， 以 One-WayANOVA 方式进行方差分析， 两两比较采用 LSD 法， P ＜ 0.05 为具有统计学显著性差 异标准。
3.3 实验结果 ：
3.3.1 穿心莲内酯 (Andro) 对人脐静脉内皮细胞静息期和血管内皮生长因子 (VEGF) 诱导的增殖影响。
由表 7 可见， 穿心莲内酯于 0-25μM， 对静息期人脐静脉内皮细胞的增殖无影响， 说明对人脐静脉内皮细胞无明显的细胞毒性。由图 3 可见， 穿心莲内酯于 10μM 时， 能够显 著性地抑制 VEGF 诱导人脐静脉内皮细胞的增殖， 并呈剂量依赖性
表 7 穿心莲内酯对人脐静脉内皮细胞 HUVECs 静息期和血管内皮生长因子 (VEGF) 诱导的增殖影响 (n ＝ 15)
** *** 与溶媒组比较， P ＜ 0.01 ； P ＜ 0.001 ；
3.3.2. 穿心莲内酯 (Andro) 对血管内皮生长因子 (VEGF) 诱导人脐静脉内皮细胞 迁 移的影响。
由表 8 可见， 穿心莲内酯于 2.5μM 时， 能够明显性地抑制 VEGF 诱导人脐静脉内皮 细胞的增殖， 并呈剂量依赖性。
表 8 穿心莲提取物对血管生长因子 VEGF 诱导人脐静脉内皮细胞 HUVECs 迁移的影 响 (n ＝ 6)
** *** 与溶媒组比较， P ＜ 0.01 ； P ＜ 0.001 ；
3.3.3. 穿心莲内酯 (Andro) 对血管内皮生长因子 (VEGF) 诱导人脐静脉内皮细胞 管腔形成的影响。
由表 9 可见， 穿心莲内酯于 2.5μM 时， 能够明显性地抑制 VEGF 诱导人脐静脉内皮 细胞的增殖， 并呈剂量依赖性。
表 9 穿心莲内酯对血管生长因子 VEGF 诱导人脐静脉内皮细胞 HUVECs 管腔形成的 影响 (n ＝ 6)
*** 与溶媒组比较， P ＜ 0.001 ；
实施例 4( 穿心莲内酯抗血管新生活性的分子机制实验 )
在确定了穿心莲植物中穿心莲内酯具有较强的抑制血管内皮生长因子 (VEGF) 诱 导的人脐静脉内皮细胞 HUVECs 生长、 迁移和管腔形成的作用， 本发明进一步考察了穿心莲 内酯抗血管新生活性的分子机制
4.1 实验材料 ：
4.1.1 新生儿脐带
由上海国际和平妇婴保健院提供。在无菌条件下， 于健康产妇分娩后立即取新生 胎儿脐带， 长度 20cm 左右， 置于 4℃ HBSS 中， 1 小时内送细胞培养室。
4.1.2 药物
穿心莲内酯是从穿心莲叶中分离提取的单体化合物， 均由上海中医药大学中药研 1 13 究所提供， 其结构主要经 HNMR 和 CNMR 鉴定， 纯度 98％以上 ( 结构如式 1 所示 )。
式 1 穿心莲内酯结构式 4.1.3 试剂 胎牛血清 (FBS)、 M199 培养液、 0.25％胰蛋白酶和促内皮细胞生长添加物 (ECGS)购自美国 Invitrogen 公司。血管内皮生长因子 (VEGF) 购自美国 PeproTech 公司。ERK1/2 磷酸化蛋白、 ERK1/2 总蛋白、 p38 磷酸化蛋白、 p38 总蛋白、 JNK/SAPK 磷酸化蛋白、JNK/SAPK 总蛋白、 VEGFR2 磷酸化蛋白、 VEGFR2 总蛋白、 山羊抗兔二抗和山羊抗鼠二抗均购自 Cell Signaling Technology 公司， 硝酸纤维素膜和预染的标准蛋白分子购自 BioRad 公司， 化学 发光检测系统购自 Amersham Pharmacia Biotech 生物技术公司。实验中所用其它试剂均 为国产分析纯。
4.2 实验方法 ：
4.2.1 蛋白电泳实验方法
贴 壁 的 人 脐 静 脉 内 皮 细 胞 (HUVEC) 换 成 1 ％ FBS 后， 加不同浓度的穿心莲内 酯 6h 后， 加 VEGF(50ng/ml) 作用 5min 后， 收集细胞用裂解液 (50mM Tris(Ph 7.5)， 1mM EDTA， 150mM NaCl， 20mM NaF， 0.5 ％ NP-40， 10 ％ glycerol， 1mM phenylmethylsulfonyl fluoride， 10μg/mL aprotinin， 10μg/mL leupeptin， 10μg/mL pepstatin A) 来 进 行 裂解， 调整成等浓度等体积的样本。将制备好的样本用 SDS-PAGE 胶进行电泳。转膜后上 待检测的一抗， 4 ℃摇床过夜后， 上相应的二抗。ECL 显色后， 用 X 光片曝光成像。为了重 复利用蛋白印记， 我们用 Stripping buffer(62.5mM Tris(Ph 6.7)， 20 ％ SDS and 0.1M 2-mercaptoethanol) 于 50℃水浴 30 分钟， 将上过的一抗去除掉， 再重新上新的一抗。 4.3 实验结果 ：
4.3.1 穿心莲内酯对血管内皮生长因子 (VEGF) 诱导人脐静脉内皮细胞的 MAPK 磷 酸化的影响。
由图 2-4 可见， 穿心莲内酯能够于 10μM 时明显地抑制 VEGF 诱导的 ERK1/2 磷酸 化， 呈剂量依赖性， 同时， 于 5μM 时明显地抑制 VEGF 诱导的 JNK/SAPK 磷酸化， 呈剂量依赖 性但对 VEGF 诱导的 p38 磷酸化无影响。
4.3.2. 穿心莲内酯对血管内皮生长因子 (VEGF) 诱导的 VEGFR2 磷酸化的影响
由图 4 可见， 穿心莲内酯能够于 5μM 时明显地抑制 VEGF 诱导的 VEGFR2 磷酸化， 并呈剂量依赖性。
实施例 5( 穿心莲提取物和穿心莲植物中二萜内酯类化合物抑制血管内皮生长因 子 VEGF 诱导小鼠体内血管新生的药效药理试验。)
通过体外实验发现穿心莲提取物和穿心莲植物中二萜内酯类化合物具有明显的 抑制 VEGF 诱导人脐静脉内皮细胞 HUVECs 生长、 迁移和管腔形成， 进一步首次考察了穿心莲 提取物和穿心莲植物中二萜内酯类化合物抑制血管内皮生长因子 VEGF 诱导小鼠体内血管 新生。
5.1 实验材料 ：
5.1.1 动物
C57 小鼠， 雄性， 6 周龄， 购自上海斯莱克实验动物有限责任公司， 动物合格证号 ： SCXK( 沪 2007-0005)。 小鼠饲养温度 (22±1)℃， 相对湿度 (65±10)％， 照明时间每天 12h。
5.1.2 药物
穿心莲水提物 ： 采用穿心莲叶粗粉， 用 10 倍量水提取三次， 每次 3h， 滤液合并后减 压浓缩至穿心莲生药计浓度 2g/mL， 即得穿心莲水提物。
穿心莲内酯是从穿心莲叶中分离提取的单体化合物， 均由上海中医药大学中药研
究所提供， 其结构主要经 1HNMR 和 13CNMR 鉴定， 纯度 98％以上 ( 结构如式 1 所示 )。
5.1.3 试剂
肝素购自美国 Sigma 公司。Matrigel 购自美国 Invitrogen 公司。血管内皮生长 因子 (VEGF) 购自美国 PeproTech 公司。实验中所用其它试剂均为国产分析纯。
5.2 实验方法 ：
5.2.1 小鼠体内血管新生实验
取 VEGF(10ng/ml)、 肝素 (30U/ml) 和受试药物与冰浴中的 Matrigel 500μl 混匀， 皮下注射于 C57BL/6 小鼠腹中线。7d 后， 断颈处死小鼠， 手术切开腹部皮肤， 取出 Matrigel 种植体， 生理盐水清洗 3 次， 拍照。将 matrigel 冻干， 用 0.1 ％ Trito-X 裂解 1h 后， 离心 14000g， 15min 后， 吸取上清于 405nm 处读值， 根据血红蛋白标准曲线， 测各 Matrigel 中血红 蛋白含量。
5.3 实验结果 ：
5.3.1 穿心莲提取物和穿心莲内酯对血管内皮生长因子 (VEGF) 诱导小鼠体内血 管新生的影响
由表 10 可见， 穿心莲提取物和穿心莲内酯均能够显著性地抑制血管内皮生长因 子 (VEGF) 诱导小鼠体内新生血管量及血红蛋白量， 并呈浓度依赖性。
表 10 穿心莲提取物和穿心莲内酯抑制血管内皮生长因子 (VEGF) 诱导小鼠体内的血管新生
＊ ＊＊ ＊＊＊ 与溶媒组比较， P ＜ 0.05 ； P ＜ 0.01 ； P ＜ 0.001
实施例 6( 流浸膏剂的制备 )
取穿心莲各 500g， 打粉， 用 75 ％乙醇作溶剂， 浸渍 48h， 缓缓渗漉， 收集初漉液 425mL， 另器保存 ； 继续渗漉， 到渗漉液接近无色为止， 收集续漉液， 在 55℃浓缩至稠膏状， 加入初漉液 425mL 混匀， 用 70％乙醇稀释至 500mL， 静置 3d， 滤过， 即得。
实施例 7( 片剂的制备 )
取穿心莲 500g， 打粉， 过 100 目筛。喷入适量 75％乙醇， 加入 17.5％微晶纤维素， 其中内加 7.5％微晶纤维素和 20％淀粉， 制成颗粒， 干燥， 外加 10％微晶纤维素和 1％的硬 脂酸镁， 混匀压片。
实施例 8( 滴丸剂的制备 )
取穿心莲 500g， 打粉， 用 75 ％乙醇回流提取 3 次， 每次 2h， 回收乙醇得浸膏， 以 PGE4000 为基质， 与药物的比例为 1 ∶ 1.5， 二甲基硅油为冷凝剂， 滴制。
实施例 9( 胶囊剂的制备 )
取穿心莲 500g， 打粉， 用乙酸乙酯回流提取 3 次， 每次 2h， 回收乙酸乙酯得浸膏， 干 燥， 粉碎， 过 100 目筛， 加入 5％硬脂酸镁， 混匀装入硬胶囊。