本发明是涉及一种新型抗菌素F-0769及其生产方法和作为家畜家禽生长促进剂、饲料增效剂和抗癌剂的用途。 本发明人为了寻找有用的抗菌素，已经从各种土壤中分离出多种微生物，並且研究了由分离出的微生物来生产抗菌素。结果，他们发现从堆积在日本Kitaamarume-machi，Sakata-shi，Akita-ken的水稻田的土壤中分离出属于链霉菌属的黑紫罗兰链霉菌（Streptomyces Violaceusnigar）F-0769菌株，该菌株在适当的培养基中培养时，就在培养基中聚集起来一种对格兰氏阳性细菌具有很高抗菌活性的抗菌素。这种抗菌素已经被分离出来，並在生理性质和物理化学性质方面与已知的抗菌素相比较后，证实是一种新的抗菌素，並被命名为抗菌素F-0769。
本发明基于这一发现，提供一种新的抗菌素F-0769及其生产方法。该生产方法包括培养能产生抗菌素F-0769，並属于链霉菌属的微生物，也包括从培养产品中分离出抗菌素F-0769。
此外，本发明还提供一种以抗菌素F-0769为有效组分的家畜家禽的生长促进剂和饲料增效剂，以及其促进家畜家禽生长和提高饲料效率的方法，该方法中包括控制抗菌素F-0769供给家畜家禽的有效用量。
再之，本发明还提供一种把抗菌素F-0769作为活性组分的抗癌剂。
现在，本发明将通过优选实施例加以详细叙述。
在附图中，图1是抗菌素F-0769在甲醇中测量的紫外线吸收光谱。
图2是使用溴化钾方法测量的抗菌素F-0769的红外线吸收光谱。
图3是在重质氯仿中测量的抗菌素F-0769的1H-NMR光谱（氢核磁共振光谱）。
图4是在重质氯仿中所测量的抗菌素F-0769地13C-NMR光谱（重碳核磁共振光谱）。
凡是能产生抗菌素F-0769並属于链霉菌属的任何一种微生物，均可以用于生产抗菌素F-0769。
用于本发明微生物的特殊例子，可能提到的有黑紫罗兰链霉菌F-0769菌株，该菌株于1986年2月24日已寄存在日本发酵研究院，寄存号为FERM8663，並于1987年1月28日又将该菌株转移到国际寄存处，寄存号为FERMBP-1264。
天然的或人工的黑紫罗兰链霉菌F-0769菌株的变种，其它属于链霉菌属或任何其它属的微生物，或通过基因操作具有产生抗菌素F-0769能力的改良微生物，只要能产生抗菌素F-0769的都可以用于本发明。
下面为生产本发明抗菌素F-0769菌株的真菌学特性。
本发明所用F-0769菌株为分枝菌丝，在空气中增殖的气生菌丝分裂组成10个或更多个孢子，该孢子是螺旋形的，具有多皱的表面。
从整个细胞的水解产物中，检测到L，L-二氨基庚二酸（Pimelic），但是没有检测到内消旋二氨基庚二酸。检测到作为蔗糖成分的半乳糖，然而没有检测到阿糖、木糖和雪加糖 （madurose）从这些特征看，确定F-0769菌株为放线菌目链霉菌科中的链霉菌属的一种菌株。
黑紫罗兰链霉菌F-0769菌株，具有下列微生物特性。
Ⅰ形态学特性
培养基菌丝体发展很快，並产生分枝，每个菌丝体的直径大约为1.5×1.0μm。培养物的表面肿胀，常形成皱纹。菌丝体令人满意地粘着在几种培养基上，例如，酵母-淀粉琼脂培养基、酵母-麦芽琼脂培养基或蔗糖-硝酸盐琼脂培养基。气生菌丝体发展很快，分裂的孢子的前端为平均4或5次旋转的螺旋形，並构成孢子链，但是在孢子链中，相邻孢子之间的界面不是十分明显的，没有观察到孢子囊、菌核或孢梗束。
Ⅱ培养特性
根据由E.B.Shirling等人所报道〔国际系统细菌学杂志，16，313-340（1966）〕的试验方法进行试验，此外也应用已知的培养基和试验方法。
在氙灯的标准光源下，使用1958年作为颜色标准的颜色调合手册（Color Harmony Manual），第4版，来测定颜色。当找到相应的颜色卡片时，就用通常的名称表示在前面，並将色卡的编码表示在括号内。
如果没有其它说明，下列数据是表示在琼脂板培养基上，于28℃的温度下培养三周的生长状况。
（1）蔗糖-硝酸盐培养基（Difco-Czapeck′s溶液琼脂）。
生长良好，浅象牙-蛋壳色到芥金黄色-暗金黄色，竹麂皮色（2ca-2ne，2gc）。气生菌丝体轻微粘着，没有观察到可溶性色素。
（2）葡萄糖-天冬酰胺培养基
菌株生长良好並蔓延。浅小麦色-浅玉米色到竹麂皮色（2ea-2gc）。气生菌丝体轻微粘着並呈米色，没有观察到可溶性色素。
（3）甘油-天冬酰胺培养基（ISP-5，Difco）
生长不好，呈浅象牙-蛋壳色，没有气生菌丝体粘着，也没有观察到可溶性色素。
（4）淀粉琼脂培养基（ISP-4，Difco，无机盐-淀粉琼脂）
起初生长良好，但是逐渐变坏。浅象牙-蛋壳色。气生菌丝体粘着良好，呈暗色（接近灰色10fe），没有观察到可溶性色素。
（5）酪氨酸琼脂培养基（ISP-7，Difco，酪氨酸琼脂）
菌株生长良好並蔓延，暗褐灰色（2gc）到黑色。气生菌丝体生长很好，呈粉状。瓜黄色（3ga）。没有观察到可溶性色素。
（6）营养素琼脂培养基
生长不好，气生菌丝体基本上不生长，没有观察到可溶性色素。
（7）酵母-麦芽浸出液琼脂培养基（ISP-2，Difco，酵母-麦芽浸出液琼脂）
菌株生长很好並在蔓延。芥色-暗金黄色（2le）到黄玉-苏格兰黄油色（3ne），没有观察到可溶性色素。
（8）燕麦糖培养基（ISP-3，Difco）
菌株生长很好並蔓延，米灰-鼠色（接近于灰色3ih）。可溶性色素是淡黄色。
（9）酵母-淀粉琼脂培养基
生长良好，培养物肿胀並蔓延，黄金瓜-亮金黄色（2ic）。气生菌丝体生长很好，呈黑梅色，没有观察到可溶性色素。
Ⅲ生理特性
（1）生长温度范围（酵母-淀粉琼脂培养，PH在消毒灭菌之前为7.2，采用一个温度梯度式恒温培菌箱，生长在第二周内开始）：最适宜温度为30℃-33.2℃，可生长温度为12-38.5℃
（2）明胶的液化作用（葡萄糖-胨-明胶针刺培养物）：阳性
（3）脱脂奶的凝结和胨化作用（Difco，28℃和37℃脱脂奶）：
在28℃胨化：阳性;凝结：阴性
在37℃胨化：阳性;凝结：阴性
（4）密胺的生成
酪氨酸琼脂培养基：阴性
生成密胺培养基：阴性（一周后，略微呈阳性）
胨-酵母-铁琼脂培养基：阴性
胰蛋白胨（Triptone）-酵母浸出液肉汤培养基：阴性
（5）腺嘌呤、黄嘌呤、次黄嘌呤，酪氨酸的溶解性：
次黄嘌呤、酪氨酸：阳性
腺嘌呤：略微显阳性
黄嘌呤：阴性
（6）氯化钠耐药量（酵母-淀粉琼脂培养基+氯化钠）：生长最高达4%（在7%时不生长）
（7）碳源的利用（Difco，碳利用琼脂培养基，于28℃第二周内）
阳性：D-葡萄糖、D-木糖、D-果糖、蔗糖、i-肌醇、L-鼠季糖（L-rhamunose）、棉子糖、D-甘露糖醇、L-阿糖、水杨苷
阴性：没有
由于本菌株与黑紫罗兰链霉菌（Waksman and Curtis） Waksman和Henrici很相符合，其中孢子链是螺旋形的，孢子表面是多皱的;在一些培养基中，在整个培养期间，气生菌丝体的一部分转变成湿黑点;氯化钠耐药量为4%到小于7%;並且利用所有碳源，因此确定本菌种是属于黑紫罗兰链霉菌的一种菌株。並把本菌株命名为黑紫罗兰链霉菌F-0769。
本发明的抗菌素F-0769可以由含有营养素的培养基中培养黑紫罗兰链霉菌F-0769菌株而产生，其中的营养素通常使用放线菌。例如，作为碳源可以使用葡萄糖、甘油、蔗糖、糊精、淀粉等。作为氮源可以采用大豆粉、小麦胚胎、胨、肉浸出液、酵母浸出液、玉米浸渍液、一种铵盐等。此外，如果需要，如碳酸钙、氯化钾、硫酸镁和各种磷酸盐之类的无机盐均可使用。
作为一种培养方法来看，一种液体培养体是适宜的，在选择培养条件，如培养温度和培养时间等方面，要使所选择的条件适合于所用微生物的生长，並有利于以最大的产量来生产抗菌素。当使用曝气搅动进行培养时，培养时间为92到144小时，培养温度从25℃到35℃时，生产的抗菌素能达到最大产量。
产生和聚集在培养基中的抗菌素F-0769可以从培养基中分离出来，並可以采用一般方法进行提纯。例如，利用抗菌素和杂质之间溶解性不同的溶解提纯法和利用二者之间吸附作用不同的吸附提纯法，並且这两种方法可以单独使用或联合起来使用，或者重复地使用。
所产抗菌素F-0769的定量分析和活性部分的测定，是通过琼脂板的方法，使用枯草杆菌ATCC6633菌株作为试验微生物来进行的。分离和提纯抗菌素F-0769的典型例子如下
抗菌素F-0769存在于培养基和微生物的细胞中。利用抗菌素在有机溶剂中的溶解性，能够用乙酸乙酯、乙酸丁酯、氯仿等，从培养基中提取出来。用含水丙酮可以从微生物的细胞中把它提取出来，然后在减压下蒸出有机溶剂，再从剩余的水溶液中用乙酸乙酯提取，把这两种提取液放在一起，然后在减压下浓缩而获得粗的抗菌素F-0769的提取液。
再通过吸附色谱法，如氧化铝或氧化硅色谱柱法提纯粗产品。收集、浓缩和干燥活性馏分;从而得到较高纯度的抗菌素F-0769。
通过凝胶渗透色谱法，采用交联葡聚糖凝胶（Sephadex）LH-20（由Pharmacia公司制造），对产品进一步提纯，浓缩和干燥活性馏分而得到具有更高纯度的粉末抗菌素F-0769。
如此得到的本发明抗菌素F-0769，具有下列物理化学特性和生物特性
（1）外观：白色或浅黄色粉末，
（2）溶点：245-250℃，
（3）旋光率：〔α〕25D＝-37.5℃（C＝1，甲醇），
（4）溶剂中的溶解性：可溶于甲醇、乙醇、丙酮、氯仿、乙酸乙酯和苯等，但是不溶于水和己烷中。
（5）元素分析（%）：
C：57.53，H：7.36，O：21.17，N：12.97
（6）紫外线吸收光谱（在甲醇中测定）：如图1所示，λ最大（E1%1Cm）＝213nm（466），286nm（200）
（7）红外线吸收光谱（用溴化钾方法测定）：如图2所示。
（8）核磁共振光谱（在重质氯仿中测定）：1H-NMR光谱如图3所示，13C-NMR光谱如图4所示，
（9）碱性、酸性和中性之间的鉴别：是中性物质，
（10）氨基酸分析：对用浓度为6N的盐酸在110℃下水解18小时的产物进行分析，检测到几种氨基酸，即苏氨酸、缬氨酸和亮氨酸，
（11）颜色反应：
在碘反应和高锰酸钾反应中显阳性，
在水合茚三酮反应和氯化铁反应中显阴性
（12）薄层色谱法（用硅胶法，Art·5715，由Merck公司制造）
溶剂体系 参考值
乙酸乙酯 0.16
乙酸乙酯-甲醇（5∶1） 0.33
氯仿-甲醇（10∶1） 0.68
乙酸乙酯-丙酮（1∶1） 0.08
丙酮-苯（5∶1） 0.40
（13）分子量（用Rast方法测定）：大约745
（14）抗菌活性：
抗菌活性如表1所示
抗菌活性是由琼脂稀释法测定
表1
最小抑
试验微生物 （μg/ml）
制浓度
金黄色酿脓葡萄球菌FDA209PJC-2 0.78
TeraJima金黄色酿脓葡萄球菌 0.78
金黄色酿脓葡萄球菌MS353 0.78
库克白色酿脓链球菌 0.78
藤黄细球菌ATCC9413 0.78
枯草杆菌ATCC6633 0.2
大肠杆菌NIHJ JC-2 ＞100
伤寒杆菌 ＞100
粘质沙雷氏菌IAM1184 ＞100
奇异变形杆菌IFO3849 ＞100
泄殖腔肠杆菌963（Enterobacter ＞100
Cloacae）
绿脓杆菌IFO3445 ＞100
白色念珠菌 ＞100
稻瘟梨形孢菌素（Piricularia Oryzae） ＞100
马里格链孢菌 ＞100
锥蝇属菌（Cochliobolus miyabeanus） ＞100
产气荚膜梭状芽胞杆菌B103-252 1.56
表1（续）
最小抑
试验微生物 （μg/ml）
制浓度
顽固梭状芽胞杆菌V-6 1.56
普雷沃氏胨球菌V-72 1.56
念球形真细菌V-45 1.56
粘连真细菌0612 1.56
fragilis杆菌GM-7000 ＞100
（Bacteroides fragilis）
极小韦永氏球菌0574 ＞100
Varium梭形杆菌B-1083 ＞100
抗菌素F-0769对格兰氏阳性细菌呈现高的抗菌活性。
本发明的抗菌素F-0769被认为是属于通常的肽抗菌素总纲，但是在物理化学性质和生物性质，如紫外线吸收光谱，红外线吸收光谱及氨基酸分析等方面与已知物质相比，没有一个已知物质与本发明的物质相一致，更特别的是没有一个其它的肽类抗菌素在213nm和286nm处显示紫外线吸收，这正是本发明物质的一种特征。抗菌素1415〔Nature，187（4742），1029-1030（1960）〕或抗菌素NRC-501〔Mikrobiol，16，337-343（1976）〕是可以被提及的显示类似吸收的物质，但是，这些抗菌素中的每一个，在氨基酸成分方面，都不同于本发明的抗菌素物质，因此，确定本发明的物质为一种新型抗菌素。
由于抗菌素F-0769对格兰氏阳性细菌有特别强的抗菌效果，所以可期望将它用作抗菌剂或饲料添加剂，特别是可用它作为家畜家禽生长发育的促进剂和饲料增效剂，其中包括以抗菌素F-0769作为有效组分，以及促进家畜家禽生长发育和提高饲料效率的方法，其中还包括控制抗菌素F-0769供给家畜家禽的有效用量。
此外，抗菌素F-0769还具有抗癌活性，可以期望成为有用的抗癌剂。
现在，本发明将在有关实施例中进一步予以详细说明，但是，应该理解到本发明决不是只限于这些特殊实施例。
实施例（生产）
作为一个接种培养基，使用的培养肉汤液（Culture broth）（PH在消毒灭菌以前为7.8）含有1%的葡萄糖，3%的淀粉，0.1%的肉浸出液，0.4%的啤酒酵母，0.2%的氯化钠，2.5%的大豆粉和0.1%的碳酸钙。
把70毫升接种培养基导入每个500毫升容量的锥形烧瓶中（Erlenmeyer flasks），再把黑紫罗兰链霉菌F-0769菌株（FERM BP-1264）移种到每一个锥形烧瓶中，在振荡下于28℃培养48小时。
然后把一升这种接种培养肉汤液，移植到含有100升为了生产的培养基的罐中。
生产用培养基的组成含有1.5%的葡萄糖、4.5%的淀粉、0.1%的肉浸出液、0.4%的啤酒酵母、0.2%的氯化钠、2.5%的大豆粉、0.1%的碳酸钙、0.05%含6个结晶水的氯化钴（Cocl2·6H2O）、0.05%含7个结晶水的硫酸铁（FeSO4·7H2O）和0.2%的消泡剂CA-123（由日本油脂公司制造）（消毒灭菌之前的PH为7.0）。培养是在搅拌和充气下于30℃进行96小时，充气速度每分钟为100升，搅拌器的转速为200转/分。
培养完成后，把培养肉汤液的PH调到8.0，加入4%的硅藻土作为助滤剂后，进行过滤，分离出滤液和细菌的细胞物。再将100升90%的丙酮水加入到细胞物中並搅拌1小时后，过滤该混合物，在减压下蒸出丙酮，得到10升水溶液。把这种水溶液与培养过滤液合并，再用50升乙酸乙酯萃取二次，浓缩该乙酸乙酯萃取液，浓缩物再被吸附在氧化铝柱子上（5.5厘米直径×10厘米），预先用乙酸乙酯处理，然后再用甲醇展开以此洗脱活性馏分。收集活性馏分並在减压下浓缩，蒸出甲醇，从而得到大约75克油状物质。
然后把这种油状物质溶解在少量氯仿中，並吸附在用氯仿填充的硅胶柱子上，再用氯仿-甲醇（100∶3）的溶剂混合物展开，在减压下浓缩活性馏分，经干燥而得到12克抗菌素F-0769的粗粉末。
把这12克粗粉末溶解在少量乙酸乙酯中，吸附在用乙酸乙酯填充的硅胶柱子上，然后用乙酸乙酯展开，在减压下浓缩活性馏分，並经干燥而得到3.3克粗粉状抗菌素F-0769。
把得到的3.3克粗粉溶解在甲醇中，通过用甲醇填充的交联葡萄糖（Sephadex）LH-20柱子进行凝胶渗透。浓缩活性馏分，並干燥而得到2.7克白色或浅黄色粉状抗菌素F-0769（溶点为245～250℃）。
配方实施例（饲料添加剂）（additive）
抗菌素F-0769 1%
玉米淀粉 99%
将两种物料进行精细粉碎，均匀混合得到含有1%的抗菌素F-0769的预混合物。
试验实施例1：（鸡的饲料效率试验）
试验试剂和饲料：
抗菌素F-0769分别以0、10或20ppm的用量与精细配合的小鸡饲料均匀混合（由Oriental酵母公司制造）。
使用的小鸡：
每组10只Shever-Star-Bro肉用雌鸡，用上述饲料自由喂养8周，测量鸡的重量和饲料摄取量，结果列入表2。
结果发现，通过添加抗菌素F-0769的饲料喂养后的鸡，饲料需求指数提高了3～4%，重量增加了5～6%。
试验实施例2：（猪的饲料效率试验）
所用的猪：陆地属种（Land race Species）
基本饲料：
（a）从试验开始到四周后的基本饲料为60%的谷物（玉米、小麦、大麦），15%的大豆饼，15%基底动物饲料（脱脂奶粉，鱼粉）和10%的其他成分（酶、碳酸钙、磷酸钾、氯化钠等）。
（b）从四周到12周
78%的谷物（玉米、miro、小麦），13%的大豆饼，5%的鱼粉和4%的其他成分（碳酸钙、磷酸钙、氯化钠等）。
方法：
把平均为35天的三十只小猪分成三组，每组10只，所以平均重量应大体相等。把抗菌素F-0769以0，5和10ppm的用量分别加到基本饲料中，然后三组猪用这种饲料分别喂养12周，再称猪的重量和测量摄取的饲料，结果表示在表3中。
结果发现，由于把抗菌素F-0769加到饲料中去，使饲料需求指数提高了4～6%，重量增加了5～8%。
试验实施例3：反刍动物饲料效率
使用的菜牛：Holstein
浓缩饲料：
71.5%的谷类（玉米、miro、大麦），11.5%的切细了的稻草和麸（玉米麸、麦麸、米糠、油饼），5.5%的植物油饼（豆饼、亚麻油饼），和11.5%的其他成分（alphalpha麦片、糖密、磷酸钙、氯化钠）
方法：
把15头8个月的阉割的Holstein菜牛分成三组，每组5头，所以平均重量大体相等。把抗菌素F-0769以0、7.5和15ppm的用量分别加到基本浓缩饲料中，用这种饲料分别喂养三组菜牛，再用干稻草作为粗饲料以每头菜牛1公斤的用量喂养，结果列于表4中。
结果发现，通过把抗菌素F-0769加到饲料中，使饲料需求指数提高了4～6%，重量增加了7～8%。
从前面所述的实施例来看，本发明的抗菌素F-0769，可望成为有用的饲料添加剂。
作为饲料增效剂的抗菌素F-0769的浓度，随着家畜家禽的种类和年令或喂料的季节或选择的时间而变化，然而，通常在1～200ppm的范围内，更好的是在2～100ppm的范围内。
抗菌素可以直接混到饲料中，也可以与载体饲料或辅助料配成适当形式以后加入，此外，也可以掺入饲料水中给予。
与家畜或家禽种类有关时，可以与其他试剂相结合使用，例如，与其他抗菌素如盐霉素、莫能霉素或垃沙里菌素相结合，这些菌素被称为家禽抗球蟲病治剂。
此外，也可与其它抗菌剂或激素、或与其它具有增加饲料效率作用的天然物质，它们的提取物、抗菌素或合成化合物合并使用。
试验实施例4：抗癌活性
把抗菌素F-0769在内腹膜处给予染有P388癌细胞的患有癌症的老鼠（BDF1鼠），检查抗癌活性，结果发现，抗菌素在剂量为0.08毫克/公斤到1.25毫克/公斤的范围内显示出显著的抗癌活性。
在被处理的组的生存天数与未经处理的组的生存天数之比（也就是T/C%）至少是130%的情况下的基础上进行评价，测定其效率，结果示于表5中
表5
F-0769的剂量
T/C（%） 评价
（毫克/公斤）
1.25 133 有效
0.625 133 有效
0.313 133 有效
0.156 133 有效
0.080 133 有效
从上面结果来看，可望抗菌素F-0769成为有用的抗癌剂。
试验实施例5：急性毒性
试验中采用了JCL/ICR雄性鼠（5周大小，体重21～23克），通过观察在给药后两周的试验鼠的生存或死亡的情况，来测量急性毒性。LD50约为20毫克/公斤（内腹膜处给药）
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说明书 8 倒3 0.08 0.31