GRP94与人类免疫球蛋白G的复合体.pdf

描述了将“热激蛋白”(HSP)“葡萄糖调节蛋白”94(Grp94)与人类非免疫性免疫球蛋白G孵育后在体外形成的复合体。结果显示，Grp94-IgG的复合体对变性剂具有抗性。此外，复合体展示重要的细胞因子样性质，可开发此性质以在特征为降低的或加剧的免疫应答的病变中诱导免疫调节的正效应。另外，Grp94-IgG复合体的稳定性使得它们适于用作在各种病理疾患中检测针对Grp94的抗体的诊断工具。

1.  Grp94与人类非免疫性IgG的复合体，其特征在于：
-显示Grp94和IgG之间在IgG上的抗原结合位点之外的位点的稳定结合；
-对变性条件具有抗性；
-使用完整IgG分子在甘油梯度(10％至40％)上测量时具有高于300kDa的质量。

2.  如权利要求1所述的Grp94与人类非免疫性IgG的复合体，其中Grp94是哺乳动物天然蛋白或其重组蛋白或片段或模拟物。

3.  如权利要求1和2所述的Grp94与人类非免疫性IgG的复合体，其中IgG是完整的分子或其片段(Fab或Fc部分)。

4.  如权利要求1所述的Grp94与人类非免疫性IgG的复合体，其中所述复合体的质量是在300和350kDa之间。

5.  如权利要求1所述的Grp94与人类非免疫性IgG的复合体，其中Grp94和IgG之间的摩尔比是0.5至1.0。

6.  如权利要求5所述的Grp94与人类非免疫性IgG的复合体，其中Grp94和IgG之间的摩尔比是1∶1。

7.  如权利要求1所述的Grp94与人类非免疫性IgG的复合体，其中：
-所述复合体是通过将Grp94与人类非免疫性IgG以包括在0.5和1.0之间的摩尔比孵育获得的；
-所述孵育在30℃和40℃之间的温度下在水性溶剂中进行至少1h，所述水性溶剂任选地缓冲为6.5和7.4之间的pH。

8.  如权利要求7所述的Grp94与人类非免疫性IgG的复合体，其中所述复合体是通过将Grp94与人类非免疫性IgG以1∶1的摩尔比在37℃的温度下孵育获得的。

9.  如权利要求1-8中任一项所述的Grp94与人类非免疫性IgG的复合体，其用作免疫刺激物和/或免疫佐剂。

10.  如权利要求9所述的Grp94与人类非免疫性IgG的复合体，其用作特征为免疫应答缺陷的病变中的免疫刺激物。

11.  如权利要求10所述的Grp94与人类非免疫性IgG的复合体，其中所述病变是肿瘤、传染性疾病和特征为各种病因学的免疫系统抑制的其他病变。

12.  如权利要求9所述的Grp94与人类非免疫性IgG的复合体，其用作特征为加剧的免疫应答的病变中的免疫佐剂。

13.  如权利要求12所述的Grp94与人类非免疫性IgG的复合体，其中所述病变是自身免疫疾病。

14.  组合物，其包含与药学可接受的添加剂和载体组合的如权利要求1-8中任一项所述的Grp94与人类非免疫性IgG的复合体，适于全身和/或局部施用，以及在合适的控制释放递送系统中。

15.  一种用于通过分离选自淋巴细胞、抗原呈递细胞、树突细胞的免疫系统的细胞来调节活体外实验中的免疫应答的方法，该方法包括将所分离的细胞与如权利要求1-8所述的Grp94-IgG复合体孵育至少1h。

16.  如权利要求15所述的方法，其中所述分离的细胞是在与Grp94-IgG复合体共孵育之前基于特定的抗原和/或特定的膜标志物选择的细胞亚群。

17.  如权利要求15和16所述的方法，其中所述细胞以200万/ml的浓度与浓度在10ng/ml和10μg/ml之间的复合体共孵育。

18.  一种用于检测抗Grp94抗体和/或抗Grp94-IgG复合体抗体的存在的方法，其特征在于使用如权利要求1-8所述的Grp94-IgG复合体。

19.  如权利要求18所述的方法，其中所述抗体的存在是检测炎性疾患和/或与改变的免疫应答相关的组织损伤的标志。

20.  如权利要求18-19所述的方法，其中所述Grp94-IgG复合体连接至合适的阵列基质，且使任选地标记的血浆样品或血浆纯化的IgG级分与所述预先连接于基质的Grp94-IgG复合体接触。

21.  如权利要求20所述的方法，其中与Grp94-IgG复合体结合的被标记的IgG的量是通过检测所述标记测量的。

22.  如权利要求18-21中任一项所述的方法，其中所述抗体是抗Grp94独特型抗体。

23.  如权利要求18-21中任一项所述的方法，其中所述抗体针对Grp94-IgG复合体，并且具有独特型抗体和抗独特型抗体二者。

24.  用于如权利要求18-23所述的方法的检测和定量测量血浆抗Grp94抗体和抗Grp94-IgG复合体抗体的诊断试剂盒，其在一个或多个容器中至少包含：a)固定于合适阵列基质的任选地标记的Grp94-IgG复合体；b)于溶液中或固定于合适阵列基质的任选地标记的变性的Grp94；c)任选地标记的测试抗Grp94抗体；d)对照血浆/血清或血浆纯化的IgG级分；e)用于标记血浆蛋白质的试剂；f)使用说明。

Grp94与人类免疫球蛋白G的复合体
发明领域
本发明涉及在Grp94(“葡萄糖调节蛋白”94)和人类IgG之间形成的新型复合体及其诊断和治疗用途。
背景技术
寻找糖尿病中符合血管损伤的有用生物标志物的标准的分子(因此成为引起开放血管病理的早期和稳定变化的指示剂)导致在1型糖尿病受治疗者的血浆中发现一些“热激蛋白”(HSP)(HSP90、HSP70和Grp94)，其中Grp94证明是最具代表性的。该研究是在从十名具有持续至少10年的糖尿病的1型糖尿病受治疗者中获得的混合血浆中进行的。观察到Grp94完全导致了糖尿病患者血浆中存在的丝氨酸样蛋白酶活性显著高于正常(非糖尿病)受实验者的血浆的丝氨酸样蛋白酶活性(Pagetta等人Diabetologia，2003；46：996-1006)。此外，从糖尿病患者血浆中纯化的Grp94显示与从细胞中纯化的天然Grp94的结构和功能性质不同(Pagetta等人Diabetologia，2003，引用参考文献)。因此，不仅使得血浆Grp94具有高于天然对等物的蛋白酶活性(Menoret等人J.Biol.Chem.，2001；276：33313-33318)，而且其甚至在结构上也是不同的，如伴刀豆球蛋白A琼脂糖凝胶(Con-A Sepharose)柱上进行的亲和层析所揭示的。不过，该研究的最令人感兴趣的结果是发现HSP以升高的浓度存在于血浆中。事实上，HSP是专有的细胞内蛋白质，其主要功能是陪伴天然蛋白质以赋予他们正确的折叠(Pelham H.R.B.Cell，1986；46：959-961；Spiess C.等人Cell，1999；97：339-347；Lee A.S.Trends Biochem.Sci.，2001；26：504-510)。这一性质与位于HSP的N-末端区域和C-末端区域两种区域的特定结构决定簇密切相关，结构决定簇根据它们的疏水性质影响与肽和蛋白质的结合。
已知HSP的胞外释放是作为改变的细胞膜通透性和/或细胞坏死的结果发生，决定着表征伴随自身免疫疾病发展的炎性和免疫过程(Finotti P.和Pagetta A.Biochem.Biophys.Res.Commun.，2004；315：297-305)。HSP的非生理性胞外定位赋予它们细胞因子样、炎性和免疫原性质，特征为强烈的体液和细胞两种免疫应答(Asea A.等人J.Biol.Chem.，2002；277：15028-15034)。这一性质是通过HSP与IgG的复合体也存在于糖尿病受治疗者的血浆中的发现被间接证实的(Pagetta A.等人2003，引用参考文献；Finotti P.等人2004，引用参考文献)。具体而言，观察到Grp94和HSP70二者形成高分子量同型和异型复合体，异型复合体还含有白蛋白和α1-抗胰蛋白酶(Finotti P.等人2004，引用参考文献)。显示Grp94能够不可逆地连接IgG亚基(如免疫沉淀实验所证实的)的其它观察(Finotti P.等人2004，引用参考文献)，确证了HSP与循环蛋白质的不可逆结合导致形成融合蛋白，进而融合蛋白可能导致触发免疫应答而形成自身抗体的假设。不过，虽然HSP与白蛋白的结合可能被认为是“非特异性”的-鉴于白蛋白的升高的血浆浓度和众所周知的其可逆结合许多不同血浆蛋白质的能力-HSP(主要是Grp94)与IgG的超级分子聚集体提出了这些复合体在本质上具有免疫性的可能。事实上，不仅单独的Grp94并且在与IgG和α1-抗胰蛋白酶的稳定复合体中的Grp94可获得免疫原的特性，能够刺激针对Grp94和复合体本身的抗体(Ab)的产生。这一解释得到文献中几项报告的确证，其显示在炎性和免疫性疾病诸如原发性高血压和动脉硬化中，一些HSP的血浆浓度是增加的(Xu Q.Thromb.Vasc.Biol.2002；22：1547-1559)。这一间接发现证实，一旦HSP暴露于胞外后，就充当免疫原(Finotti P.Curr.DiabetesRev.2006；2：295-305)。还考虑了HSP与IgG亚基和α1-抗胰蛋白酶二者的稳定复合体不是在血浆中形成而是由于改变的膜的通透性和/或细胞坏死而从细胞中释放的可能性。事实上，已知HSP70和Grp94二者特异性地参与IgG链进入专门的细胞(免疫细胞)的装配，IgG分子仅在它们的亚基正确装配后才可从所述细胞分泌(Melnick J.等人J.Biol.Chem.，1992；267：21303-21306)。因此，由于HSP的主要功能是陪伴蛋白，以下假设是合理的：一旦HSP释放到循环中以后，就变得具有免疫原性，不仅是因为它们自身的结构性质，而且主要是因为它们能够与其他肽/蛋白形成稳定的不可逆的复合体(Pagetta A.等人2003，引用参考文献；Finotti P.等人2004，引用参考文献；Finotti P.2006，引用参考文献)。
对其它糖尿病受治疗者的血浆进行的实验证实并扩展了先前的结果，显示Grp94实际上充当能够在任何受治疗者中刺激初级(独特型)抗Grp94Ab的发展的共有免疫原，所述抗Grp94 Ab还展示丝氨酸样催化活性，因此被认为是催化性Ab。不过，抗Grp94 Ab的催化活性仅在与Grp94的复合体经历解聚时才显现，而完整的复合体是无催化活性的；这是因为以下事实：在与免疫性和非免疫性IgG二者的超级分子复合体中，催化位点被掩蔽了(Pagetta A.等人Mol.Immunol.，2007；44：2870-2883)。Grp94与独特型Ab的复合体的纯化是通过G蛋白亲和层析的方法获得的。但是将初级免疫原即Grp94从复合体中分离和纯化出来证明在技术上是不可能的，这是由于以下事实：在分析的任何血浆(单一的和混合的两种)中，Grp94保持与IgG的顽固结合，无论IgG是完整的还是片段的(Fab和/或Fab₂)。
考虑到循环复合体中Grp94和独特型Ab二者的结构和功能特性，提出了这些复合体参与糖尿病相关的血管变化的发展和进展的假设。

概述
在于体外再现体内存在的条件，即为了获得与从糖尿病受治疗者的血浆中纯化的复合体相似的形式的尝试中，发明人发现Grp94-IgG复合体也可在体外形成，并且它们显著不同于天然的免疫复合体。具体而言，体外获得的Grp94-IgG复合体显示以下结构和生物性质：
1)Grp94在IgG分子上的抗原结合位点(Fab)之外的位点稳定结合人类IgG；
2)复合体对变性操作诸如煮沸和还原剂具有抗性；
3)复合体具有高于300kDa的质量，包含300至350kDa，如甘油密度梯度离心的实验(10％至40％的梯度)所证实的；
4)复合体显示细胞因子样免疫刺激活性，但是没有任何丝氨酸样催化活性。
因此，本发明的第一个目标是Grp94与人类非免疫性IgG的复合体，其特征在于：
-Grp94和IgG之间在IgG上的抗原结合位点之外的位点的稳定、不可逆结合；
-对变性条件的抗性；
-在甘油梯度(10％至40％)上测量时高于300kDa的质量。
非抗原结合位点意指在IgG的铰链区存在的并牵涉Fc、Fab或二者的近端部分的位点。然而，在另一方面，本发明的目标也是这些Grp94-IgG复合体作为免疫调节剂(即，免疫刺激物或免疫佐剂)用于治疗其中需要刺激或抑制免疫应答的病变的用途。需要刺激免疫应答的病变涉及其中免疫应答证明不足的疾患(例如，在肿瘤中)，而需要抑制免疫应答的病变涉及其中免疫应答反而被加剧的自身免疫疾病。
本发明的进一步目标是这些复合体作为诊断工具的用途和在活体外调节免疫应答的方法。

附图简述
图1.该图显示用不同实验步骤(详细描述于实验部分)证明的Grp94和IgG之间的复合体的形成：(A)在Immobilon膜上进行的天然Grp94(2μg，10μl)的斑点印迹，Immobilon膜预先在甲醇中浸泡(1min)、用蒸馏水漂洗(1min)并干燥3min。(B)在于伴刀豆球蛋白A琼脂糖凝胶柱上进行的最后纯化步骤之后，在存在和不存在人类非免疫性IgG(与Grp94的摩尔比为1∶1)两种情况下，在37℃下孵育1-h后，对天然Grp94进行的SDS-PAGE以及用抗Grp94单克隆Ab和抗人类IgG多克隆Ab(来自绵羊)对天然Grp94进行的蛋白质印迹。(C)在存在和不存在人类非免疫性IgG(摩尔比为1∶1)于37℃孵育1h后，Grp94(100μg)的甘油密度梯度(10％至40％)分部离心。
图2.该图显示单独的Grp94和与IgG复合的Grp94对人类脐静脉内皮细胞(HUVEC)的细胞生长和血管生成分化的效应。(A)柱状图代表在不存在(对照)和存在单独的Grp94(1和10ng/ml)和与IgG复合的Grp94(1和10ng/ml)的两种情况下孵育细胞后计数的细胞数量的平均值(±SEM，至少三次不同实验)。(B)柱状图代表按(A)中条件并添加MEK(促分裂原活化蛋白激酶激酶)抑制剂U0126(10μM，终浓度)孵育之后计数的细胞数量的平均值(±SEM，至少三次不同实验)。(C)光学显微镜下拍摄的照片，显示用单独的Grp94(10ng/ml)和与IgG复合的Grp94(10ng/ml)、在有和无U0126抑制剂的情况下处理后，HUVEC的血管生成转化。
图3.该图显示用单独的Grp94和与IgG复合的Grp94处理后HUVEC中HSP90和HSP70二者的表达。(A)用单独的Grp94(10ng/ml)和与IgG复合的Grp94(10ng/ml)、在不存在和存在抑制剂U0126(10μM，终浓度)的情况下处理后，全细胞溶解产物的SDS-PAGE(10％丙烯酰胺凝胶)和用抗HSP90抗体、抗HSP70抗体和抗人类IgG抗体的蛋白质印迹。左侧的箭头标示还与右侧的邻近泳道共有的条带。蛋白质印迹是在不同时间对相同样品进行的其它三种分析的代表。(B)从与(A)中描述的实验中使用的相同的细胞培养物中收获的条件培养基的SDS-PAGE(10％丙烯酰胺凝胶)和用抗HSP90抗体、抗HSP70抗体和抗人类IgG抗体的蛋白质印迹(同上文的全细胞溶解产物)。
图4.该图显示用单独的Grp94和与IgG复合的Grp94处理细胞后HSP90和HSP70介导的HUVEC的结构变化。(A)显示对照和处理的细胞二者中使用抗HSP90Ab在共聚焦显微术下显现的绿色荧光(左侧的图a、b、c)。(B)用抗HSP70Ab处理后由于HSP70引起的绿色荧光(如对HSP90那样)。
图5.该图显示在单独的Grp94和与IgG复合的Grp94存在下人类外周血单核细胞(PBMC)的生长刺激。
图6.该图显示在具有单独的Grp94和与IgG复合的Grp94的培养物中来自PBMC的IgG产生的刺激。
发明详述
本实验旨在获得体外Grp94-IgG复合体的形成，这源于必须在简化实验模型中再现在糖尿病患者血浆纯化的活体外实验中存在的天然免疫复合体的复合条件。如果与体内存在的在Grp94和IgG之间形成的那些复合体相似的复合体也可在体外形成，那么就可能详细研究单个的和组合在一起的Grp94和IgG展示它们对HUVEC效应的机制，HUVEC充当内皮血管细胞的模型。然而，影响Grp94和IgG复合体的形成的体外条件和体内条件之间明显存在显著差异。差异为：
1)体外实验中使用的Grp94是从大鼠肝细胞的微粒体部分获得的。虽然大鼠Grp94中的抗原位点与人类天然Grp94的抗原位点类似(抗Grp94Ab识别人类血浆和大鼠Grp94二者)，但是预期大鼠Grp94与糖尿病受治疗者的血浆中存在的Grp94有部分差异(Pagetta A.等人2003，引用参考文献)；
2)体外实验中使用的人类IgG在本质上是非免疫性的(是从正常受实验者的血浆库中获得的)。
另外，实验的结果显示：
3)体外获得的Grp94-IgG复合体是在两种反应物孵育相对短的时间之后形成的；这表明Grp94和IgG二者上的位点在导致稳定键的形成的化学反应中迅速与彼此反应；
4)最初，结合可能仍是可逆的，而体内则很少(或者甚至从不)发生可逆性，因为在天然复合体中Grp94几乎不可能从IgG解离；
5)体外实验中的结合特性依赖于与体内存在的变量具有显著差异的不同的变量，诸如尤其是反应物浓度、孵育时间和温度。
通过将天然或重组哺乳动物Grp94与人类非免疫性IgG以包括0.5和1.0之间的摩尔比(Grp94比IgG，M∶M)、优选地以摩尔比1∶1，在30和40℃之间的温度下、优选地在37℃下，在任选地缓冲的水性溶剂(pH在6.5和7.4之间)中共孵育至少1h获得Grp94-IgG复合体即本发明的目标。
就所关注的本发明目标而言，Grp94是哺乳动物蛋白P14625(SwissProt& Tremble数据库中的蛋白标识码)。因为Grp94是系统发生上高度保守的细胞内蛋白，并且人类变体显示与大鼠和小鼠Grp94二者显著的序列同源性(＞80％)，由此得出结论大鼠和/或小鼠Grp94可用于有利地替代人类Grp94。
IgG始终是人类的并且在本质上是非免疫性，即从正常受实验者的血浆中获得并以公知的标准步骤纯化。
在将Grp94与非免疫性IgG共孵育之后复合体形成，并显示上文报告的特性，即：i)不牵涉IgG分子上的抗原结合位点、在IgG的铰链区存在并牵涉Fc、Fab或二者的近端部分的稳定结合；ii)对变性条件诸如煮沸和还原处理具有抗性；iii)高于300kDa、更具体地包括在300和350kDa之间的质量，如使用完整IgG分子在10％至40％甘油密度梯度上的离心实验所确定的。
除这些结构特性之外，体外形成的复合体还显示独特的未预期的生物性质。复合体能够：
1)刺激细胞生长和诱导HUVEC向毛细血管形成的分化；
2)增强HSP70和HSP90二者在HUVEC中的表达，HSP70和HSP90二者介导伴随许多胞足体的形成的细胞骨架的结构变化；
3)诱导IgG的表达和从HUVEC的分泌；
4)刺激与IgG产生的显著增加相关的人类PBMC的增殖。
在斑点印迹实验中，可能确立天然Grp94仅在未变性时稳定结合IgG，而在变性后(例如，煮沸后)Grp94丧失此能力。因此，显然结合发生于IgG上不同于参与抗原结合的位点(Fab)的位点，并且复合体是非免疫性的(与非免疫性IgG形成的)。复合体具有300-350kDa的质量(如使用完整的IgG分子在甘油密度梯度上的离心实验所确定的)，并且甚至在变性和还原条件诸如煮沸和用β-巯基乙醇处理下是稳定的。另外，这些复合体展示对HUVEC的重要的生物效应，包括对细胞生长的刺激、对血管生成分化及HSP90和HSP70的增加的表达的诱导。复合体还在非常低的浓度(1ng/ml)就已刺激人类PBMC的增殖。HUVEC和PBMC二者的刺激模式与由不同的生长因子展示的模式重叠，因此其特征为在窄浓度范围内出现刺激效应，而在非常低的浓度(在纳摩范围内)就达到最大效应峰值。由Grp94-IgG复合体对PBMC增殖的刺激还伴随有IgG产生的显著增加，在10ng/ml浓度时尤其明显。
因为观察到体外形成的复合体的效应与细胞因子引起的效应重叠，所以预期复合体在影响免疫应答方面的行为与细胞因子相似；因此复合体可开发作为其中需要调节免疫应答的疾患的体内治疗剂。
下文详细描述的实验结果表明了本发明的Grp94与人类非免疫性IgG的复合体作为免疫调节剂在其中需要刺激或抑制免疫应答的病变中的重要治疗应用，需要刺激免疫应答的病变指特征为免疫应答缺陷的疾患(如肿瘤、炎性疾病、不同病因学的免疫缺陷)，需要抑制免疫应答的病变包含其中必须抑制加剧的免疫应答的自身免疫疾病。
就所关注的前一种疾患而言，与能够诱导强烈的体液和细胞免疫反应的细胞因子相似，Grp94与IgG的复合体可用作治疗肿瘤的新型治疗疫苗。已知绝大部分肿瘤缺乏免疫原性，并因此是通过疫苗接种的自动免疫接种的合适靶标(Raez L.E.等人Clin.Med.Res.，2005；3：221-228)。根据本发明的Grp94-IgG复合体可用作疫苗，其中Grp94是抗原而IgG是佐剂，该疫苗能够增强免疫应答(即，抗Grp94 Ab的产生由Grp94特异性地诱发)，也有助于强烈的分化效应。使用Grp94-IgG复合体作为有效的肿瘤疫苗的基本原理是基于癌症细胞中Grp94的表达增加的常识，Grp94代表几种肿瘤中共同的细胞表面抗原(Takagi S.等人Hum.Pathol.，2004；35：881-886；Zhu X.D.等人World J.Gastroeneterol.，2004；10：1141-1145；Akutsu Y.等人Int.J.Oncol.，2007；31：509-515)。然而，虽然Grp94的胞外表达在几乎任何癌症细胞中都是增加的，但是在大多数情况下此表达不足以诱发导致肿瘤排斥的有效免疫应答。目前可用的Grp94疫苗全部是用与各种肽复合的Grp94制备的，所述肽大部分是源于肿瘤细胞的肽(Chandawarkar R.Y.等人Int.Immunol.，2004；16：615-624；Liu B.等人Vaccine，2008；26：1387-1396)。在这些已知疫苗中，Grp94是作为佐剂包括于其中的，而肽代表负责具体免疫接种的真正抗原(针对肿瘤培养的)(Dai J.等人CancerImmunity，2003；1：1-11)。然而，许多障碍阻止了基于肿瘤来源的肽作为真正抗原的原理的疫苗疗法的成功开发。第一，取决于形成原发性和/或继发性(转移性)肿瘤的细胞的分化阶段，肽在性质和数量两方面都不相同。因此，在肿瘤发展的不同期，肽的免疫原性可发生显著改变(E.等人Curr.Opin.Immunol.，2002；14：178-182)，使得疫苗接种无效。第二，预期组织特异性肿瘤和/或器官特异性肿瘤展示其自身的特定组的抗原性肽，这一事实暗示对于任何特定类型的肿瘤必须有单独的疫苗疗法。第三，为了获得抗原性肽，必须的是可切除肿瘤并对足够数量的肿瘤细胞进行一系列耗时和昂贵的纯化步骤。所有这些条件严重限制了肿瘤疫苗的有效和大规模治疗应用的余地。
为本发明目标的Grp94-IgG复合体可代表在开发可靠的和有效的抗肿瘤疗法的努力中的显著改进：它结合了针对任何癌症细胞(无论癌症细胞的性质、分化阶段和定位如何)共有的抗原(Grp94)的免疫应答的特异性，以及IgG分子(佐剂)赋予复合体的刺激免疫系统产生特异性Ab的增强的能力的能力。
此外，本发明的Grp94-IgG复合体还可有用地用作用于自身免疫疾病的“负”疫苗疗法中的免疫调节剂，自身免疫疾病中有针对自身抗原的加剧的免疫应答。Grp94-IgG复合体作为“负”疫苗(即具有抑制免疫活化的能力)的开发源于以下前提：与癌症细胞中发生的细胞表面呈递相似，Grp94的细胞表面呈递也发生于自身免疫过程中。然而，在细胞膜上表达的实体和Grp94的胞外释放两方面都极其重要地指示免疫应答(无论是耐受或是针对自身)的性质。因此，细胞膜结合的或可溶的Grp94的浓度的快速增加造成应答从耐受变为针对自身(针对呈递抗原的细胞)转变。了解自身免疫发展过程中非常早的抗原就成为获得有效疫苗的必要条件。因此，使用Grp94-IgG复合体即本发明的目标作为不同自身免疫疾病中的“负”疫苗的前提是Grp94是上文提及的病理疾患中细胞膜上呈递的抗原的最重要的部分(如果还不是唯一)。可使自身免疫过程停止的一个可能机制预测为，在其中具有由T辅助细胞-1(Th-1)淋巴细胞的亚群特异性维持的免疫应答的强烈活化的疾病阶段施用Grp94-IgG复合体。在这种条件下，已知升高剂量的疫苗可通过引起淋巴细胞群体从Th-1炎性向Th-2耐受性的转变来抑制自身免疫攻击(Ghoreschi K.Trends Mol.Med.，2003；9：331；Steinman R.M.J.Clin.Inv.，2002；12：1519；Chandawarkar R.Y.等人2004，引用参考文献)。
就所关注的治疗干预而言，本发明的Grp94与人类非免疫性IgG的复合体可因此有利地用于特征为免疫应答的缺陷或过度刺激的病变的预防和治疗两方面。在Grp94-IgG复合体中，Grp94可以是天然哺乳动物蛋白或其重组蛋白(完整的或片段二者)或其模拟物，而IgG或其片段(Fab或Fc部分)是人类的和非免疫性的，它们获自健康供体的血浆。
因此，对于本发明目的，Grp94-IgG复合体可用完整IgG或其片段形成，而复合体中的Grp94可以是完整分子或其片段或模拟物(诸如例如HSP90)。
本发明的Grp94-IgG复合体可用作在添加合适的赋形剂、载体和/或稀释剂的药物组合物中制备的免疫调节剂。对于此目的，含有Grp94-IgG复合体的药物制剂是适于全身和/或局部施用的，以及在合适的控制释放递送系统中的那些。药物制剂还包括用标准程序或创新技术开发的那些，其使用最近设计的生物材料和其他材料、添加剂、稀释剂、乳化剂、水性和油性或甚至聚合性媒介物，它们全部是适合于药物应用的。
胃肠外施用中使用的合适药物制剂是已知的那些，诸如含有溶液或悬浮液中的药理学活性物质的随时可用的小瓶，或诸如将在施用时用添加的水性(缓冲的或具有适当的悬浮颗粒)或油性溶剂稀释的冻干粉末。
每种制剂中存在的活性物质的量以及治疗剂量将根据病变和其严重度、发展病变本身的风险和患者的总体健康状况(包括他/她的体重)而不同。活性物质的量可包括在0.02mg/kg体重和5mg/kg体重之间，该量以单一或多个日剂量、在不同的时间间隔以治疗的重复周期施用。
本发明的Grp94-IgG复合体可进一步用于旨在调节免疫应答的活体外实验。因此，可从患者血液中分离免疫系统的分离的细胞诸如淋巴细胞、抗原呈递细胞、树突细胞，并将其与本发明的复合体共孵育至少1h。优选地，免疫系统的细胞是在与本发明的Grp94-IgG复合体孵育之前基于特定的抗原和/或膜标志物选择的细胞亚群。优选的细胞浓度是200万/ml，而复合体可以包括在10ng/ml和10μg/ml之间的浓度使用。
此外，考虑到：a)抗Grp94、抗HSP70和抗HSP90初级(独特型)Ab的浓度在糖尿病受治疗者的血浆中以及在其他炎性病理疾患(急性和慢性二者)下是增加的，并且这些Ab独立于疾病持续时间存在且存在浓度随受治疗者而不同；b)1型糖尿病受治疗者的血浆中也循环有针对免疫性(天然)Grp94-IgG复合体的Ab(抗独特型或二级Ab)，由此得出结论初级Ab和二级Ab二者都是与改变的免疫应答密切相关的炎症标志物。这些Ab(针对Grp94的独特型和针对免疫性Grp94-IgG复合体的抗独特型二者)的检测可开发为与各种炎性/代谢疾病(诸如糖尿病、原发性高血压、动脉硬化)相关的炎症的、不同病因学的脂代谢改变的、自身免疫疾病(诸如系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎和变应性疾病)和传染性疾病(通过结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、衣原体和病毒)中的诊断和预后标志物，在上述疾病中Grp94被认为在血管床的炎性反应中具有疾病发生学作用。具体而言，在明显地仍然健康的人中检测到显著浓度的上文提及的Ab可预测疾病的发展(因此具有诊断意义)，而已经明显的疾病中Ab浓度的变化可与疾病相关的炎性并发症的好转或恶化相关(因此具有预后意义)。
因此，为本发明目标的Grp94-IgG复合体可有利地用于诊断试剂盒来测量抗独特型Ab(识别Grp94-IgG免疫复合体)，而独特型Ab可通过使用变性的Grp94作为抗原来检测。
Ab的检测因此可考虑：
a)针对天然Grp94-IgG复合体开发的抗独特型Ab。抗独特型Ab可识别复合体的Grp94或IgG部分或二者。可通过将根据本发明的Grp94-IgG复合体或其片段、类似物、衍生物或模拟物结合于适当的阵列基质来显示这些Ab，所述阵列基质选自微孔、膜、树脂或凝胶，并且优选地选自玻璃或硅芯片、塑料微孔、硝酸纤维素膜或附着于玻片的树脂、由含有反应基团的交联聚合物制成的三维凝胶的组；
b)可使用变性后的天然(或重组)Grp94检测的独特型抗Grp94Ab。
就所关注的a)点而言，血浆/血清Ab的定量测定可用下文描述的方法(直接标记、单一Ab测定)进行：
-从需要在纵向和/或横向研究中进行检查的受治疗者的血液中获得血浆/血清样品(或通过离子交换离心柱的方法从血浆快速纯化的IgG级分)；
-使用加标签于蛋白质并能够产生可测量的信号(比色、荧光、化学发光、放射性)的适当的探针直接标记血浆样品或血浆纯化的IgG级分；
-将血浆样品或血浆纯化的IgG的直接标记的蛋白质置于合适的阵列基质上，所述阵列基质选自微孔、膜、树脂或凝胶(优选地选自如上所述的微孔、膜、树脂或凝胶组成的组)，其上已预先允许连接了根据本发明的Grp94-IgG复合体或其片段、类似物、衍生物或模拟物。特别地，与本发明的Grp94-IgG复合体的底物的连接应牵涉IgG分子的C-末端部分或该分子上不是抗原结合位点、或特异性地参与Grp94的直接或通过间隔子间接结合的位点的部分，以使形成复合体的Grp94和IgG二者的显著部分可自由地与针对复合体的Ab相互作用；
-不与连接的复合体相互作用的标记蛋白质通过洗涤除去，而特异性识别复合体的Ab可通过测量连接于IgG的特异性探针产生的信号容易地测量。
就所关注的b)点而言，血浆/血清Ab的定量测定可用下文描述的方法(双Ab夹心测定)进行：
-从需要在纵向和/或横向研究中进行检查的受治疗者的血液中获得血浆/血清样品(或通过离子交换离心柱的方法从血浆快速纯化的IgG级分)；
-将血浆样品或血浆纯化的IgG级分置于合适的阵列基质上(如上所述的微孔、膜、树脂或凝胶)，其上已允许连接了变性的Grp94(天然或重组的)；
-洗掉无关的蛋白质之后，通过加标签的检测剂Ab(例如，抗人类IgG，生物素标记的Ab)然后与标记的读出Ab(例如，抗生物素Ab)孵育的方法或通过用于增强免疫检测的其它标准步骤或其它策略的方法检测独特型(初级，抗Grp94)Ab。
用于测定独特型Ab与抗独特型Ab(针对天然免疫性Grp94-IgG复合体)两者和独特型Ab(抗Grp94)的诊断试剂盒可包含：由特定基质制成的阵列形式(平面玻片、膜、用于酶联测定的塑料微孔、基于凝胶的测定)，其上已连接了本发明的复合体Grp94-IgG和/或变性的Grp94(重组或天然的)；用于校准曲线的测试蛋白质样品；用于标记样品蛋白质的试剂溶液；作为对照的人类血浆/血清样品或血浆纯化的人类IgG；以及使用说明手册。
特别地，诊断试剂盒可在一个或多个容器中至少包含：a)固定于合适阵列基质(优选地选自微孔、膜、树脂或凝胶的组)的任选地标记的Grp94-IgG复合体或其片段、类似物、衍生物或模拟物；b)于溶液中或固定于合适阵列基质(优选地选自微孔、膜、树脂或凝胶的组)的任选地标记的变性的Grp94(天然或重组的)；c)任选地标记的测试哺乳动物抗Grp94抗体(优选地来自大鼠、小鼠或兔)；d)对照血浆/血清或血浆纯化的IgG级分；e)用于标记血浆蛋白质的试剂；f)使用说明。
下文详细描述了本发明的复合体的制备及它们的结构和功能表征。
实验部分
A-制备Grp94与人类IgG的复合体
获得复合体形成的第一部包括从大鼠肝细胞的微粒体级分中纯化Grp94。然后使级分经受DEAE琼脂糖凝胶(DEAE-Sepharose)柱接着是肝素-琼脂糖凝胶(Heparin-Sepharose)柱。将以0.5M NaCl从肝素-琼脂糖凝胶柱上洗脱的含有Grp94的峰在FPLC-Superdex 200柱(10mmx300mm)上层析，该柱用含有500mM NaCl的缓冲液A(20mM Tris-HCl(pH 7.5)、5mM醋酸镁、1mM EGTA、10mM β-巯基乙醇、0.1％Triton X-100、10％甘油、0.05mM PMSF、0.02％NaN₃)预先平衡。0.2ml的级分以0.4ml/min的流速洗脱。收集含有Grp94的级分并使其通过伴刀豆球蛋白A琼脂糖凝胶柱(5ml)，该柱用缓冲液B(20mM Tris-HCl(pH 7.5)、1mM MgCl₂、1M CaCl₂、10mM β-巯基乙醇、10％甘油、0.05mM PMSF)预先平衡。随后用含有0.6Mα-D-甲基甘露糖苷的缓冲液B洗脱Grp94，并通过用特异性Ab的免疫印迹测试其纯度。
还使Grp94制品经受QCL-1000发色LAL终点测定以排除任何内毒素污染。
将纯化的Grp94制品在3,500 MWCO的Spectrapor膜管上在4C下对Tris缓冲液(20mM Tris-HCl，pH 7.5)透析过夜，然后使其在3,000MWCO的Amicon Centriplus YM-3上经受超滤。使用Bradford的方法测量蛋白质浓度(Bradford M.M.Anal.Biochem.，1976；72：248-254)。纯化的Grp94的样品以50-μl即用等份在-20C下储存。
通过用绵羊抗人类完整IgG多克隆Ab及山羊抗Fab多克隆Ab和小鼠γ链特异性单克隆Ab的蛋白质印迹评估人类非免疫性IgG的纯度。在旨在评估与IgG的复合体形成的实验中，Grp94与人类IgG以1∶1摩尔比在水性溶剂(孵育终体积：100μl，pH 6.5)中于37C下共孵育1h。
B-Grp94-IgG复合体的结构表征：斑点印迹分析、SDS-PAGE和蛋白质印迹、沉降速度分析
1.斑点印迹分析：下面描述了用于表征如上所述的体外获得的Grp94与人类IgG的复合体的方法步骤以及显示于图1(A)中的结果。
在斑点印迹实验中，首先将PVDF膜条在甲醇中漂洗(1min)，然后将其在去离子水中漂洗(1min)，并让其部分干燥(3min)。斑点用10μl Grp94(2μg)制备。Grp94溶液(于双蒸水中)原样使用(无任何处理)或在煮沸2min后使用。在膜条上制备每种Grp94溶液(未处理的和煮沸的两种)的斑点的两个重复，所述膜条在不存在(对照，于仅TBS中)和存在人类IgG(4μg/ml)的两种情况下在室温孵育8h。然后将膜条与BSA(1％)和Tween(0.2％)的封闭溶液孵育过夜，接着用TBS洗涤(持续1h)并与初级绵羊抗人类IgGAb(2.5μg/ml)进一步孵育。用TBS重复洗涤(持续1h)后，然后将膜条浸入二级Ab(驴抗绵羊IgGAb)溶液中1h并用检测溶液探测。具有用单独的TBS孵育的Grp94的斑点的对照条用初级Ab和二级Ab二者探测，并用单独的二级Ab探测。图1(A)中显示了与抗人类IgG Ab反应的Grp94斑点，表明未处理的Grp94和IgG之间稳定结合的形成，而对照Grp94的斑点(以仅初级Ab和初级Ab加二级Ab二者探测)仅显示微弱的阳性(如果不是没有)。另外明显的是煮沸后的Grp94不再结合IgG，因此证明体外复合体的形成仅在Grp94保持其天然构象时发生。
2.SDS-PAGE和蛋白质印迹：下面详细描述了用于表征如上所述的体外获得的Grp94与人类IgG的复合体的方法以及显示于图1(B)中的结果。SDS-PAGE在10％丙烯酰胺凝胶上运行，并在各泳道中加载缺乏还原处理的和煮沸的2.5μg天然Grp94。在代表具有不同糖基化程度的两个物类的105kDa和92kDa处的两个条带中检测到Grp94。事实上，通过使Grp94经受用N-糖苷酶F(其除去连接于蛋白中的天冬酰胺的糖残基)的去糖基化，105kDa处的条带获得更高的迁移率，聚焦于104kDa，该质量与去除约六个甘露糖残基一致(数据未显示)。孵育后，凝胶中的Grp94的迁移率保持相对于新鲜溶液中的迁移率不变，然而在与IgG孵育之后，105kDa和主要是92kDa的Grp94条带显示强度的显著降低。这一效应在用抗Grp94Ab的蛋白质印迹中甚至更明显，因此表明Grp94单体(主要是具有较低糖基化程度的单体)参与结合IgG。通过探测预先用抗Grp94 Ab以及用抗IgG Ab测试的相同的Grp94样品，注意到在与IgG孵育的Grp94样品中，有一条明显的约100kDa的条带，该条带不存在于单独IgG的样品中(箭头)。
3.甘油密度梯度离心：下面详细描述了用于表征如上所述的体外获得的Grp94与人类IgG的复合体的方法以及显示于图1(C)中的结果。
在旨在评估复合体形成的实验中，将Grp94(200μg/ml)与人类IgG(以1∶1摩尔比)在37C下共孵育1h。也分别孵育与共孵育实验中使用的浓度相同的浓度的Grp94和IgG的对照溶液。使240μl等份的各种孵育的样品溶液(100μg蛋白)经受于含有1mM EDTA和1mM二硫苏糖醇的25mMHepes缓冲液(pH 7.4)中的10-40％甘油梯度的甘油密度梯度离心。在Beckman SW60Ti转头中在4℃下以100,000xg离心18h后，梯度被分离成18个级分，每个级分200，使其经受SDS-PAGE(10％聚丙烯酰胺凝胶)，然后是用抗Grp94Ab和抗IgG Ab的蛋白质印迹。谷氨酸脱氢酶(62kDa)、醇脱氢酶(150kDa)、脱铁铁蛋白(443kDa)和甲状腺球蛋白(669kDa)用作估计复合体分子量的标准。
甘油密度梯度离心方法目前作为凝胶过滤的有效替代方案用于计算各种蛋白质复合体的质量(Tanahashi N.等人J.Biol.Chem.，200；275：14336-14345；Tibaldi E.等人Cell.Mol.Life Sci.2006；63：378-389；Hirano Y.等人Nature，2005；437：1381-1385)。
对离心后收集的以抗Grp94 Ab探测的级分的免疫印迹分析显示，孵育后，单独的Grp94形成超级分子复合体，主要是在级分6中达到峰值，其大致质量为200-300kDa，如根据校准蛋白的质量所确立的。此结果与先前报道的观察相符，该观察显示Grp94单体易于形成同型聚集体(二聚体和甚至更大的复合体)。如图1(C)中所示，β-巯基乙醇还原处理之后，Grp94单体易于从复合体中去除，以使其显现在约105和92kDa的两条主要条带中，很可能对应于纯化时(参见上文)大概特征为不同糖基化程度的肝细胞中存在的Grp94的天然物类。和对单独的Grp94观察到的内容不同，在IgG存在下，Grp94的复合体在更高甘油密度的级分(级分7)中达到峰值，此发现证实复合体具有高于300kDa的质量。此外，与IgG共孵育之后，用抗Grp94Ab的蛋白质印迹在和与IgG形成顽强复合体(约210kDa)相符的分子量处显示Grp94阳性，所述顽强复合体对β-巯基乙醇还原处理和煮沸具有抗性。还显然的是，约92kDa处的Grp94条带在与IgG共孵育后消失，表明Grp94的此物类可能参与与IgG的结合。通过使溶液经受甘油密度梯度离心之前在不存在和存在IgG的两种情况下孵育之后的Grp94的SDS-PAGE(10％聚丙烯酰胺凝胶，未用β-巯基乙醇处理样品)，这一可能性得到进一步证实。图1(B)显示，虽然在不存在IgG下孵育之后质量低于100kDa的Grp94条带仍然存在(尽管具有较低的强度)，但是与IgG共孵育导致92-kDa条带的消失，唯一可见的条带是105kDa处的条带。图1(C)中蛋白质印迹下方的数字指收集的级分，而上方的数字表示用于计算复合体质量的标准蛋白的质量。蛋白质印迹图中右侧为与抗Grp94Ab免疫反应的Grp94条带的质量(kDa)。明显地，在Grp94对照溶液的任何级分中，阳性始终存在于两个条带中(与在甘油密度离心分级之前分析的Grp94的相同溶液观察到的相同)，而在与IgG共孵育之后，92kDa处的Grp94条带始终是不存在的。此外，与单独的Grp94观察到的相比(级分6)，在任何级分中测量的Grp94条带的光密度的峰值向与IgG共孵育后Grp94的更高甘油密度的级分(级分7)迁移，此结果表明Grp94和IgG之间形成复合体。这通过级分7-11中质量高于200kDa的条带的存在得到进一步证实，该条带甚至在对样品进行还原和煮沸处理后在SDS-PAGE中的迁移率也不改变。这一条带证明不可逆复合体的存在，但是该条带在单独的Grp94经甘油密度离心的分级后的相同级分中不存在。
C-Grp94与IgG的复合体的生物活性的表征：对HUVEC和人类淋巴细胞的效应。
1.对HUVEC的细胞生长刺激和分化：下面详细描述了用于生物表征如上所述的体外获得的Grp94与人类IgG的复合体的方法以及显示于图2中的结果。
在补充10％胎牛血清(FBS)的内皮细胞基本培养基中培养细胞，并且在不存在FBS的8-10h饥饿期后，添加新鲜的无血清培养基(2ml)以及单独的和与IgG一起的(摩尔比为1∶1)Grp94(终浓度为1ng/ml和10ng/ml)。20h的孵育期后，收集培养基，将细胞从两个重复孔中分离并在血细胞计数器中计数。用台盼蓝染料排除法评估细胞生存能力；台盼蓝只进入具有改变的但是不完整的膜通透性的细胞。
图2中显示了下面描述的结果。图2(A)中的柱状图代表与不存在IgG的对照细胞的生长(97.38±5.9x10³)相比的两种浓度的Grp94(单独的和与IgG一起的二者)诱导的细胞生长刺激(细胞数/孔)，其与存在单独的IgG下获得的结果(96.33±5.43x10³)没有不同。图2(B)中的柱状图代表添加抑制剂U0126(10μM，终浓度)时具有单独的Grp94(10ng/ml)和存在IgG下的Grp94(10ng/ml)的情况下生长的细胞数量。对照细胞用单独的稀释剂(DMSO 0.1％)处理，该稀释剂是溶解抑制剂的稀释剂。在添加单独的Grp94和与IgG一起的Grp94之前30min，向细胞培养物中添加抑制剂。不存在和存在抑制剂两种情况下对照细胞的数量分别为98.01±5.4x10³和80.38±4.02x10³。柱上的星号标明相对于对照值(空白柱)统计上显著的(*，p＜0.05)和高度显著的(**，p＜0.001)差异。
在抑制剂U0126不存在和存在两种情况下，有和无IgG时Grp94处理后HUVEC的形态发生转化的显微评估(图2，(C))显示单独的Grp94(图b)和与IgG一起的Grp94(图c)诱导的血管发生修饰在添加抑制剂后没有显著改变(图e、f)，而这些图显著不同于对照HUVEC的鹅卵石形态(图a)。抑制剂本身引起与血管发生前转化一致的HUVEC的正常形态的变化(图d)。
2.对HUVEC中HSP70和HSP90的表达的效应：下面详细描述了图3(A)中显示的方法和结果，该图涉及细胞在单独的和与IgG一起的Grp94(10ng/ml)存在下、有和无抑制剂U0126(10μM，终浓度)时孵育20-h后进行的实验。将细胞从孔分离并用裂解缓冲液(50mM Tris-HCl(pH 8.9)、5mM EDTA、380mM甘氨酸、2％SDS、7mMβ-巯基乙醇)处理。全细胞溶解产物在SDS-PAGE(10％聚丙烯酰胺凝胶)中分析，然后用抗HSP90Ab、抗HSP70Ab和抗人类IgGAb进行蛋白质印迹。SDS-PAGE的每个孔中加载等量蛋白(通过对任何溶解产物中的共同条带进行光密度分析的方法确定)。左侧的箭头标示还与右侧的邻近泳道共有的条带。HSP90阳性仅存在于处理的溶解产物(用单独的Grp94和与IgG一起的Grp94二者)，但不存在于对照溶解产物，而HSP70的组成形式存在于任何溶解产物，不过仅在处理的细胞中有指示HSP70的诱导型物类的其他条带。值得注意的是，IgG阳性的条带出现于也聚焦HSP70的相同质量处。在抑制剂存在下，HSP90表达被阻断，而HSP70和IgG二者的表达在处理后的细胞中仍然明显，特别是更高分子量的条带。每种类型的蛋白的蛋白质印迹代表对不同时间的相同样品进行的至少三次另外实验。
还在条件培养基上进行了对细胞溶解产物的分析(收集自获得溶解产物的相同细胞培养物，如上文所报告的)。从两个重复孔中收集培养基，离心以除去细胞碎片、大量透析、冻干并使其经受电泳分析然后是用抗HSP90Ab、抗HSP70 Ab和抗人类IgG Ab的蛋白质印迹(如上文，对细胞溶解产物)。如图3(B)所示，在对照细胞的培养基中未观察到任何测量蛋白质的阳性，而在用Grp94主要是与IgG复合的Grp94刺激后，对应于细胞溶解产物中存在的蛋白质的条带中存在对任何蛋白质的阳性免疫反应。特别地，观察到HSP90、HSP70和IgG的分泌物类仅是用Grp94特别是与IgG的复合体处理诱导的那些物类。
3.与HUVEC中HSP70和HSP90二者的增强的表达相关的形态学效应：下面详细描述了图4中显示的方法和结果。
细胞在不经任何处理(对照，图a)和添加单独的Grp94(10ng/ml)(图b)和与IgG复合的Grp94(图c)二者的两种无血清培养基上培养，如上文所述。图4(A)显示由于抗HSP90Ab与对照和处理的HUVEC二者中的HSP90的反应引起的荧光(用共聚焦显微术显现)(左侧图a、b和c)。用Grp94尤其是以与IgG复合形式存在的Grp94处理的细胞中的荧光强度增加。在后一种情况下，有胞足体(在融合荧光图中用箭头标示)形成增强以及肌动蛋白纤丝的显著增加(中图，蓝色荧光)的证据。感兴趣的是HSP90与肌动蛋白的共定位，最明显的是在胞足体中，由于HSP90和肌动蛋白分别的绿色和蓝色荧光的融合而突出显示为淡蓝色荧光(右侧图)。图4(B)中显示向细胞培养物中添加抗HSP70Ab后由于HSP70引起的荧光，与抗HSP90Ab的报告内容相似。HSP70的荧光在处理的HUVEC(图b和c)相对于对照HUVEC(图a)也是增加的，虽然HSP70的胞内分布不像HSP90的胞内分布那么弥散。HSP70主要沿细胞的边缘集中并集中于细胞的前缘，但与HSP90不同，HSP70未显示与肌动蛋白的完全共定位。(A)和(B)二者中的箭头标示细胞骨架的最显著的结构变化中的一些(右图中的插图)。
虽然HUVEC的细胞生长刺激和向血管发生表型的分化的效应可被解释为可能不需要的效应，但是由于二者均预测促进发展更稳定和严重的血管变化的新血管的形成，所以如果扩展到不是血管内皮细胞的特定细胞类型，相同的效应可能却具有非常不同的后果。具体而言，因为内皮细胞(主要是脐带的内皮细胞)展示先天免疫性细胞(它们起源于骨髓中的共同祖先)的特性(Wallin R.P.A.等人Trends Immunol.2002；23：130-135)，所以认为在HUVEC中观察到的效应可被扩展至免疫性细胞诸如淋巴细胞是合理的，免疫性细胞中的增殖和分化效应可开发用来诱导向血浆细胞的分化，从而导致IgG的产生和增强的免疫应答。
为了测试此特异性效应，对人类外周血单核细胞(PBMC)进行了下面描述的实验。
4.PBMC的刺激效应：使用Ficoll-Paque梯度方法从血液中获得PBMC。离心250ml血液后获得约25ml暗黄覆盖层样品(红细胞、白细胞和血小板的浓缩样品)。将含有3-6亿PBMC(100万/ml血液样品)的暗黄覆盖层置于50-ml Falcon试管中，该试管中添加了体积等于暗黄覆盖层体积一半的RPMI(Roswell Park Memorial Institute)培养基。PBMC分离的第一步包括制备在黑暗下于+4℃保存的Ficoll溶液的等份。将5ml暗黄覆盖层滴入置于Falcon试管(14-ml容量)中的4ml Ficoll溶液。在吊桶式转头中在600xg下离心30min分钟后，PBMC的白色圆盘层化于上层Ficoll溶液和下层血浆溶液之间(红细胞相反沉淀于底部)，并从而用Pasteur移液器回收。将PBMC的级分在Falcon试管(50-ml容量)中混合在一起，并添加新鲜RPMI培养基至50ml体积。在600xg下离心15min后，弃去上清液，并通过添加培养基至50ml体积洗涤沉淀两次，每次洗涤后在300xg下离心10min。最后一次离心后，将沉淀用高达50ml体积的RPMI培养基重悬浮。
PBMC的计数用PBMC的稀释溶液进行，即将50μl起始溶液混合于250μl(终体积)Turk染料溶液(于乙酸中)。细胞计数在共同的细胞计数室内进行。
在旨在测量培养基中的IgG浓度的实验中，将PBMC以2x10⁶个细胞/ml(1ml/孔)的浓度接种于24-孔或48-孔平底板中(分别为2ml和1ml的孔)，在37℃下于加湿的95％空气、5％CO₂环境中孵育2周。对照包括含有仅培养基(或在适当的情况下，为在其中溶解物质的稀释剂)、嘌呤霉素(100μg/ml，终浓度，用于检测背景Ab，即已存在于循环中的非特异性结合于血细胞的Ab)和1∶50(v∶v)稀释的标准促分裂原(商陆促分裂原，PWM)的三个重复孔。处理包括在将每种溶液在37℃下孵育1h后添加单独的和与IgG复合的Grp94(终浓度为1、10和100ng/ml)以及单独的IgG(与Grp94产生1∶1摩尔比所必需的终浓度)。
孵育2周后，在光学显微镜下检查细胞培养物以评估无菌性，收集培养基并收获细胞。将一等份细胞悬浮液用于计数细胞(如上文所述)，而使剩余的细胞悬浮液经受离心(300xg下10min)。将上清液储存于-20℃直至其用于进一步分析(IgG产生的测量)，而将沉淀弃去。在图5中，柱状图代表用10％FBS处理(用作对照)和在不存在FBS下用所示物质处理两种情况下的细胞数量。单独的Grp94诱导的刺激为剂量依赖性效应直至10ng/ml浓度(对于1ng/ml和10ng/ml分别相对于对照值增加5％和63％)，而在100ng/ml Grp94下，刺激显示是略微降低的(对于对照值增加47％)。在最低浓度的与IgG一起的Grp94下，观察到显著的细胞生长刺激(超过对照值23％)。在更高浓度的与IgG一起的Grp94下，刺激反而显示是降低的(10和100ng/ml下分别为22.4％和6％)。这一模式密切类似于生长因子展示的模式，生长因子在非常窄的浓度范围内诱导增殖，高于和低于此范围观察到非常小的效应或根本无效应。单独的IgG不诱导对PBMC的任何增殖效应，此效应相对于对照在数值上甚至是降低的。
5.从PBMC的IgG产生：在96-孔(每个孔200μl)平底Optiplate板(Packard)上铺上50μl抗人类IgG Ab(5μg/ml，于NaHCO₃/Na₂CO₃缓冲液中，ph 9.6)，让其干燥过夜。之后，加入含有3％BSA和0.02％NaN₃的200μl PBS以饱和Ab中的非特异性结合位点。然后用PBS洗涤孔，并加入在PBS/BSA/NaN₃溶液中系列稀释后的每种PBMC培养物的上清液。校准曲线使用逐渐稀释至0.4μg/ml的浓度的人类IgG的标准溶液(2mg/ml)制备。对照孔含有无Ab的缓冲溶液和含有Ab但不含处理溶液的缓冲溶液两种。用PBS(200μl)洗涤后，向每个孔中加入50μl抗人类Ig-I¹²⁵(1μCi/ml，溶解于PBS/BSA/NaN₃溶液中)并让其静置2h。在另外的洗涤之后干燥平板，并在向每个孔中加入30μl Microscint 20后测量放射活性。在37℃下孵育2周后的IgG测量实验的结果报告于图6。Grp94刺激的IgG产生模式类似于与IgG复合的Grp94的模式，在两种情况下，最大刺激都是在10ng/ml的浓度下达到的。不过，与IgG复合的Grp94的刺激实体要高得多(659cpm相比于单独的Grp94的316cpm)。