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本发明涉及用于治疗创伤的创伤治疗剂和组合物，包括具有SEQ IDNO：2所示氨基酸序列的多肽，或者与SEQ ID NO：2所示氨基酸序列具有至少50％，优选70％，更优选90％同一性的多肽。

1、  一种用于治疗创伤的创伤治疗组合物，包含一种多肽和任何合适赋形剂，所述多肽具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列，或者与SEQ IDNO：2所示的氨基酸序列具有至少70％，优选90％的同一性。

2、  一种用于人体或动物体创伤治疗方法的创伤治疗组合物，包含一种多肽，所述多肽具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列，或者与SEQ IDNO：2所示的氨基酸序列具有至少70％，优选90％的同一性。

3、  如权利要求1-2所述的创伤治疗组合物，包括至少两种活性物质，其中一种是具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的多肽，或者与SEQ IDNO：2所示的氨基酸序列具有至少70％，优选90％的同一性的多肽。

4、  如权利要求3所述的创伤治疗组合物，其特征在于另一种活性物质是止血活性物质、生长因子、抗感染物质、镇痛物质、抗炎物质或者其组合。

5、  如权利要求1-4任一所述的创伤治疗组合物，其是适于局部、全身、口服、皮下、透皮、肌内或者腹膜内给药的剂型。

6、  如权利要求5所述的创伤治疗组合物，其特征在于所述适于局部给药的剂型包括乳膏、凝胶、糊剂、发膏剂、擦剂、乳液、洗剂、乳剂、喷雾剂、洗眼剂、滴剂、粉末。

7、  如权利要求5所述的创伤治疗组合物，其特征在于所述适于全身给药的剂型包括注射液和栓剂。

8、  如权利要求5所述的创伤治疗组合物，其特征在于适于口服给药的剂型包括可饮用悬浮液、糖浆剂、片剂、胶囊、丸剂。

9、  如权利要求1-8所述的创伤治疗组合物，其特征在于所述多肽占总重的0.01到90％，优选占总重的0.1％到10％，更优选占总重的1％到5％。

10、  一种创伤治疗医疗器械，包含权利要求1-9所述的组合物。

11、  如权利要求10所述的创伤治疗医疗器械，其是敷料、绷带、透皮医疗器械、药物控释医疗器械，或者药物洗脱支架的形式。

12、  一种多肽在制备治疗急性创伤和/或慢性创伤的药物组合物中的用途，所述多肽具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列，或者与SEQ IDNO：2所示的氨基酸序列具有至少70％，优选90％的同一性。

13、  如权利要求12所述的用途，其特征在于所述急性创伤包括切口、撕裂伤、擦伤、刺伤、穿透伤、钝挫伤、血肿、挤压伤。

14、  如权利要求12所述的用途，其特征在于所述慢性创伤包括由静脉性溃疡、糖尿病溃疡、压疮、角膜溃疡、消化道溃疡、缺血、辐射中毒和皮肤病例如牛皮癣、痤疮和湿疹造成的创伤。

创伤愈合剂和组合物
技术领域
本发明涉及创伤的愈合。本发明特别涉及创伤愈合剂，包含所述创伤愈合剂的组合物，和包含所述创伤愈合剂的医疗器械。
背景技术
组织的创伤愈合是一个复杂的修复过程。例如，皮肤创伤愈合过程涉及募集大量特化细胞到创伤部位，胞外基质和基底膜沉积，血管生成，选择性酶活性和上皮再形成。
一直需要提供一种促进创伤愈合的物质。在急性创伤和慢性创伤情况下，或者对于普遍愈合受损的个体(例如老年人)，通常希望加快愈合速率。创伤可能严重影响生活质量或者甚至导致死亡，因此需要在临床上尽可能加快愈合速率。
市场上已经存在大量创伤愈合剂和组合物，但没有一种能完全令人满意。但是，提供可以产生有效、快速和美观的创伤修复的可选择的创伤愈合剂和组合物仍是一个重要课题。
WO03/074073，以本申请人的名义，描述了参与血管生成调控的54个基因的家族。在这些基因中，“基因156”(本说明书中SEQ ID No1)，其编码“蛋白156A”(本说明书中SEQ ID No2)，在WO03/074073中也称为Angiodensine，被描述为促血管生成的。蛋白156A包含217个氨基酸，且由in silico实验检测具有线粒体序列信号。蛋白156A不包含任何跨膜结构域和保守结构域。WO03/074073描述了人内皮细胞中基因156的反义物(即基因156的抑制)的表达抑制毛细血管的形成。WO03/074073还预见了基因156和蛋白156a的潜在促血管生成活性。
发明内容
在他们的研究基础上进一步深入，本发明人惊奇的发现蛋白156A在体外和体内显示很强的创伤愈合活性。WO03/074073只提及蛋白156A的潜在体外促血管生成活性，因此本发明人不知道蛋白156a在体内对创伤愈合的潜在作用。
因此本发明人确实非常惊奇的注意到蛋白156A在创伤修复中的强有效性。
此外，本发明人发现蛋白156A还在疤痕的最终美观方面特别有效，所述疤痕显得更规则，颜色更浅。
因此本发明第一个方面涉及创伤治疗剂，其包括具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的多肽，或者与SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列具有至少50％，优选70％，更优选90％同一性的多肽。
术语“与SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列具有至少50％，优选70％，更优选90％同一性的多肽”是指与SEQ ID NO：2所示氨基酸序列具有至少50％，优选70％，更优选90％同一性并显示创伤愈合活性的任何多肽。它还包括具有创伤愈合活性的蛋白156A片段。
此处使用的术语“创伤”涉及，但不限于：
—皮肤表皮和/或真皮的伤害，
—来自内部组织或者外部组织或者器官例如眼、粘膜、肺、肾、心脏、肠、腱或者肝的损害、损伤或者创伤，
—血管组织例如静脉、小静脉、动脉和毛细血管的损伤或者损害。
本说明书中，术语“创伤治疗”用于描述涉及创伤愈合的所有不同步骤。因此它包括以下步骤：形成填塞缺损的凝块，炎性细胞侵入凝块，然后侵入成纤维细胞和毛细血管以形成将创伤边缘汇聚到一起的收缩性肉芽组织，切割表皮边缘迁移以覆盖剥蚀的创伤表面。术语“创伤治疗”不只限于皮肤的愈合，还包括上面所列的其他类型创伤的组织修复。
在第二个方面，本发明还涉及创伤治疗的方法，包括给需要治疗的患者施用治疗有效量的SEQ ID NO：2，或者与SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列具有至少50％，优选70％，更优选90％的同一性的多肽。
术语“治疗有效量”是指在不产生不能接受的毒性症状的情况下，能够获得预期医疗结果即创伤愈合的量。所述“治疗有效量”将根据例如待治疗的特定病症、患者的生理状况和治疗持续时间等因素而改变。
第三个方面，本发明还涉及用于治疗创伤的创伤治疗组合物，其包括具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的多肽，或者与SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列具有至少50％，优选70％，更优选90％的同一性的多肽，以及任何合适的赋形剂。
在一个特定实施方式中，从所述组合物中去除内毒素，所述组合物包括具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的多肽，或者与SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列具有至少50％，优选70％，更优选90％的同一性的多肽。
本发明创伤治疗剂和创伤治疗组合物的一个主要优点是加快愈合速率且受损组织恢复得非常接近天然组织。
此外，本发明人指出本发明的创伤治疗剂和创伤治疗组合物在体外刺激内皮细胞迁移中特别有效。蛋白156A似乎也在创伤愈合方面起着全面作用，不仅限于对血管生成的单纯刺激，还有对包括真皮和表皮细胞的再生的创伤修复过程的广泛刺激。
本发明还涉及一种用于人体或动物体创伤治疗方法的创伤治疗组合物，其包括具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的多肽，或者与SEQ IDNO：2所示的氨基酸序列具有至少50％，优选70％，更优选90％的同一性的多肽。
在一个特定实施方式中，如上所述的创伤治疗组合物，包括至少两种活性物质，其中一种是具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的多肽，或者与SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列具有至少50％，优选70％，更优选90％的同一性的多肽。在另一个实施方式中，另一种活性物质是止血活性物质、生长因子、抗感染物质、镇痛物质、抗炎物质，或者其组合。
在另一个实施方式中，本发明的创伤治疗组合物为适于局部、全身、口服、皮下、透皮、肌内或者腹膜内给药的剂型。
适于局部给药的剂型包括液体、软膏、乳膏、凝胶、水凝胶、糊剂、发膏剂、擦剂、乳液、洗剂、乳剂、喷雾剂、气雾剂、洗眼剂、滴剂、粉末。
适于全身给药的形式包括注射液和栓剂。
适于口服给药的形式包括可饮用悬浮液、糖浆剂、片剂、胶囊、丸剂。
根据本发明，在如上所述的创伤治疗组合物中，所述多肽占总重的0.01到90％，优选占总重的0.1％到10％，更优选占总重的1％到5％。
在一个特定实施方式中，本发明的组合物为液体剂型，其中活性多肽的量为0.01mg/mL到5mg/mL，优选为0.1mg/mL到1mg/mL，更优选为约0.5mg/mL。
本发明中“组合物”的含义包括药学(包括皮肤病学)的组合物和化妆品组合物。
术语“合适的赋形剂”，包括公知的原料例如动物和植物油、矿物油、合成油、酯油、蜡、线性高级醇、脂肪酸、表面活性剂、磷脂、胶凝剂和/或增稠剂、醇、多元醇(包括甘油和丙二醇)、填充剂例如粘土矿物、超细粉、防腐剂、香料、色素和纯净水。该术语还包括多糖，例如甘露聚糖、葡甘聚糖、半乳甘露聚糖，fucomannans、蛋白多糖、葡糖胺糖、甲壳素、chitomannans。申请人还提到本发明不限于以上所列的赋形剂。本领域技术人员能够选择适于特定给药剂型的最佳赋形剂。
在第四个方面，本发明还涉及创伤治疗医疗器械，包括如上所述的创伤治疗剂或者创伤治疗组合物。
在一个优选的实施方式中，医疗器械采用敷料、绷带、透皮医疗器械、药物控释医疗器械，或者药物洗脱支架的形式。
属于本发明含义的合适敷料是(但不限于)水胶体敷料、hydrocellular敷料、海藻酸盐敷料、水凝胶敷料、基于壳聚糖的敷料、纤维素衍生物敷料以及用于创伤保护和修复的任何其他类型的敷料。
“透皮医疗器械”是指用于物质通过透皮过程缓慢释放的器械，例如贴片。
“药物洗脱支架”，又称为“涂层”或者“含药”支架，是指涂有活性物质“蛋白156A”的支架。
本发明还涉及如上所述的创伤治疗剂、创伤治疗组合物、或者创伤治疗医疗器械用于治疗急性创伤和/或慢性创伤的用途。
本发明还涉及具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的多肽，或者与SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列具有至少50％，优选70％，更优选90％的同一性的多肽在制备治疗急性创伤和/或慢性创伤的药物组合物中的用途。
基本上，根据造成创伤的物体，急性创伤可以分为不同类型。例如，切口或者切割伤、撕裂伤、擦伤和轻擦伤、烧伤、物体例如钉子或者针刺入皮肤造成的刺伤、物体例如匕首插入身体造成的穿透伤、子弹或者类似弹丸进入或者穿过身体造成的枪伤。急性创伤也可能是闭合伤，例如钝挫伤或者挫伤、血肿、大或者极大的力长时间作用造成的挤压伤。其他急性创伤由皮肤病例如牛皮癣、痤疮和湿疹造成。
另一种可以用本发明治疗的创伤类型是慢性创伤。常见的慢性创伤是静脉性溃疡，通常在腿上发病并主要影响老人；糖尿病溃疡，这是慢性创伤的另一个主要原因；压疮，常见发病于患有疾病例如瘫痪的人中，瘫痪阻碍了经常受压的身体部分例如脚后跟、肩胛骨和骶骨的运动；角膜溃疡，最常见的是由细菌、病毒、真菌或者变形虫的感染引起；和消化道溃疡。其他类型的慢性创伤可由例如缺血和辐射中毒引起。
附图说明
现在将参照下列非限制性实施例进一步说明本发明。
图1A和1B：体外创伤试验后的HUVEC内皮细胞图。损伤后，细胞与VEGF和FGF2(1A)或者与VEGF、FGF2和蛋白156A(1B)培养。
图2A：裸鼠的伤口图。
图2B：局部施用载体溶液48小时后，裸鼠中的伤口图。
图2C：局部施用蛋白156A48小时后，裸鼠中的伤口图。
图3A：施用载体96小时后，4只受伤小鼠的图。
图3B：施用蛋白156A96小时后，4只受伤小鼠的图。
图4：家猪后背两道透皮平行的伤口图。
图5：在施用载体溶液(对照为“C”)或者蛋白156A(测试为“T”)数小时后，两道透皮平行的伤口图。
图6：在施用载体溶液(对照为“C”)或者蛋白156A(测试为“T”)3周后，两道透皮平行的伤口图。
图7A：施用载体溶液5天后取样的伤口剖面图。
图7B：施用蛋白156A5天后取样的伤口剖面图。
具体实施方式
实施例1：重组蛋白156A的制备
蛋白156A是一种重组蛋白，对应基因156编码的完整蛋白。蛋白156A在大肠杆菌B121(DE3)pLys中表达，用8M尿素从细菌细胞中提取，并利用液相色谱法在金属离子(Ni)螯合柱上纯化。用SDS-PAGE控制纯化重组蛋白156A的纯度，并显示超过65％。使用前，利用Endo-Trap柱(Phamacia)从包含纯化蛋白156A的溶液中去除内毒素，并进行检测。纯化的无内毒素重组蛋白156A保存于包含2M尿素、150mM NaCl和0.1mM CaCl₂的Tris-HCl(pH7.5)缓冲溶液中。
实施例2：蛋白156A在体外对内皮细胞迁移的刺激作用
利用稍加修改的Sato和Rifkin(J Cell Biol.1988；107：1199)描述的创伤检测法测定细胞迁移。在生长培养基EGM-2MV(Cambrex)中生长的HUVEC种于24孔板，每孔80000个细胞，500μl生长培养基，37℃下在包含5％CO₂的潮湿空气中生长到汇合。细胞用塑料尖头只刮出一条线。损伤后，培养基换成添加500nM(15μg.mL-1)蛋白156A(测试，图1B)或者不添加蛋白156A(对照，图1A)的新鲜培养基。培养18小时后，倒置显微镜下(Analysis，Olympus，Rungis，France)对细胞进行观察和拍照。
图1A显示培养18小时后，对照条件下(只有生长培养基)伤口仍然存在。
图1B显示培养18小时后，测试条件下(生长培养基+蛋白156A)伤口完全愈合。
因为内皮细胞迁移是新生血管和创伤修复的一个重要特征，因此蛋白156A是创伤愈合的一个潜在的治疗关键物。
实施例3：蛋白156A在Swiss裸鼠体内的愈合活性的预试验
两只动物通过腹腔注射氯胺酮-二甲苯胺噻嗪(80mg/kg-12mg/kg；Ref.K-113，Sigma，France)进行麻醉，然后在每只小鼠的右胁用0.5/10刀片进行透皮损伤(长1cm，深大约1到2mm，参见图2A)。受伤后10分钟在动物伤口上局部施用200μL载体溶液(Tris-HCl pH 7.5，2M尿素，150mM NaCl，0.1mM CaCl₂)或者测试溶液(载体+0.5mg.mL^-1蛋白156A)。
局部施用后48小时对创伤愈合的检测显示蛋白156A治疗的伤口(参见图2C)完全愈合，而载体治疗的伤口(参见图2B)仍没有愈合，仍保持广泛开放。
实施例4：蛋白156A在Swiss裸鼠体内的愈合活性的试验
按照实施例3麻醉8只健康雌性Swiss裸鼠。利用0.5/10刀片在每只小鼠的右胁造成两个透皮伤口，每个1cm长，大约1到2mm深。
第1天，动物受伤后10分钟，8只动物被随机分成两组，每组4只小鼠。所有治疗都通过局部施用来实现。治疗计划概述在表1中。

表1
受伤后10分钟，在各伤口上局部施用200μL载体溶液(Tris-HCl pH7.5，2M尿素，150mM NaCl，0.1mM CaCl₂)对组1的小鼠进行治疗。
受伤后10分钟，在各伤口上局部施用200μL测试溶液(Tris-HCl pH 7.5，2M尿素，150mM NaCl，0.1mM CaCl₂，0.5mg.mL^-1蛋白156A)对组2的小鼠进行治疗。
在用载体或者测试溶液治疗96小时后，对伤口进行拍照。
图3A：载体施用96小时后组1小鼠的图片。
图3B：蛋白156A施用96小时后组2小鼠的图片。
如图3的图片所示，局部施用96小时后伤口愈合的检测显示蛋白156A治疗的伤口完全愈合(组2，图3B)，而载体治疗的伤口(组1，图3A)还没愈合，仍保持广泛开放。
实施例5：蛋白156A在猪模型体内愈合活性的试验
皮肤创伤愈合活性
家猪通过肌肉注射氯胺酮-二甲苯胺噻嗪(10mg/kg-2mg/kg IM)进行麻醉，然后切出两条均深入皮下组织的平行纵向透皮伤口(图4)。
受伤后10分钟在动物伤口上局部施用5mL载体溶液(Tris-HCl pH7.5，2M尿素，150mM NaCl，0.1mM CaCl₂，对照侧“C”)或者测试溶液(载体+0.5mg.mL^-1蛋白156A，测试侧“T”)。
在紧接着手术后的阶段，对两个伤口的观察显示显著的差异。手术后几小时测试侧“T”就出现疤痕(图5)。后来的疤痕持续两周，然后脱落。根据肉眼可见的创伤表面判断，疤痕下的愈合似乎正常。3周后，伤口光滑/平整并且较薄(图6)。对照侧“C”的疤痕在两天后才形成。对照伤口的表层较不平整，最后变得更厚、更皱缩。
角膜创伤愈合活性
通过肌肉注射氯胺酮-二甲苯胺噻嗪(10mg/kg，2mg/kg IM)麻醉家猪，然后获得角膜表层划痕。
受伤后10分钟在划痕处局部施用1mL载体溶液(Tris-HCl pH7.5，2M尿素，150mM NaCl，0.1mM CaCl₂，对照侧)或者测试溶液(载体+0.5mg.mL^-1蛋白156A，测试侧)。
第2天处死动物，对组织取样。
在治疗和未治疗区域均观察到睫状突的水肿。但是，虽然在未治疗区无溃疡的角膜上皮细胞由于剧烈水肿而侧向剥离，这种水肿实际不存在于治疗区。
实施例6：治疗和未治疗的皮肤创伤的组织学分析
通过肌肉注射氯胺酮-二甲苯胺噻嗪(10mg/kg，2mg/kg IM)麻醉家猪，然后切出两条均深入皮下组织的平行纵向透皮伤口(图4)。
受伤后10分钟在动物伤口上局部施用5mL载体溶液(Tris-HCl pH7.5，2M尿素，150mM NaCl，0.1mM CaCl₂，对照侧)或者测试溶液(载体+0.5mg.mL^-1蛋白156A，测试侧)。
第5天处死动物，对对照伤口和测试伤口区域取样。对福尔马林固定的石蜡包埋块进行处理，制备来自取样区域的连续5个显微剖面用于常规HES染色。
在未治疗动物中(图7A)，结果显示，受伤后第5天，伤口仍然贯穿到皮下深层，而在治疗组中(图7B)，边缘的接近涉及所有皮肤层(真皮和表皮)。
这些不同的试验表明治疗伤口和未治疗伤口间存在显著的区别。测试伤口(经蛋白156A治疗)的愈合在所有时间都是更快、更薄以及更平整和完全的。伤口的最终美观方面也更好。该分子还在角膜溃疡的实验模型中显示较强的活性。
序列表
<110>基因信号国际公司
<120>创伤愈合剂和组合物
<130>BEP
<160>2
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>2153
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>1


<210>2
<211>217
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>2