含有双类黄酮衍生物的皮肤外用抗皱组合物 【技术领域】
本发明涉及含有双类黄酮衍生物作为活性成分的化妆品组合物，所述组合物用于改善因衰老而引起的皮肤皱纹。
背景技术
本发明涉及含有双类黄酮衍生物作为活性成分的抗皱化妆品组合物，所述组合物可安全地应用于皮肤上而无副作用，并可引发前胶原的产生、抑制MMP-1，且具有改善紫外线引起的皱纹的作用。
每一活体都会随着年龄增长而经历衰老，皮肤也不例外。人们始终在努力延缓衰老，并不断探求有关“何谓衰老”和“是什么导致衰老”等问题。
皮肤老化根据成因可主要分为两类；一类是因皮肤的结构和生理功能的老化而引起的内在老化，另一类是因诸如阳光等外部施加的累积应激而引起的外在老化。特别是，阳光中的紫外线是众所周知的老化原因。当皮肤长时间暴露于紫外线时，皮肤的角质层变厚，并且皮肤的主要结构成分——胶原和弹性蛋白发生变性，从而因缺乏弹性而导致皱纹的产生。
皮肤老化伴随着各种功能和结构的变化。老化所引起的皮肤的结构变化在于，皮肤组成成分，即表皮、真皮和皮下组织变薄。另外，使皮肤具有弹性和张力的真皮的ECM(细胞外基质)也发生变性。ECM由两种主要组分组成。一种组分为占ECM 2％～4％的弹性纤维，另一种组分为占ECM 70％～80％的胶原。老化时，皮肤显著丧失其弹性，其原因在于胶原和弹性蛋白的减少。胶原和弹性蛋白受到各种因素的调节。例如，胶原和弹性蛋白会因如胶原酶和弹性蛋白酶等基质金属蛋白酶的表达而降解，使得皮肤中胶原含量降低。真皮中的胶原和弹性蛋白一旦减少，皮肤就会变得粗糙和失去弹性(此即老化症状之一)，并产生更多皱纹。因此，防止胶原和弹性蛋白的减少(即，失去弹性的原因)的研究一直都在进行。
到目前为止，预防皮肤老化的最有效的方法是使用视黄醇和视黄酸。通过以前的报道(Dermatology therapy，1998，16，357～364)，视黄醇和视黄酸对于皱纹和弹性的改善效果已经广为人知。然而，虽然类视色素具有如改善皱纹或弹性等积极作用，但其存在下述问题：即使仅少量应用也会刺激皮肤，并且其相当不稳定以致当暴露于空气中时容易氧化和变性，这些问题造成了对其应用的限制。因此，使类视色素变得更加稳定的研究一直都在进行，但皮肤刺激和稳定性的问题始终未能解决。作为另外一种选择，提出了抑制诸如胶原酶、弹性蛋白酶和基质金属蛋白酶等可水解胶原和弹性蛋白的酶的活性的方法，并因而对于能够抑制这些酶的活性的抑制剂进行着积极的研究。特别地，天然植物材料安全且具有许多有用成分，从而可以作为用于筛选抗皱剂的良好靶标。事实上，长久以来，人们一直致力于发现对于人类皮肤安全且具有抗皱效果的天然植物材料。
近来，据公开降解胶原的胶原酶的活性和基质金属蛋白酶的活性的升高是产生皱纹的原因之一。因此，这些酶作为抗皱作用的靶标得到了本发明人的关注。
【发明内容】
技术问题
为在天然植物材料中发现对于人类皮肤安全且具有优异抗皱效果的新型抗老材料，本发明人进行了研究。结果，本发明人发现，源于天然植物的双类黄酮衍生物不仅可抑制胶原酶的活性，还表现出对于紫外线所引起的皱纹具有改善效果，同时对于人类皮肤具有优异的安全性。本发明人还观察到，双类黄酮衍生物对于皮肤老化具有优异的预防和治疗效果。因此，本发明人通过证实本发明的改善皮肤皱纹用化妆品组合物具有优异地皱纹改善效果而完成了本发明，所述组合物含有相对于其总重为0.001重量％～10重量％、更优选为0.01重量％～5重量％的双类黄酮衍生物。
因此，本发明的一个目的是提供一种用于改善和预防皱纹的化妆品组合物，所述组合物含有双类黄酮衍生物作为活性成分，从而改善皱纹且无副作用。
技术解决方案
为实现上述目的，通过以下步骤完成了本发明：通过使用水或有机溶剂由天然植物制备含有双类黄酮衍生物的提取物；通过分离/纯化过程分离双类黄酮衍生物；测定前胶原产率和对胶原酶分解的抑制；以及证实双类黄酮衍生物对于紫外线所引起的皱纹的抑制效果。
在双类黄酮衍生物的结构中，两个类黄酮分子通过C-C键或C-O-C键形成了二聚体。双类黄酮衍生物可以提取自但不总限于如卷柏、银杏、朝鲜粗榧、南天竹和金银花等药用草本或植物。
相对于预防和改善皱纹用化妆品组合物的总重，双类黄酮衍生物的含量可以为0.001重量％～10重量％，且更优选为0.01重量％～5重量％。
下面将详细描述作为预防和改善皱纹用组合物的活性成分的双类黄酮。
作为改善皱纹用化妆品组合物的活性成分的双类黄酮衍生物是由下式1～7表示的化合物。
<式1>
苏麻黄酮(Sumaflavone)
<式2>
2’，8”-双芹菜素
<式3>
台湾黄酮(Taiwaniflavone)
<式4>
穗花杉双黄酮(Amentoflavone)
<式5>
南方贝壳杉双黄酮(Robustaflavone)
<式6>
银杏黄素(Ginkgetin)
<式7>
金连木黄酮(Ochnaflavone)
可以通过常规提取和分离方法自卷柏、银杏、朝鲜粗榧、南天竹和金银花等天然药用草本或植物中获得由式1～7表示的双类黄酮衍生物。为提取目标材料，首先对茎、根和叶进行适当脱水然后浸软，或者仅进行脱水。通过本领域技术人员所公知的常规纯化方法纯化目标材料。
对应于源自上述植物的由式1～7表示的双类黄酮衍生物的合成化合物或其衍生物可于市场上购买，也可以通过本领域技术人员公知的常规方法合成。具体而言，可自诸如卷柏、银杏、朝鲜粗榧、南天竹和金银花等药用草本或植物中提取该化合物，也可以通过常规化学合成来合成该化合物。
作为本发明的其它优选化合物，可以通过使用有机溶剂从提取自卷柏、银杏、朝鲜粗榧、南天竹和金银花的提取物中分离和纯化由式1～7表示的Panduratin衍生物，或自通过压榨上述植物而获得的油中分离和纯化由式1～7表示的Panduratin衍生物。
双类黄酮衍生物可以提取自但不限于如卷柏、银杏、朝鲜粗榧、南天竹和金银花等植物。
双类黄酮是维管植物中天然产生的化合物，并具有通过C-C键或C-O-C键形成的二聚体形态。据信双类黄酮在植物中为二聚体形式的原因如下：当受到来自外界的刺激时，植物会激活其体内保护系统来保护自己，其中，单分子多酚结构会发展成为双类黄酮。双类黄酮的结构根据键型主要分为两种；一种是具有C-C键的穗花杉双黄酮，另一种是具有C-O-C键的金连木黄酮。双类黄酮在抗肿瘤(J Nat Prod，1999，1668-1671.)、抗菌(Phytochem，2005，1922-1926)、抗寄生物、神经保护(Bioorg and Medichem.Lett，2005，3588-3591)、抗氧化(Phytochem，2005，2238-2247)、抗真菌(Arch Pharm Res，2006，746-751)和抗炎(Pharma Res，2005，539-546.，Arch Biochem and Biophy，2006，136-146)活性方面的生物学功能和作用已经得到报道。
然而，尚未出现有关双类黄酮衍生物抗皱作用的报道。
可以从由诸如卷柏、银杏、朝鲜粗榧、南天竹和金银花等药用草本或植物制备的有机溶剂提取物或油中分离和纯化本发明的双类黄酮衍生物。提取溶剂可以是水、甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、丁醇、丙酮、醚、苯、氯仿、乙酸乙酯、二氯甲烷、己烷、环己烷、石油醚或它们的混合物。自天然植物提取物中分离和纯化双类黄酮衍生物可以通过分别使用或联合使用下述装置来进行：填充有硅胶等合成树脂或活性氧化铝的柱色谱和高效液相色谱(HPLC)。然而，提取、分离和纯化活性成分的方法并不总限于此。
在改善皱纹用化妆品组合物中，相对于组合物的总重，本发明的双类黄酮衍生物的优选含量为0.001重量％～10重量％。如果含量小于0.001重量％，则无法获得抗皱效果。然而，如果含量高大于10重量％，则安全性或配制将受到影响。为提高抗皱效果和配制的便利性，相对于组合物总重，双类黄酮衍生物的含量优选为0.01重量％～5重量％。然而，双类黄酮衍生物的含量并不总限于此。
本发明的改善皱纹用化妆品组合物另外还可以包含可提高所述组合物的抗皱作用的其它抗皱元素，只要它们不破坏最初针对的抗皱效果即可。
本发明的改善皱纹用化妆品组合物的剂型不受限制，其剂型可以是营养精华水(nutritional toner)、软化剂、营养霜、按摩霜、面膜(pack)、凝胶、收敛剂、香精、眼霜、眼部精华液、清洁霜、清洁泡沫、清洁水、粉末、润肤液、润肤油和润肤精华液等。
提取双类黄酮衍生物的方法
作为提取本发明的双类黄酮衍生物的方法的实例，下面详细描述苏麻黄酮的提取方法。
双类黄酮衍生物可自诸如卷柏、银杏、朝鲜粗榧、南天竹和金银花等天然植物中分离，但此处选择卷柏作为实例。
将干燥的卷柏粉碎并与醇混合，随后洗提。接下来，去除溶剂，并浓缩粗提物。将浓缩的粗提物与乙酸乙酯混合，随后提取乙酸乙酯可溶组分。优选的是，重复该提取过程至少三次。提取的乙酸乙酯可溶组分含有双类黄酮衍生物，所述双类黄酮衍生物虽然不是单一组分但已经表现出胶原酶抑制活性。
然后，除去乙酸乙酯以浓缩所述乙酸乙酯可溶组分。根据极性差异分离各组分。例如，通过以10∶1∶0.5(体积/体积)的比例混合氯仿、甲醇和水来制备溶剂。将上述组分与此溶剂混合，并由此分离为10个组分。对这些组分进行柱色谱以分离出纯的单一抗皱组分。
经证明，由以上提取和分离获得的抗皱组分是具有式1的结构的穗花杉双黄酮。
自卷柏、银杏、朝鲜粗榧、南天竹和金银花中提取双类黄酮衍生物(即，穗花杉双黄酮、2’，8”-双芹菜素、台湾黄酮、南方贝壳杉双黄酮、银杏黄素和金连木黄酮)的方法与上述方法相似。
【附图说明】
通过对连同附图提供的优选实施方式的以下描述，本发明的上述及其它目的、特点和优点将变得显而易见，在所述附图中：
图1是说明双类黄酮衍生物对紫外线(UV)所引起的皱纹的改善的一组照片。
【具体实施方式】
下面说明本发明的实际和当前优选的实施方式，它们如以下实施例中所示。
然而，应该理解，本领域技术人员可以根据本公开在本发明的主旨和范围内进行修改和改进。
实施例1：苏麻黄酮的提取
将1.8kg干燥的卷柏切割为小片，然后在80℃使用甲醇提取4小时，重复该提取三次。减压浓缩获得的甲醇提取物。将78.7g浓缩物溶解在添加有二氯甲烷(作为提取溶剂)的水中，然后提取三次。获得二氯甲烷可溶组分(21.7g)，并使用乙酸乙酯或丁醇作为提取溶剂对残余物再提取三次。结果，获得乙酸乙酯可溶组分(6.8g)、丁醇可溶组分(7.8g)和残余水组分(16.2g)。
对6.8g乙酸乙酯可溶组分进行硅胶柱色谱。使用包含比例为10∶1∶0.1(体积/体积)的氯仿、甲醇和水的混合溶剂作为柱洗脱缓冲液。在缓缓升高甲醇含量以提高混合溶剂的极性下进行柱色谱，得到6个组分(E1～E6)。在这6个组分中，对第三个组分(E3)逐步进行硅胶柱色谱(氯仿∶甲醇∶水＝8∶1∶0.1)、RP-18柱色谱(甲醇∶水＝2∶1，Merck，Lichroprep RP-18，40-63μm，L610400138)和葡聚糖凝胶LH-20柱色谱(甲醇∶水＝4∶1，LipophilicSephadex LH 20，25-100μm，Sigma，Lot 81k1092)，以得到化合物1(苏麻黄酮)。
通过与上述相似的方式，也制备了穗花杉双黄酮、2’，8”-双芹菜素、台湾黄酮、南方贝壳杉双黄酮、银杏黄素和金连木黄酮。
实施例2：Panduratin A化合物的结构的确定
为确定实施例1中分离出的单一材料的结构，分别在500MHz和125MHz(溶剂：DMSO)下测定了1H-NMR谱和13C-NMR谱。结果如下。
将1H-NMR和13C-NMR的结果与传统的研究结果进行比较以鉴定结构，参考文献如下所示。
Lin，L.-C.，Kuo，Y.-C.，和Chou，C.-J.(2000)Cytotoxic biflavonoidsfrom Selaginella delicatula.J.Nat.Prod.，63，627-630。
Markham，K.R.，Sheppard，C.，和Geiger，H.(1987)13C NMR studies ofsome naturally occurring amentoflavone and hinokiflavone biflavonoids.Phytochemistry，26，3335-3337。
Chen，S.-C.，Liu，H.-K.，和Kuo，Y.-H.(2004)Two new compounds fromthe leaves of Calocedrus microlepic var.formosana.Chem.Pharm.Bull.，52，762-763。
Chari，V.M.，Ilyas，M.，Wagner，H.，Neszmelyi，A.，Chen，F.-C.，Chen，L.-K.，Lin，Y.-C.，和Lin，Y.-M.(1977)13C-NMR spectroscopy ofbiflavonoids.Phytochemistry，16，1273-1278。
通过与上述相似的方式，也确定了2’，8”-双芹菜素、台湾黄酮、南方贝壳杉双黄酮、穗花杉双黄酮、银杏黄素和金连木黄酮的结构，结果如下所示。
化合物1(苏麻黄酮)
1H-NMR(CD3OD，500MHz)δ6.25(1H，s，H-3)，6.12(2H，s，H-6，H-8)，8.23(1H，s，H-2′)，7.08(1H，d，J＝8.5Hz，H-5′)，7.86(1H，d，J＝8.5Hz，H-6′)，6.58(1H，s，H-3″)，7.63(2H，d，J＝8.0Hz，H-2″′，H-6″′)，6.60(2H，d，J＝8.0Hz，H-3″′，H-5″′)。
13C-NMR(CD3OD，125MHz)δ162.34(C-2)，103.53(C-3)，183.70(C-4)，163.09(C-5)，100.94(C-6)，163.09(C-7)，95.74(C-8)，159.56(C-9)，104.75(C-10)，121.75(C-1′)，132.90(C-2′)，124.76(C-3′)，166.54(C-4′)，120.71(C-5′)，127.81(C-6′)，162.76(C-2″)，103.17(C-3″)，183.97(C-4″)，163.73(C-5″，C-6″，C-7″)，108.65(C-8″)，156.73(C-9″)，104.10(C-10″)，123.28(C-1″′)，129.44(C-2″′)，116.96(C-3″′)，165.58(C-4″′)，116.96(C-5″′)，129.44(C-6″′)。
化合物2(2’，8”-双芹菜素)
1H-NMR(CD3OD，500MHz)δ6.51(1H，s，H-3)，6.13(1H，s，H-6)，6.39(1H，s，H-8)，7.92(1H，s，H-3′)，7.04(1H，d，J＝7.0Hz，H-5′)，7.76(1H，d，J＝7.0Hz，H-6′)，6.51(1H，s，H-3″)，6.32(1H，s，H-6″)，7.44(2H，d，J＝8.0Hz，H-2″′，H-6″′)，6.68(2H，d，J＝8.0Hz，H-3″′，H-5″′)。
13C-NMR(CD3OD，125MHz)δ166.22(C-2)，103.43(C-3)，184.81(C-4)，163.24(C-5)，100.32(C-6)，166.02(C-7)，95.30(C-8)，159.38(C-9)，105.49*(C-10)，121.60(C-1′)，121.60(C-2′)，132.91(C-3′)，161.00(C-4′)，117.42(C-5′)，129.05(C-6′)，162.57(C-2″)，104.07(C-3″)，184.23(C-4″)，163.59(C-5″)，100.11(C-6″)，163.59(C-7″)，105.32(C-8″)，156.53(C-9″)，105.39*(C-10″)，123.29(C-1″′)，129.41(C-2″′)，116.94(C-3″′)，162.57(C-4″′)，116.94(C-5″′)，129.41(C-6″′)。
化合物3(台湾黄酮)
1H-NMR(CD3OD，500MHz)δ6.53(1H，s，H-3)，6.08(1H，s，H-6)，7.64(2H，d，J＝8.5Hz，H-2′，H-6′)，6.57-6.59(3H，s，H-3′，H-5′，H-3″)，6.53(1H，s，H-6″)，6.08(1H，s，H-8″)，8.26(1H，br d，J＝2.0Hz，H-2″′)，7.08(1H，d，J＝8.5Hz，H-5″′)，7.86(1H，br dd，J＝8.5，2.0Hz，H-6″′)。
13C-NMR(CD3OD，125MHz)δ166.05a(C-2)，109.07(C-3)，183.89b(C-4)，165.63a(C-5)，102.93(C-6)，163.71a(C-7)，96.72(C-8)，159.84c(C-9)，103.84(C-10)，122.84(C-1′)，129.44(C-2′)，117.22(C-3′)，163.47a(C-4′)，117.22(C-5′)，129.44(C-6′)，165.63a(C-2″)，103.23(C-3″)，189.29b(C-4″)，162.83a(C-5″)，102.93(C-6″)，162.23a(C-7″)，96.72(C-8″)，159.80c(C-9″)，103.65(C-10″)，121.87(C-1″′)，132.76(C-2″′)，125.14(C-3″′)，156.71(C-4″′)，121.02(C-5″′)，127.50(C-6″′)。
化合物4(穗花杉双黄酮)
1H-NMR(吡啶-d5，500MHz)δ7.03(1H，s，H-3)，6.84(1H，s，H-6)，6.79(1H，d，J＝2.0Hz，H-8)，8.54(1H，d，J＝2.0Hz，H-2′)，7.40(1H，d，J＝8.0Hz，H-5′)，7.87(1H，d，J＝7.0Hz，H-6′)，6.92(1H，s，H-3″)，6.71(1H，d，J＝2.0Hz，H-6″)，7.89(2H，d，J＝8.5Hz，H-2″′，H-6″′)，7.14(2H，d，J＝8.5Hz，H-3″′，H-5″′)。
13C-NMR(吡啶-d5，125MHz)δ165.01(C-2)，104.44(C-3)，183.41(C-4)，163.43(C-5)，100.34(C-6)，164.95(C-7)，95.19(C-8)，158.85(C-9)，105.38(C-10)，122.08(C-1′)，128.66(C-2′)，122.83(C-3′)，161.66(C-4′)，117.60(C-5′)，132.92(C-6′)，166.15(C-2″)，103.92(C-3″)，183.06(C-4″)，162.77(C-5″)，100.14(C-6″)，164.06(C-7″)，105.61(C-8″)，156.19(C-9″)，105.27(C-10″)，122.76(C-1″′)，129.16(C-2″′)，117.18(C-3″′)，162.98(C-4″′)，117.18(C-5″′)，129.16(C-6″′)。
化合物5(南方贝壳杉双黄酮)
1H-NMR(DMSO-D6，500MHz)δ6.81(1H，s，H-3)，6.48(2H，br d，J＝2.0Hz，H-6，H-8)，7.82(1H，br s，H-2′)，7.02(1H，d，J＝8.5Hz，H-5′)，7.90(1H，dd，J＝8.5，2.5Hz，H-6′)，6.77(1H，s，H-3″)，6.60(1H，s，H-8″)，7.96(2H，d，J＝8.5Hz，H-2″′，H-6″′)，6.95(2H，d，J＝8.5Hz，H-3″′，H-5″′)。
13C-NMR(DMSO-D6，125MHz)δ164.11a(C-2)，102.81b(C-3)，181.82c(C-4)，159.09(C-5)，98.82(C-6)，163.54(C-7)，94.04d(C-8)，157.37(C-9)，103.71(C-10)，121.28(C-1′)，127.41(C-2′)，120.54(C-3′)，161.47e(C-4′)，116.42(C-5′)，130.92(C-6′)，164.01a(C-2″)，102.75b(C-3″)，181.73c(C-4″)，161.17e(C-5″)，103.29(C-6″)，163.54(C-7″)，93.73d(C-8″)，156.42(C-9″)，103.71(C-10″)，121.21(C-1″′)，128.51(C-2″′)，116.02(C-3″′)，161.47e(C-4″′)，116.02(C-5″′)，128.51(C-6″′)。
化合物6(银杏黄素)
1H-NMR(DMSO-D6，500MHz)δ6.88(1H，s，H-3)，6.36(1H，d，J＝2.2Hz，H-6)，6.79(1H，s，H-8)，8.09(1H，d，J＝2.1Hz，H-2′)，7.36(1H，d，J＝8.6Hz，H-5′)，8.22(1H，d，J＝8.7Hz，H-6′)，6.99(1H，s，H-3″)，6.38(1H，s，H-6″)，7.49(2H，d，J＝8.8Hz，H-2″′，H-6″′)，6.78(2H，d，J＝8.8Hz，H-3″′，H-5″′).3.79(s，3H，OCH3)，3.88(s，3H，OCH3)。
13C-NMR(DMSO-D6，125MHz)δ163.01(C-2)，103.7(C-3)，181.91(C-4)，161.09(C-5)，98.74(C-6)，165.22(C-7)，92.69(C-8)，157.42(C-9)，104.43(C-10)，122.38(C-1′)，128.24(C-2′)，121.83(C-3′)，160.66(C-4′)，117.60(C-5′)，130.92(C-6′)，163.15(C-2″)，102.92(C-3″)，181.06(C-4″)，160.07(C-5″)，98.84(C-6″)，162.06(C-7″)，103.61(C-8″)，154.19(C-9″)，103.27(C-10″)，121.76(C-1″′)，127.86(C-2″′)，115.38(C-3″′)，161.28(C-4″′)，115.59(C-5″′)，127.46(C-6″′).55.76(OCH3)，56.37(OCH3)。
化合物7(金连木黄酮)
1H-NMR(DMSO-D6，500MHz)δ6.41(1H，s，H-3)，6.17(1H，s，H-6)，6.37(1H，s，H-8)，7.82(1H，s，H-2′)，7.01(1H，d，J＝7.2Hz，H-5′)，7.56(1H，d，J＝7.2Hz，H-6′)，6.52(1H，s，H-3″)，6.35(1H，s，H-6″)，6.75(1H，s，H-8″)，7.48(2H，d，J＝8.2Hz，H-2″′，H-6″′)，6.72(2H，d，J＝8.2Hz，H-3″′，H-5″′)。
13C-NMR(DMSO-D6，125MHz)δ164.02(C-2)，103.60(C-3)，182.21(C-4)，161.74(C-5)，98.32(C-6)，165.02(C-7)，94.30(C-8)，157.78(C-9)，103.59*(C-10)，122.33(C-1′)，121.22(C-2′)，141.51(C-3′)，153.56(C-4′)，117.92(C-5′)，125.35(C-6′)，162.62(C-2″)，104.15(C-3″)，181.23(C-4″)，161.59(C-5″)，99.11(C-6″)，164.59(C-7″)，94.32(C-8″)，157.53(C-9″)，103.39*(C-10″)，124.29(C-1″′)，127.91(C-2″′)，116.64(C-3″′)，160.57(C-4″′)，116.74(C-5″′)，128.41(C-6″′)。
实验例1：前胶原的生物合成
将分离自人类皮肤的成纤维细胞接种在24孔板中(106个细胞/孔)，随后进行培养，直至其生长90％。然后，将这些细胞在无血清培养基中培养24小时。将实施例1～2中获得的具有3，4-亚甲二氧基苯或3，4-亚乙二氧基苯部分的4-取代苯甲酸衍生化合物溶解在无血清培养基中，并以10-4的浓度对该培养基进行处理，随后在CO2培养箱中培养24小时。分离上清液，并使用1型前胶原ELISA试剂盒测定前胶原水平。结果如表1中所示，生物合成能力通过与未处理组(认为是100％)的比例来表现。
[表1]
化合物 合成能力(％) 未处理组 100 苏麻黄酮 127 2’，8”-双芹菜素 117 台湾黄酮 126 穗花杉双黄酮 122 南方贝壳杉双黄酮 125 银杏黄素 118 金连木黄酮 126
如表1所示，经证实所述双类黄酮衍生物可促进胶原的生物合成。
实验例2：胶原酶(MMP-1)抑制活性
将人类成纤维细胞以5,000个细胞/孔的浓度接种在补充有2.5％FBS的含有DMEM(Dulbecco改进Eagle培养基)的96孔微量滴定板中，随后进行培养，直至细胞生长70％～80％。对其用样品化合物以10-4的浓度处理24小时，然后收集细胞培养液。通过使用市售的胶原酶测量试剂盒(目录号：RPN 2610，Amersham Pharmacia，美国)测定细胞培养液中的胶原酶产量。首先，将收集的细胞培养液加样至均匀地分布有胶原酶一抗的96孔板中，随后在恒温箱中进行3小时的抗原-抗体反应。3小时后，将偶联有发色团的胶原二抗加入该96孔板，随后反应15分钟。15分钟后，在室温下向其中加入着色材料以诱发显色15分钟，然后通过加入1M硫酸终止反应。反应溶液呈黄色。黄色的深浅随反应程度而不同。通过使用分光光度计测定黄色96孔板的光密度405(OD405)，并通过数学式1计算胶原酶产量。此时，将未使用样品化合物处理的细胞培养液的OD视为对照。
[数学式1]
胶原酶表达水平(％)＝(使用样品化合物处理的组的OD/对照的OD)×100
[表2]
化合物 胶原酶表达水平(％) 未处理组 100 苏麻黄酮 69 2’，8”-双芹菜素 86 台湾黄酮 72 穗花杉双黄酮 81 南方贝壳杉双黄酮 79 银杏黄素 85 金连木黄酮 76
如表2中所示，经证实所述双类黄酮衍生物对于基质金属蛋白酶(MMP-1)具有抑制效果。
实验例3：对于紫外线引起的皱纹的改善效果
为研究本发明的抗皱材料对于紫外线引起的皱纹的抗老化效果，以1％的浓度将双类黄酮衍生物溶解在空白溶剂(丙二醇∶乙醇∶水＝5∶3∶2(体积/体积))中。将6周龄的雌性SKH-1无毛小鼠分为4个实验组和1个对照组(每组10只小鼠)。每周3次，以70cm的距离对小鼠照射紫外线，持续10周(总计30次)，以引起皱纹。每周5日(周一～周五)，每日2次(早上/下午)透皮施用100μL的样品材料和正对照材料，持续10周。此施用与引起皱纹的照射同时开始。取皮肤影印复本以评价抗皱作用。
作为实验材料，选择表现出特别高的前胶原生物合成能力和胶原酶表达抑制效果的3种组分和双类黄酮组分(BFF)，结果如图1中所示。
如图1中所示，与仅施用空白溶剂相比，施用双类黄酮衍生物时抗皱效果明显。
含有双类黄酮衍生物(苏麻黄酮、2’，8”-双芹菜素、台湾黄酮、穗花杉双黄酮、南方贝壳杉双黄酮、银杏黄素和金连木黄酮)的改善皱纹用化妆品组合物的剂型可以随意选自由营养霜、营养液、按摩霜、营养精华液和软化剂等组成的组。
制造例1：营养精华水(乳液)
根据下表中所示的组成，通过常规方法制备含有双类黄酮衍生物的营养精华水。
成分 重量％ 双类黄酮衍生物 2.0 角鲨烷 5.0 蜡 4.0 聚山梨醇酯60 1.5 失水山梨醇倍半油酸酯 1.5 液体石蜡 0.5 辛酸/癸酸甘油三酯 5.0 甘油 3.0 丁二醇 3.0 丙二醇 3.0 羧基乙烯基聚合物 0.1 三乙醇胺 0.2 防腐剂、颜料、香料 适量 净化水 加至总量为100
制造例2：软化剂(润肤液)
根据下表中所示的组成，通过常规方法制备含有双类黄酮衍生物的软化剂。
成分 重量％ 双类黄酮衍生物 2.0
成分 重量％ 甘油 3.0 丁二醇 2.0 丙二醇 2.0 羧基乙烯基聚合物 0.1 PEG 12壬基苯基醚 0.2 聚山梨醇酯80 0.4 乙醇 10.0 三乙醇胺 0.1 防腐剂、颜料、香料 适量 净化水 加至总量为100
制造例3：营养霜
根据下表中所示的组成，通过常规方法制备含有双类黄酮衍生物的营养霜。
成分 重量％ 双类黄酮衍生物 2.0 聚山梨醇酯60 1.5 失水山梨醇倍半油酸酯 0.5 PEG60氢化蓖麻油 2.0 液体石蜡 10 角鲨烷 5.0 辛酸/癸酸甘油三酯 5.0
成分 重量％ 甘油 5.0 丁二醇 3.0 丙二醇 3.0 三乙醇胺 0.2 防腐剂 适量 颜料 适量 香料 适量 净化水 加至总量为100
制造例4：按摩霜
根据下表中所示的组成，通过常规方法制备含有双类黄酮衍生物的按摩霜。
成分 重量％ 双类黄酮衍生物 1.0 蜡 10.0 聚山梨醇酯60 1.5 PEG 60氢化蓖麻油 2.0 失水山梨醇倍半油酸酯 0.8 液体石蜡 40.0 角鲨烷 5.0 辛酸/癸酸甘油三酯 4.0 甘油 5.0
成分 重量％ 丁二醇 3.0 丙二醇 3.0 三乙醇胺 0.2 防腐剂、颜料、香料 适量 净化水 加至总量为100
制造例5：面膜
根据下表中所示的组成，通过常规方法制备含有双类黄酮衍生物的面膜。
成分 重量％ 双类黄酮衍生物 1.0 聚乙烯醇 13.0 羧甲基纤维素钠 0.2 甘油 5.0 尿囊素 0.1 乙醇 6.0 PEG 12壬基苯基醚 0.3 聚山梨醇酯60 0.3 防腐剂、颜料、香料 适量 净化水 加至总量为100
制造例6：凝胶
根据下表中所示的组成，通过常规方法制备含有双类黄酮衍生物的凝胶。
成分 重量％ 双类黄酮衍生物 0.5 乙二胺乙酸钠 0.05 甘油 5.0 羧基乙烯基聚合物 0.3 乙醇 5.0 PEG 60氢化蓖麻油 0.5 三乙醇胺 0.3 防腐剂、颜料、香料 适量 净化水 加至总量为100
工业实用性
如上所述，本发明的双类黄酮衍生物与双类黄酮受体相互作用以增加前胶原的生物合成，使得双类黄酮衍生物具有抑制因胶原(皮肤的重要组分之一)变性导致的皮肤弹性缺乏而引起的皱纹产生和抑制胶原酶(分解胶原的酶)表达的效果，由此可以促进对紫外线引起的皱纹的改善。因此，本发明的含有双类黄酮衍生物作为活性成分的化妆品组合物可以有效地用作改善和预防皱纹用化妆品组合物或试剂，且无副作用。