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双关键酶基因转化提高丹参毛状根丹参酮含量的方法
    技术领域 本发明属于提高中药材丹参中丹参酮含量的方法， 具体地说是一种双关键酶基因 转化提高丹参毛状根丹参酮含量的方法。
     背景技术 心脑血管疾病是威胁人类健康与生命的 “头号杀手” 。全世界每年有 1700 万人死 于心脑血管疾病 , 占全球总死亡人数的 1/3。 我国每年大约有 260 万人死于心脑血管疾病。 积极研究及开发高效、 低毒和廉价的治疗心脑血管疾病的临床药物对提高人类健康水平具 有十分深远的意义。
     丹参 （Salvia miltiorrhiza Bunge） ， 又名紫丹参、 红根、 赤参、 活血参， 唇形科鼠 尾草属， 多年生草本植物。 作为一种传统中药， 丹参在临床上主要应用于对心血管疾病的治 疗。 丹参主要药用成分包括脂溶性的二萜醌类化合物丹参酮类成分和水溶性的酚酸类化合 物。现代研究表明丹参所含的丹参酮类物质具有抗肿瘤， 抗菌消炎， 抗氧化， 抗动脉粥样硬 化等多种药理活性， 因此具有巨大的市场需求。 然而由于野生资源日益减少， 加之丹参为多 年生草本植物 , 生长周期长， 药用活性成分含量低 , 在传统的栽培模式下， 面临着品质严重 退化及品种选育成本过高等诸多弊端。 如何使丹参这一原料药的供应在数量和质量上更好 地满足临床应用的需要， 成为一个迫切需要解决的重要技术问题。同时丹参酮的结构复杂 导致其化学合成工艺复杂， 成本高， 而且合成过程易造成环境污染 ； 在离体条件下的细胞培 养方法获得的细胞， 其活性成分积累量很低而且稳定性很差。
     检索已有技术文献， 3- 羟基 -3- 甲基戊二酰 CoA 还原酶基因 SmHMGR 和牻牛儿基 牻牛儿基焦磷酸合酶基因 SmGGPPS 是丹参酮生物合成途径中的两个关键限速酶基因， 是丹 参酮代谢工程的重要靶点。本发明采用基因工程手段将上述两个关键酶基因 SmHMGR 和 SmGGPPS 共转化丹参， 打破丹参酮生物合成途径的瓶颈， 获得丹参酮含量高的丹参毛状根或 植株， 为提高丹参酮产量， 满足人类医疗需要， 提供了新的技术方法。
     经广泛检索专利文件和国内外公开出版物， 未发现与本发明利用双关键酶基因共 转化提高丹参毛状根丹参酮含量完全相同的技术方案， 本发明具有新颖性和创造性 ； 由于 本发明在解决丹参酮药源紧缺， 满足人类心血管疾病治疗需要， 延长人类寿命具有重要意 义， 本发明具有实用性。
     发明内容
     本发明的目的在于提供一种技术可靠、 丹参酮成本低、 无环境污染、 能够有效提高 丹参中丹参酮含量的双基因共转化提高丹参毛状根丹参酮含量的方法。
     本发明目的通过如下技术方案实现 ： 一种双关键酶基因转化提高丹参毛状根丹参酮含量的方法， 步骤如下 ： (1) 采用基因克隆方法从丹参中克隆丹参酮生物合成酶基因 SmHMGR 和 SmGGPPS 基因 ； (2) 将 SmHMGR 和 SmGGPPS 基因连于表达调控序列， 形成含 SmHMGR 和 SmGGPPS 基因的植物表达载体 ； (3) 将步骤 （2） 获得含 SmHMGR 和 SmGGPPS 基因的植物表达载体转化发根农杆菌 ； 获得 含 SmHMGR 和 SmGGPPS 基因植物表达载体的发根农杆菌菌株 ； (4) 将步骤 （3） 获得的发根农杆菌菌株遗传转化丹参叶片， 获得 PCR 检测为阳性的转基 因毛状根克隆 ； (5) 半定量 RT-PCR 测定丹参转基因毛状根中 SmHMGR 和 SmGGPPS 基因的相对表达量 ； (6) 高效液相色谱法测定丹参转基因毛状根中丹参酮含量， 筛选丹参酮含量高的丹参 转基因毛状根株系 ； (7)DPPH 清除自由基法测定丹参转基因毛状根中丹参酮的抗氧化活性。
     步骤 （4） 所述的 PCR 检测方法为 ： 分别设计发根位点基因 rol B , 潮霉素磷酸转移酶基因 hpt 的特异 PCR 引物 ； 启动插入基因 SmHMGR ， SmGGPPS 表达的组成型启动子 CaMV35S ； 启动子的内部及插入基因的内部设计上游及下游特异性引物进行 DNA 扩增 ； 紫外线下观察目的条带的株系， 为阳性转基因丹参毛状根株系。
     步骤 （5） 所述的半定量 RT-PCR 检测 SmHMGR 和 SmGGPPS 基因表达量方法为 ： 对 PCR 鉴定为阳性的毛状根克隆进行总 RNA 的提取， 并统一定量到 0.5μg RNA 反转成 30μl 体系的 cDNA 第一条链 ； 分别设计插入目的基因及看家基因 18S rRNA 的引物， 以相同量的 cDNA 第一链为模板 进行半定量 RT-PCR 扩增 ； 分析 SmHMGR 及 SmGGPPS 基因的相对表达量。
     步骤 （6） 所述的高效液相色谱法如下 ： 色谱柱 C-18 反相硅胶柱， 流动相为体积比 65 ： 35 的乙腈和水 ； 检测波长 270 nm ； 柱温 30 ℃ ； 流速 1 ml ／ min， 进样量 20 μl。
     步骤 （7） 所述的 DPPH 清除自由基法测定丹参转基因毛状根中丹参酮的抗氧化活 性的方法为 ： 从转基因毛状根中提取收集丹参酮 ； 将提取的丹参酮稀释为梯度浓度 ： 0.25μg/ml、 0.5μg/ml、 1μg/ml， 2μg/ml、 4μg/ml 的溶液各 1ml ； 向上述溶液分别加入 0.2 mM 的甲醇溶液 ； 在 25 ℃下保温 30 min ； 将上述产物在分光光度计下 517nm 测吸收值。
     本发明的要点是从丹参中克隆两个丹参酮生物合成关键酶基因 ： SmHMGR 和 SmGGPPS 基因， 构建含上述两种 cDNA 分子的植物表达载体， 以发根农杆菌 C58C1 为介导， 将 SmHMGR 和 SmGGPPS 基因同时导入丹参细胞中并获得毛状根。 因此本发明提高毛状根中丹参 酮含量效果更显著。
     本发明利用克隆技术和已有的生物学实验手段如载体构建、 遗传转化、 分子检测、 半定量 RT-PCR 分析、 丹参酮提取及含量测定、 DPPH 清除自由基法测定转基因毛状根中丹参 酮的抗氧化活性等， 发明了一种有效提高丹参毛状根丹参酮含量的方法。为大量生产临床 医疗需要的丹参酮提供了一种优质药源， 对缓解丹参酮药源的紧缺起到积极的促进作用。本发明在丹参生产技术领域首次采用克隆技术提高了丹参中的丹参酮含量， 并提 供了一整套完善的配套技术， 实现了本发明的目的。
     本发明包括如下具体步骤 ： 采用基因克隆方法从丹参中克隆获得丹参酮生物合成关键酶基因 SmHMGR 和 SmGGPPS ； 把 SmHMGR 和 SmGGPPS 基因可操作性地连于表达调控序列， 构成含 SmHMGR 和 SmGGPPS 基因的植物表达载体 ； 将上述含 SmHMGR 和 SmGGPPS 基因的植物表达载体转化发根农杆菌， 获得用于转化丹参 的含SmHMGR 和SmGGPPS 基因植物表达载体的发根农杆菌工程菌株 ； 将菌株遗传转化丹参叶 片， 获得经 PCR 检测为阳性的转基因毛状根株系 ； 半定量 RT-PCR 测定丹参转基因毛状根中 SmHMGR 和 SmGGPPS 基因的表达 ； 高效液相色 谱法测定丹参转基因毛状根中丹参酮含量， 获得丹参酮含量显著提高的转基因丹参毛状根 株系 ； 利用 DPPH 清除自由基法测定丹参转基因毛状根中总丹参酮的抗氧化活性。
     PCR 检测中， 分别设计发根位点基因 rol B, 潮霉素磷酸转移酶基因 hpt 的特异 PCR 引物， 并在植物表达载体上， 启动插入基因 SmHMGR、 SmGGPPS 表达的组成型表达启动子 CaMV35S 的内部， 及插入基因的内部设计上游及下游特异性引物， 进行 DNA 的 PCR 扩增 ； 在 紫外线下观察到目的条带的株系， 即为阳性转基因毛状根株系。
     半 定 量 RT-PCR 测 定 丹 参 转 基 因 毛 状 根 中 丹 参 酮 生 物 合 成 相 关 基 因 SmHMGR ， SmGGPPS 的表达的方法为 ： 对经 PCR 鉴定为阳性的毛状根株系进行总 RNA 的提取， 并定到 同一量的总 RNA 反转成 cDNA 第一条链体系作为模板， 分别设计插入目的基因及看家基因 18SrRNA 的引物， 取相同量的上述 cDNA 第一链体系为模板进行半定量 RT-PCR 扩增 , 分析相 关基因 SmHMGR ， SmGGPPS 的相对表达量。
     高效液相色谱测定丹参酮含量的条件如下 ： 色谱柱 C-18 反相硅胶柱， 流动相为体 积比 65 ： 35 的乙腈、 水溶液， 检测波长 270 nm， 柱温 30℃， 流速 1ml ／ min， 进样量 20 μl。
     DPPH 清除自由基法测定丹参转基因毛状根中丹参酮的抗氧化活性的方法为 ： 将从丹参转基因毛状根中提取收集的丹参酮样品稀释成一定浓度梯度 ： 0.25 μg/ml、 0.5 μg/ml、 1μg/ml、 2μg/ml、 4μg/ml 的甲醇溶液各 1 ml， 然后分别向个浓度溶液加入 1 ml DPPH 溶液 （0.2 mM 的甲醇溶液） 作为自由基来源， 并在 25 ℃下保温 30 min， 样品在分光光 度计 517 nm 下测吸收值。
     本发明利用双关键酶基因共转化策略提高丹参毛状根丹参酮含量的方法， 将双关 键酶基因 SmHMGR 和 SmGGPPS 共同导入丹参细胞中， 获得了高产丹参酮的丹参毛状根株系。 共转 SmHMGR 及 SmGGPPS 基因的毛状根中所检测的 3 种丹参酮 （隐丹参酮、 丹参酮Ⅰ、 丹参酮 Ⅱ A） 含量与对照组相比显著提高， 其中丹参酮Ⅱ A 的含量提高最为明显。共转 SmHMGR 和 SmGGPPS 基因的丹参转基因毛状根总丹参酮的平均含量为 1.815 mg ／ g DW， 是对照组毛状 根 0.475 mg ／ g DW 的 3.82 倍。其中隐丹参酮， 丹参酮Ⅰ， 丹参酮Ⅱ A 的平均含量分别为 0.324 mg ／ g DW、 0.787 mg ／ g DW 和 0.704 mg ／ g DW。对照组隐丹参酮， 丹参酮Ⅰ， 丹 参酮是 0.194 mg ／ g DW、 0.149 mg ／ g DW、 0.132 mg ／ g DW。本发明结果分别是对照组 毛状根的 1.67 倍、 5.28 倍和 5.33 倍。在测试的共转 SmHMGR 和 SmGGPPS 基因丹参毛状根株 系中， 9 号克隆 （HG9） 丹参酮含量最高， 其隐丹参酮含量为 0.315 mg ／ g DW， 丹参酮Ⅰ含量 为 1.196 mg ／ g DW， 丹参酮Ⅱ A 含量为 1.215 mg ／ g DW 及总丹参酮含量为 2.727 mg ／g DW。分别是对照组的 1.62 倍， 8.03 倍， 9.20 倍， 5.74 倍。
     本发明的优点是 ： 1、 显著提高丹参毛状根中总丹参酮含量 ； 2、 发明方法效果可靠 ； 3、 丹参酮成本低 ； 4、 生产过程无环境污染。 附图说明
     图 1 除菌培养 4-5 周的丹参毛状根。
     图 2 转基因毛状根的 PCR 鉴定图 ： A： SmHMGR 基因 PCR 检测 ； B： SmGGPPS 基因 PCR 检测 ； M,DL-2000 Marker(100— 2,000bp) ； PC, 阳性对照 （pCAMBIAl304+-SmHMGR -SmGGPPS 质粒） ； NC, 阴性对照 （野生型丹参） ； + BC, 空对照 （pCAMBIAl304 质粒遗传转化丹参获得的毛状根） ； HG3-HG59 为 SmHMGR 和 SmGGPPS 双基因遗传转化丹参获得的不同转基因株系。 图 3 液体培养的丹参转基因毛状根。
     图 4 转基因丹参毛状根 RT-PCR ： 图中 ： SmHMGR A ， SmGGPPS A 分别代表总 SmHMGR ， SmGGPPS 基因的表达 ； SmHMGR B ， SmGGPPS B 分别代表内源 SmHMGR ， SmGGPPS 基因的表达 ； 18S rRNA 基因作为 内参 ； BC, 为空对照 ： pCAMBIAl304+ 质粒遗传转化获得的丹参毛状根 ； HG3-HG59 为 SmHMGR 和 SmGGPPS 双基因遗传转化丹参获得的不同转基因株系。
     图 5 丹参共转 SmHMGR, SmGGPPS 基因株系平均丹参酮含量图 ： CT， 隐丹参酮 ； T1， 丹参酮Ⅰ ； T2A， 丹参酮Ⅱ A ； TT， 总丹参酮 ； HG， 共转 SmHMGR, SmGGPPS 基因丹参毛状根株系 ； BC, 空对照 ： pCAMBIAl304+ 质粒遗传转化丹参获得的毛状根。
     图 6 DPPH 自由基清除活性随丹参酮浓度变化趋势图 ： HG9, SmHMGR 和 SmGGPPS 双基因遗传转化丹参获得的 9 号毛状根克隆 ; BC， 空对照 ； + pCAMBIAl304 质粒遗传转化丹参获得的毛状根。
     具体实施方式
     下面结合具体实施例详细阐述本发明， 实施例仅用于说明本发明而不用于限制 本发明的范围， 下列实施例中未注明具体条件的， 通常按照现有技术进行， 例如分子克隆 Sambrook 等， 或者按照制造厂商提供的试剂或试剂盒说明书规定的条件进行。
     实施例 1。
     （1） 丹参总 RNA 的提取及 cDNA 第一链的合成 ： 使用 TIANGEN 公司提供的 RNA prep pure plant kit 从丹参转基因毛状根中提取总 RNA， 提取步骤按照试剂盒内的说明书。用于提取总 RNA 的丹参转基因毛状根的鲜重量为0.1g 左右， 提取过程中样品中的 DNA 已用 DNase 工作液清除。将提取的 RNA 在分光光度计 上测定相关的吸光值， 计算所提取 RNA 的纯度及浓度。根据不同 RNA 样品的浓度通过计算 后， 分别以 0.5μg RNA 为起始量， 用反转录酶 XL(AMV) 进行第一链 cDNA 的合成， 操作步骤 按照 Promega 公司提供的说明书。
     （2） SmHMGR 和 SmGGPPS 编码序列特异引物的设计及目的基因片段的获得。
     根据 SmHMGR 基因的编码序列 SEQ ID NO.1 和 SmGGPPS 基因的编码序列 SEQ ID NO.2, 分别设计、 扩增出完整编码框的上下游特异引物， 并在上游和下游引物上视选用的 载体分别引入限制性内切酶位点， 构建植物表达载体。 以所述的第一链 cDNA 为模板， 经 PCR 扩增后进行测序。DNA 序列测定由上海生工生物工程有限公司完成。测序结果表明， 克隆 的序列与实验室在 GenBank 上登录的丹参 SmHMGR 基因 SEQ ID NO.1) 和 SmGGPPS 基因 SEQ ID NO.2 的编码序列完全一致。
     实施例 2 含丹参 SmHMGR 及 SmGGPPS 基因的植物表达载体的构建。
     （1） 中间载体 pCAMBIAl304+ 的构建 ： 以 pBIl21 和 pCAMBIAl304 为材料， 构建植物表达载体 pCAMBIAl304+。 具体为 HindIII ／ EcoRI 双酶切 pBI121 和 pCAMBIAl304 ； 回收 pBIl21-GUS 表达盒及 pCAMBIAl304 大片段 ； 连 + 接转化， 挑取单克隆菌落抽提质粒酶切验证。结果表明， 植物表达载体 pCAMBIAl304 构建 成功。 （2） 植物表达载体 pCAMBIAl304+-SmGGPPS 的构建 ： 在上述构建成功的 pCAMBIAl304+ 基础上， 用从丹参中克隆到的 SmGGPPS 基因替换 GUS 基因。具体为 BamHI ／ SacI 双酶切 pMD18T-SmGGPPS 和 pCAMBIAl304+ ； 回收 SmGGPPS 基因 + 和 pCAMBIAl304 大片段 ； 连接转化， 挑取单克隆菌落 PCR 筛选阳性克隆 ； 提取质粒进一步酶 切验证。结果表明， SmGGPPS 基因已被成功构建到植物表达载体 pCAMBIAl304+ 中， 从而获得 + 含 SmGGPPS 基因的植物表达载体 pCAMBIAl304 -SmGGPPS 。
     （3） 植物表达载体 pCAMBIAl304+-SmHMGR -SmGGPPS 的构建 ： 以 pCAMBIAl304+-SmGGPPS 为 基 础，使 用 从 丹 参 中 克 隆 的 SmHMGR 基 因 替 换 pCAMBIAl304+-SmGGPPS 上的 GFP +GUS 基因。具体为 BglII ／ BstEII 双酶切 pMD18T-SmHMGR 和 pCAMBIAl304+-SmGGPPS ； 回收 SmHMGR 基因及 pCAMBIAl304+-SmGGPPS 大片段 ； 连接转化， 挑取单克隆菌落 PCR 筛选阳性克隆 ； 提取质粒进一步酶切验证。结果表明， SmHMGR 基因已 + 被成功构建到植物表达载体 pCAMBIAl304 -SmGGPPS 中， 从而获得含 SmHMGR 和 SmGGPPS 的 + 植物表达载体 pCAMBIAl304 -SmHMGR -SmGGPPS 。
     本 实 施 例 将 丹 参 酮 生 物 合 成 途 径 关 键 酶 基 因 SmHMGR 和 SmGGPPS 可 操 作 性 地 连 于 表 达 调 控 序 列， 形 成 含 SmHMGR 和 SmGGPPS 基 因 的 植 物 表 达 载 体 + pCAMBIAl304 -SmHMGR -SmGGPPS ， 该表达载体可用于通过代谢工程策略来提高丹参中丹参 酮含量。
     实施例 3 发根农杆菌介导 SmHMGR 和 SmGGPPS 基因遗传转化丹参获得转基因毛状根。
     （1） 含植物表达载体 pCAMBIAl304+-SmHMGR -SmGGPPS 发根农杆菌工程菌的获得 ； 将 实 施 例 2 中 含 SmHMGR 和 SmGGPPS 基 因 的 植 物 双 价 表 达 载 体
     pCAMBIAl304+-SmHMGR -SmGGPPS 转入发根农杆菌 C58C1 中， 挑取单克隆菌落进行 PCR 验证。 结果表明， 含 SmHMGR 和 SmGGPPS 基因的植物表达载体已成功构建到发根农杆菌菌株 C58C1 中。
     （2） 发根农杆菌介导 SmHMGR ， SmGGPPS 基因遗传转化丹参 ： ①外植体的预培养 ： 剪取丹参健壮无菌苗叶片 (0.5 cm2)， 接种到预培养培养基 (MS) 上， 25℃暗培养 2 d ； ②农杆菌与外植体的共培养 ： 将上述预培养的丹参叶片外植体， 放入含活化好的发根 农杆菌工程菌的 1 ／ 2MS 悬液中浸泡 10 分钟， 轻轻摇晃使外植体与菌液充分接触 ； 取出浸 染后的丹参叶片， 用无菌吸水纸吸干表面菌液， 转到共培养培养基 1 ／ 2 MS 中， 暗培养 3-4 d； ③毛状根的诱导和继代培养 将上述的共培养 3-4 d 的丹参外植体转接到除菌固体培养基 (1 ／ 2 MS+Cef 500 mg ／ L) 中， 25℃暗培养 3 周 ； 外植体伤口处长出毛状根。将已发根的丹参外植体转接到除菌固 体培养基 1 ／ 2 MS+Cef 300 mg ／ L) 上， 25℃暗培养 2 周， 毛状根长至 3 cm 以上， 见图 1。 剪取单一毛状根作为无性系， 继续接种于除菌培养基 1 ／ 2 MS+Cef 100 mg ／ L 中暗培养 两周， 直至无农杆菌溢出。 （3） 转基因丹参毛状根的 PCR 检测。
     ①提取转基因毛状根基因组 DNA ： 采用 CTAB 法提取转基因毛状根基因组 DNA。 剪取除菌完毕的转基因毛状根 5 cm 左右放 入 1.5 ml 离心管中， 加入石英砂， 和 65 ℃预热、 含 1% β 巯基乙醇 CTAB 裂解液 600 μl， 用 研磨棒将材料充分磨碎。 置于 65 ℃水浴锅中 40-50 分钟， 搅拌混匀样品多次， 每次 10 min， 冷却至室温后加入等体积的苯酚， 轻轻颠倒混匀乳化 10 min， 12000 rpm 离心 20 min， 吸取 上清于新 EP 管中， 加入体积比 1:1 的苯酚 / 氯仿溶液， 轻轻混匀， 12000 rpm 离心 20 min。 缓慢吸取上清于新 EP 管中， 再次加入等体积的氯仿混匀， 12000 rpm 离心 20 min， 缓慢吸取 上清于新 EP 管中， 加 2 倍体积的无水乙醇， 析出沉淀。用枪头将沉淀挑到新 EP 管中， 加入 75% 乙醇， 4 ℃洗涤过夜。 次日用 75% 乙醇再洗涤两次， 吸出上清， 室温晾干， 加入 30-50 μl 水溶解沉淀， 用 RNA 酶处理后于 -80 ℃超低温冰箱冻存， 备用。
     ②引物设计及 PCR 检测 ： 分别设计发根位点基因 rol B , 潮霉素磷酸转移酶基因 hpt 的特异 PCR 引物， 在 + pCAMBIAl304 -SmHMGR -SmGGPPS 上启动插入目的基因 SmHMGR 和 SmGGPPS 表达的组成型表达 启动子 CaMV35S 插入基因 SmHMGR 和 SmGGPPS 上分别设计特异性上游及下游引物， 用 PCR 方 法对上述毛状根的总 DNA 进行分子检测。结果表明， 利用上述特异引物， 在一部分转基因毛 + 状根中能检测到和 pCAMBIAl304 -SmHMGR -SmGGPPS 质粒为模板的阳性对照大小相当的 PCR 产物。以 pCAMBIAl304+ 空载体遗传转化丹参所发出的毛状根及野生型丹参植株根的基因 组 DNA 为模板时， 检测不到插入基因 SmHMGR 和 SmGGPPS ， 见图 2。结果说明 SmHMGR ， SmGGPPS 基因已经整合到丹参基因组中。
     本实施例将所述的植物表达载体转化发根农杆菌， 获得用于转化丹参的含 SmHMGR 和 SmGGPPS 基因植物表达载体的发根农杆菌菌株 C58C1， 利用所构建的发根农杆菌菌株遗 传转化丹参细胞， 获得经 PCR 检测为阳性克隆的转基因毛状根。转基因丹参毛状根的获得
     为筛选获得高产丹参酮的毛状根提供了直接素材。
     实施例 4 半定量 RT-PCR 检测转基因丹参毛状根中 SmHMGR 和 SmGGPPS 基因的表达。
     （1） 毛状根液体培养， 见图 3 ： 选择实施例 3 中生长快、 分枝好的毛状根， 在超净工作台上剪取 2-3 cm 用无菌蒸馏水 冲洗掉其表面上的琼脂后接入装有 200ml 1 ／ 2 MS 液体培养基的培养瓶中， 100 rpm， 25 ℃黑暗下培养， 每 20 天更换新鲜 1 ／ 2 MS 液体培养基继代一次， 80 天后收获。取新鲜毛状 根， 用吸水纸吸干表面水分， 用锡箔纸包好浸入液氮中冷冻， 保存于 -80 ℃用于 RNA 提取， 其余毛状根烘干后用于丹参酮含量提取。
     （2） 引物的设计和合成 ： 根据丹参酮生物合成代谢途径关键酶基因 SmHMGR 和 SmGGPPS 的编码序列分别设计引 物， 用于检测丹参毛状根中总的 SmHMGR 和 SmGGPPS 基因的表达情况， SmHMGR ， SmGGPPS 为丹 参来源基因。通过在 SmHMGR 和 SmGGPPS 的 3’ 编码序列分别设计一个下游引物和目的基因 上的上游引物配对， 检测内源基因的表达情况， 转入的外源基因仅是基因的编码框序列， 不 带有 5’ 及 3’ 非编码序列， 看家基因 18S rRNA 用来作为内参。引物由上海生工生物工程公 司合成。
     （3） RNA 的提取及 cDNA 第一链的合成 ： 方法同实施例 1 中的 （1） 。
     （4） 半定量 RT-PCR 检测 SmHMGR ， SmGGPPS 及看家基因 18S rRNA 基因的表达 ： 以相同量的上述 cDNA 第一链为模板， 分别用上述设计的引物进行 PCR 扩增。PCR 反应 体系如下 ： MilliQ 15.75 μl dNTP（2mM） 2.5 μl 2+ 10×Buffer（Mg -） 2.5 μl 2+ Mg 1.5 μl F 上游引物 1μl R 下游引物 1μl 模板 0.5μl Taq 酶 0.25μl 总体积 25μl。
     PCR 反应条件 ： 94 ℃ 10 min， 30 个循环， 94 ℃变性 45 sec， 55 ℃退火 60 sec， 72 ℃延伸 100 sec， 72 ℃ 10 min。看家基因 18SrRNA 基因检测的 PCR 反应条件， 将循环数 改为 20 个。结果显示， SmHMGR ， SmGGPPS 基因在转入相应基因的毛状根克隆中都过量表达， 强于其在对照组中的表达， 但不同克隆之间的表达量有一定的差异， 见图 4。
     本实施例采用半定量 RT-PCR 技术测定转基因丹参毛状根中 SmHMGR ， SmGGPPS 基因 的表达情况， 为分析 SmHMGR ， SmGGPPS 基因在丹参酮合成过程中所起的作用提供依据。
     实施例 5 利用 HPLC 测定转基因丹参毛状根中丹参酮含量。
     （1） 色谱条件及标准品贮备液的配制 ： 色谱柱为 C-18 反相硅胶柱， 流动相为乙腈 ： 水 （65 ： 35） ， 检测波长 270nm， 柱温 30 ℃，流速 1 ml ／ min， 进样量 20 μl ； 精密称取隐丹参酮， 丹参酮Ⅰ， 丹参酮Ⅱ A 标准品， 分别配置成浓度为 36μg/ml， 36μg/ml， 22μg/ml 标准品贮备液， -20 ℃保存备用。
     （2） 标准曲线的制作 ： 本发明中流动相乙腈 ： 水在体积比 65 ： 35 时， 隐丹参酮， 丹参酮Ⅰ， 丹参酮Ⅱ A 的保留 时间分别为 18.90 min, 20.53 min 和 34.00 min， 三种丹参酮成分完全分离， 且峰型良好。 将上述标准品贮备液品分别取 5 ul， 10 ul， 20 ul， 30 ul， 40 ul 在相应色谱条件下进样， 记 录图谱及色谱参数， 分别以峰面积 (Y) 对标准品浓度 (X， μg/ml) 进行回归分析。结果表 明， 隐丹参酮在 9-72ug ／ ml、 丹参酮Ⅰ在 9-72μg ／ ml、 丹参酮Ⅱ A 在 5.5-44μg ／ ml 范 围内呈现良好的线性关系。
     （3） 转基因毛状根丹参酮含量的提取及测定 ： 将实例 4 中获取并烘干的转基因丹参毛状根放入研钵中充分研磨， 取 200mg 毛状根干 粉加入体积比 3 ： 1 的甲醇、 二氯甲烷溶液 16ml ； 超声波提取 60min ； 室温放置过夜 ； 次日拿 出离心 12000rpm， 10 min ； 吸取上清萃取液真空干燥。残余物重新用 1ml 的色谱甲醇 ： 二氯 甲烷 （3:1） 混合液体溶解 ； 样品用 0.22μM 的滤膜过滤后各取 20 μl， 注入高效液相色谱 仪， 记录各组分峰面积， 代入线性回归方程， 计算得样品丹参酮含量。 本发明中共转 SmHMGR 及 SmGGPPS 基因的毛状根中所检测的隐丹参酮， 丹参酮Ⅰ， 丹参酮Ⅱ A 三种丹参酮含量与对照组相比显著提高， 其中丹参酮Ⅱ A 的含量提高最为明 显。共转 SmHMGR 和 SmGGPPS 基因的丹参转基因毛状根总丹参酮的平均含量为 1.815 mg ／ g DW， 对照组毛状根 0.475 mg ／ g DW， 为 3.82 倍。其中隐丹参酮平均含量为 0.324 mg ／ g DW， 丹参酮Ⅰ含量为 0.787 mg ／ g DW， 丹参酮Ⅱ A 含量为 0.704 mg ／ g DW， 对照组毛 状根的平均含量分别为 0.194 mg ／ g DW， 0.149 mg ／ g DW， 0.132 mg ／ g DW。转基因毛 状根和对照组毛状根相比较， 分别为 1.67 倍、 5.28 倍、 和 5.33 倍， 见图 5。在所测试的共转 SmHMGR 和 SmGGPPS 基因丹参毛状根株系中， 9 号克隆 （HG9） 丹参酮含量最高， 其隐丹参酮， 丹参酮Ⅰ， 丹参酮Ⅱ A 及总丹参酮含量分别为 0.315 mg ／ g DW， 1.196 mg ／ g DW， 1.215 mg ／ g DW， 2.727 mg ／ g DW。分别是对照组的 1.62 倍， 8.03 倍， 9.20 倍和 5.74 倍。
     本实施例采用 HPLC 法测定了转基因丹参毛状根丹参酮含量。结果表明共转 SmHMGR 和 SmGGPPS 基因的丹参毛状根总丹参酮含量比对照组显著提高， 其中丹参酮Ⅱ A 含 量提高的最为明显。
     实施例 6 DPPH 清除自由基法测定转基因毛状根中丹参酮的抗氧化活性， 见图 6。
     （1） 样品溶液制备 ： 将样品稀释成浓度梯度 ： 0.25 μg/ml， 0.5 μg/ml， 1 μg/ml， 2 μg/ml， 4 μg/ml 的 甲醇溶液各 1 ml ； 加入 1， 1- 二苯基苦基苯肼 DPPH 溶液 1ml 和 0.2 mM 的甲醇溶液作为自 由基来源， 在 25℃下保温 30min。
     （2） 样品的吸光度测定及 DPPH 自由基清除活性的换算 ： 将梯度浓度样品分别在分光光度计下 517 nm 测定并记录其吸收值， 根据下面的公式将 吸光度值转换成 DPPH 自由基清除活性 ： DPPH 自由基清除活性 （%） =[(A0-A1)/A0×100]
     A0 是对照样品吸光度值 ； A1 是样品或标准品吸光度值。
     （3） DPPH 自由基清除活性能力的比较 ： IC50 为 50% 抑制浓度， 即清除该样品中一半的 DPPH 自由基所需该样品中活性成分的浓 度， 半数抑制是衡量样品中活性成分灵敏度指标， 半数抑制越低 , 说明其灵敏度越高， 清除 DPPH 自由基能力越强， 抗氧化能力亦越强。
     结果表明 ： DPPH 自由基清除活性计算出样品 HG9 及对照组的 IC50 分别为 0.3045， 0.3049 μg/ml， 差异不明显。但样品 HG9 的总丹参酮含量比对照组高 5.74 倍， 结论为样品 HG9 丹参酮的总抗氧化活性显著高于对照组。
     本实施例证明了通过转基因方法获得的丹参毛状根中的单位丹参酮的抗氧化能 力和对照相当， 因此通过本发明方法获得高含量丹参酮的丹参毛状根是可行的。
     本发明采用共转SmHMGR, SmGGPPS 基因的代谢工程策略获得了高产丹参酮的丹参 转基因毛状根株系， 为规模化生产丹参酮， 缓解丹参酮的药源紧缺提供了一种新的有效方 法。
     以上所述本发明的实施例， 并不用于限制本发明， 对于本领域的技术人员来说， 本 发明可以有更改和变化。凡在本发明的原则之内， 所作的任何修改、 改进等， 均应包括在本 发明的保护范围之内。