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1、10申请公布号CN101953304A43申请公布日20110126CN101953304ACN101953304A21申请号201010511065422申请日20101019A01H4/0020060171申请人赵国平地址322000浙江省义乌市江东街道徐村村10组72发明人赵国平54发明名称美洲狼尾草快速繁殖方法及美洲狼尾草快速脱毒繁殖方法57摘要本发明涉及一种美洲狼尾草快速繁殖方法及美洲狼尾草快速脱毒繁殖方法，包括外植体的取材及灭菌、接种进行一次成苗培养、生根培养、炼苗移栽、脱毒检测等步骤。建立的美洲狼尾草脱毒组培快繁技术体系，脱毒效果好，其生根率达100，移栽成活率达95以上，适合工。
2、厂化育苗，可商品化生产，适用于美洲狼尾草种苗工厂化快速繁殖，从而大大节省了传统方法的繁种用地。为大量工厂化育苗，提供了有力的保障。51INTCL19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书3页说明书5页CN101953304A1/3页21一种美洲狼尾草快速繁殖方法，包括外植体的取材及灭菌、接种进行一次成苗培养、生根培养、炼苗移栽步骤，其特征在于1外植体的取材及灭菌步骤取美洲狼尾草茎尖顶部或幼嫩心叶，作为脱毒组培用外植体；用质量浓度为75的乙醇溶液浸泡30S后再用另一份质量浓度为75的乙醇溶液浸泡60S，然后用无菌水冲洗35次，再用质量浓度为01的氯化汞溶液消毒510MIN，然后用。
3、无菌水冲洗35次；2诱导培养步骤在无菌条件下，将消毒好的外植体切成1个顶芽或腋芽、且长度为12CM的茎段，接种于诱导培养基上，置于2025的黑暗条件下培养5天，然后转入光照条件培养，温度为2023、湿度为6065、光照强度为7080MOLCM2S1、每天光照1214H的条件下培养至无菌芽生长长度为115CM；3继代培养步骤将增生的无菌芽一起转接于继代培养基中，在温度为2528、湿度为7080、光照强度为4060MOLCM2S1、每天光照1618H的条件下培养至无菌芽生长长度为25CM即为微枝苗；4壮苗培养步骤将每个微枝苗接种于壮苗培养基中，在温度为2528、湿度为7080、光照强度为4060M。
4、OLCM2S1、每天光照1618H的条件下培养至微枝生长长度为68CM；5生根培养步骤将增壮后的微枝切割成带有1个顶芽或12个腋芽、且长度为12CM的茎段，然后逐段接种于生根培养基进行生根培养；6炼苗移栽步骤将生根培养30天且根系达23CM的完整小苗，进行炼苗移栽。2根据权利要求1所述的一种美洲狼尾草快速繁殖方法，其特征在于其中步骤2中诱导培养基是以改良1/2MS固体培养基为基本培养基，且还包含0305MG/L的KT、003005MG/L的IAA、30004000MG/L的卡拉胶和质量浓度为1520的白砂糖，培养基PH值为5055；步骤3中继代培养基是以改良MS固培养基为基本培养基，且还包含0。
5、0501MG/L的6BA、001005MG/L的NAA和质量浓度为2025的蔗糖，培养基PH值为5660；步骤4中壮苗培养基是以MS固培养基为基本培养基，且还包含质量浓度为2025的蔗糖，培养基PH值为5660；步骤5中生根培养基是以改良1/4MS固培养基为基本培养基，培养基且还包含0515MG/L的NAA，125MG/L的IBA和质量浓度为2025的白砂糖，培养基PH值为5660；步骤6中生根基质按质量比为50的草炭土、25的蛭石和25的珍珠岩组成，生根基质含水量为3040。3一种美洲狼尾草快速脱毒繁殖方法，包括外植体的取材及灭菌、接种进行一次成苗培养、生根培养、炼苗移栽、脱毒检测等步骤，其。
6、特征在于1外植体的取材及灭菌步骤取美洲狼尾草茎尖顶部或幼嫩心叶，作为脱毒组培用外植体；用质量浓度为75的乙醇溶液浸泡30S后再用另一份质量浓度为75的乙醇溶液浸泡60S，然后用无菌水冲洗35次，再用质量浓度为01的氯化汞溶液消毒510MIN，然后用无菌水冲洗35次；2诱导培养步骤在无菌条件下，将消毒好的外植体切成1个顶芽或腋芽、且长度为12CM的茎段，接种于诱导培养基上，置于2025的黑暗条件下培养5天，然后转入光照条件培养，温度为2023、湿度为6065、光照强度为7080MOLCM2S1、每天光照1214H的条件下培养至无菌芽生长长度为115CM；权利要求书CN101953304A2/3页。
7、33继代培养步骤将增生的无菌芽一起转接于继代培养基中，在温度为2528、湿度为7080、光照强度为4060MOLCM2S1、每天光照1618H的条件下培养至无菌芽生长长度为25CM即为微枝苗；4壮苗培养步骤将每个微枝苗接种于壮苗培养基中，在温度为2528、湿度为7080、光照强度为4060MOLCM2S1、每天光照1618H的条件下培养至微枝生长长度为68CM；5生根培养步骤将增壮后的微枝切割成带有1个顶芽或12个腋芽、且长度为12CM的茎段，然后逐段接种于生根培养基进行生根培养；6炼苗移栽步骤将生根培养30天且根系达23CM的完整小苗，进行炼苗移栽；7病毒ELISA检测将田间病株所携带的花叶。
8、病毒FRITILLARYMOSAICVIRUS，FMV和Y病毒FRITILLARYVIRUSY，FVY，经扩增、克隆和原核表达后，所获得的大量相关病毒外壳蛋白，制备成病毒特异性抗血清后，对美洲狼尾草组培成苗进行病毒ELISA检测。4根据权利要求3所述的一种美洲狼尾草快速脱毒繁殖方法，其特征在于其中步骤2中诱导培养基是以改良1/2MS固体培养基为基本培养基，且还包含0305MG/L的KT、003005MG/L的IAA、30004000MG/L的卡拉胶和质量浓度为1520的白砂糖，培养基PH值为5055；步骤3中继代培养基是以改良MS固培养基为基本培养基，且还包含00501MG/L的6BA、001。
9、005MG/L的NAA和质量浓度为2025的蔗糖，培养基PH值为5660；步骤4中壮苗培养基是以MS固培养基为基本培养基，且还包含质量浓度为2025的蔗糖，培养基PH值为5660；步骤5中生根培养基是以改良1/4MS固培养基为基本培养基，培养基且还包含0515MG/L的NAA，125MG/L的IBA和质量浓度为2025的白砂糖，培养基PH值为5660；步骤6中生根基质按质量比为50的草炭土、25的蛭石和25的珍珠岩组成，生根基质含水量为3040。5一种美洲狼尾草快速脱毒繁殖方法，包括外植体的取材及灭菌、接种进行一次成苗培养、生根培养、炼苗移栽等步骤，其特征在于1外植体的取材及灭菌步骤取美洲狼尾。
10、草茎尖顶部或幼嫩心叶，作为脱毒组培用外植体；用质量浓度为75的乙醇溶液浸泡30S后再用另一份质量浓度为75的乙醇溶液浸泡60S，然后用无菌水冲洗35次，再用质量浓度为01的氯化汞溶液消毒510MIN，然后用无菌水冲洗35次；2诱导培养步骤在无菌条件下，将消毒好的外植体切成1个顶芽或腋芽、且长度为12CM的茎段，接种于诱导培养基上，置于2025的黑暗条件下培养5天，然后转入光照条件培养，温度为2023、湿度为6065、光照强度为7080MOLCM2S1、每天光照1214H的条件下培养至无菌芽生长长度为115CM；3继代培养步骤将增生的无菌芽一起转接于继代培养基中，在温度为2528、湿度为7080。
11、、光照强度为4060MOLCM2S1、每天光照1618H的条件下培养至无菌芽生长长度为25CM即为微枝苗；4壮苗培养步骤将每个微枝苗接种于壮苗培养基中，在温度为2528、湿度为7080、光照强度为4060MOLCM2S1、每天光照1618H的条件下培养至微枝生长长度为68CM；权利要求书CN101953304A3/3页45生根培养步骤将增壮后的微枝切割成带有1个顶芽或12个腋芽、且长度为12CM的茎段，然后逐段接种于生根培养基进行生根培养；6炼苗移栽步骤将生根培养30天且根系达23CM的完整小苗，进行炼苗移栽；将小苗周围的生根基质压实并在生根基质表面和微枝叶面上略喷水，然后覆上保鲜膜在培养室内。
12、培养；每天以喷洒的方式浇水5次/周，每天早晚揭膜6MIN通风换气，7天后去膜，培养7天；7病毒ELISA检测将田间病株所携带的花叶病毒FRITILLARYMOSAICVIRUS，FMV和Y病毒FRITILLARYVIRUSY，FVY，经扩增、克隆和原核表达后，所获得的大量相关病毒外壳蛋白，制备成病毒特异性抗血清后，对美洲狼尾草组培成苗进行病毒ELISA检测；其中步骤2中诱导培养基是以改良1/2MS固体培养基为基本培养基，且还包含0305MG/L的KT、003005MG/L的IAA、30004000MG/L的卡拉胶和质量浓度为1520的白砂糖，培养基PH值为5055；步骤3中继代培养基是以改良M。
13、S固培养基为基本培养基，且还包含00501MG/L的6BA、001005MG/L的NAA和质量浓度为2025的蔗糖，培养基PH值为5660；步骤4中壮苗培养基是以MS固培养基为基本培养基，且还包含质量浓度为2025的蔗糖，培养基PH值为5660；步骤5中生根培养基是以改良1/4MS固培养基为基本培养基，培养基且还包含0515MG/L的NAA，125MG/L的IBA和质量浓度为2025的白砂糖，培养基PH值为5660。权利要求书CN101953304A1/5页5美洲狼尾草快速繁殖方法及美洲狼尾草快速脱毒繁殖方法技术领域0001本发明属于植物组织培养技术领域，更具体涉及一种美洲狼尾草组培脱毒成苗的。
14、快速繁殖的方法。背景技术0002狼尾草为国家审定品种，具有产草量高、抗逆性强、品质好、耐刈割和全生育期无明显病虫危害的特点，是草食畜禽的优质青饲料和理想的水土保持作物。近年来，随着杂交狼尾草优质纸浆、中密度纤维板生产技术和作为生物质能源转化技术的不断完善，对杂交狼尾草的需求量正在迅速增加。但在品种大面积推广应用时，发现杂交狼尾草有一定比例的杂株，明显影响杂种优势的发挥及利用，究其原因与纯度有关。狼尾草常遭受病毒侵害，使品质变劣，产量下降，同时也加速了品种退化。有关美洲狼尾草技术快速脱毒繁殖技术尚未见正式报道。0003组织培养是一种高效的繁殖技术，采用幼嫩心叶或茎尖分生组织培养，也是获得无病种苗。
15、的有效途径。传统的美洲狼尾草组培快繁方法，愈伤组织诱导及分化的继代次数多，变异率较高，操作繁琐，污染机率大；腋芽培养和茎尖生长锥培养可有效地降低变异率，但需经历小苗与丛生苗诱导、增殖培养和生根培养等多次继代。上述两条途径通常要对材料进行至少几个月的培养，才可分化出苗，耗时长，效率低。因此，迫切需要技术方法上的改进革新，以节约资源消耗，提高美洲狼尾草组培效率，为真正实现GAP栽培和规模化生产提供技术平台，具有较大的应用前景发明内容0004有鉴于此，本发明所要解决的技术问题是针对现有技术中狼尾草常遭受病害侵害，使品质变劣，产量下降，品种退化的缺点，提供一种能大量、快速繁殖美洲狼尾草，又能脱除所带病。
16、毒并经特异检测，以确保无毒脱毒、组培与检测的配套方法。使美洲狼尾草实现从幼嫩心叶和茎尖诱导愈伤组织到分化成完整或半完整的小苗，达到快速高效，操作简化，降低变异率，节约成本的目的，为大量生产美洲狼尾草脱毒组培苗奠定良好的基础。0005为了达到上述目的，本发明采用如下技术方案来实现的0006一种美洲狼尾草快速繁殖方法，包括外植体的取材及灭菌、接种进行一次成苗培养、生根培养、炼苗移栽步骤，其特征在于00071外植体的取材及灭菌步骤取美洲狼尾草茎尖顶部或幼嫩心叶，作为脱毒组培用外植体；用质量浓度为75的乙醇溶液浸泡30S后再用另一份质量浓度为75的乙醇溶液浸泡60S，然后用无菌水冲洗35次，再用质量浓。
17、度为01的氯化汞溶液消毒510MIN，然后用无菌水冲洗35次；00082诱导培养步骤在无菌条件下，将消毒好的外植体切成1个顶芽或腋芽、且长度为12CM的茎段，接种于诱导培养基上，置于2025的黑暗条件下培养5天，然后转入光照条件培养，温度为2023、湿度为6065、光照强度为7080MOLCM2S1、说明书CN101953304A2/5页6每天光照1214H的条件下培养至无菌芽生长长度为115CM；00093继代培养步骤将增生的无菌芽一起转接于继代培养基中，在温度为2528、湿度为7080、光照强度为4060MOLCM2S1、每天光照1618H的条件下培养至无菌芽生长长度为25CM即为微枝苗；。
18、00104壮苗培养步骤将每个微枝苗接种于壮苗培养基中，在温度为2528、湿度为7080、光照强度为4060MOLCM2S1、每天光照1618H的条件下培养至微枝生长长度为68CM；00115生根培养步骤将增壮后的微枝切割成带有1个顶芽或12个腋芽、且长度为12CM的茎段，然后逐段接种于生根培养基进行生根培养；00126炼苗移栽步骤将生根培养30天且根系达23CM的完整小苗，进行炼苗移栽。0013一种美洲狼尾草快速脱毒繁殖方法，包括外植体的取材及灭菌、接种进行一次成苗培养、生根培养、炼苗移栽等步骤，其特征在于00141外植体的取材及灭菌步骤取美洲狼尾草茎尖顶部或幼嫩心叶，作为脱毒组培用外植体；用。
19、质量浓度为75的乙醇溶液浸泡30S后再用另一份质量浓度为75的乙醇溶液浸泡60S，然后用无菌水冲洗35次，再用质量浓度为01的氯化汞溶液消毒510MIN，然后用无菌水冲洗35次；00152诱导培养步骤在无菌条件下，将消毒好的外植体切成1个顶芽或腋芽、且长度为12CM的茎段，接种于诱导培养基上，置于2025的黑暗条件下培养5天，然后转入光照条件培养，温度为2023、湿度为6065、光照强度为7080MOLCM2S1、每天光照1214H的条件下培养至无菌芽生长长度为115CM；00163继代培养步骤将增生的无菌芽一起转接于继代培养基中，在温度为2528、湿度为7080、光照强度为4060MOLCM。
20、2S1、每天光照1618H的条件下培养至无菌芽生长长度为25CM即为微枝苗；00174壮苗培养步骤将每个微枝苗接种于壮苗培养基中，在温度为2528、湿度为7080、光照强度为4060MOLCM2S1、每天光照1618H的条件下培养至微枝生长长度为68CM。00185生根培养步骤将增壮后的微枝切割成带有1个顶芽或12个腋芽、且长度为12CM的茎段，然后逐段接种于生根培养基进行生根培养；00196炼苗移栽步骤将生根培养30天且根系达23CM的完整小苗，进行炼苗移栽；00207病毒ELISA检测将田间病株所携带的花叶病毒FRITILLARYMOSAICVIRUS，FMV和Y病毒FRITILLARYV。
21、IRUSY，FVY，经扩增、克隆和原核表达后，所获得的大量相关病毒外壳蛋白，制备成病毒特异性抗血清后，对美洲狼尾草组培成苗进行病毒ELISA检测。0021其中步骤2中诱导培养基是以改良1/2MS固体培养基为基本培养基，且还包含0305MG/L的KT、003005MG/L的IAA、30004000MG/L的卡拉胶和质量浓度为1520的白砂糖，培养基PH值为5055；步骤3中继代培养基是以改良MS固培养基为基本培养基，且还包含00501MG/L的6BA、001005MG/L的NAA和质量浓度为2025的蔗糖，培养基PH值为5660；步骤4中壮苗培养基是以MS固培养基为基本培养基，且还包含质量浓度为。
22、2025的蔗糖，培养基PH值为5660；步骤5中生根培养基是以改良1/4MS固培养基为基本培养基，培养基且还包含0515MG/L说明书CN101953304A3/5页7的NAA，125MG/L的IBA和质量浓度为2025的白砂糖，培养基PH值为5660；步骤6中生根基质按质量比为50的草炭土、25的蛭石和25的珍珠岩组成，生根基质含水量为3040。0022由上述技术方案可知，本发明的有益效果是0023利用美洲狼尾草幼嫩心叶和茎尖产生少量的胚性愈伤组织分化成再生植株，有效地避免了愈伤加繁过程中，变异的出现，更好地保持了原有材料的种性；0024建立的美洲狼尾草病毒FMV和FVY外壳蛋白基因RTPC。
23、R扩增、克隆、原核表达及高灵敏度ELISA检测体系，通过该检测技术应用，可保证脱毒美洲狼尾草中无病毒存在，为进一步控制病毒病发生传播，美洲狼尾草品种提纯复壮奠定了基础；0025建立的美洲狼尾草脱毒组培快繁技术体系，脱毒效果好，其生根率达100，移栽成活率达95以上，适合工厂化育苗，可商品化生产，适用于美洲狼尾草种苗工厂化快速繁殖，从而大大节省了传统方法的繁种用地。为大量工厂化育苗，提供了有力的保障。具体实施方式0026为了使本领域技术人员能更进一步了解本发明的特征及技术内容，通过以下实施例对本发明作进一步的详细说明。0027实施例一00281外植体的取材及灭菌步骤于5月份，晴好天气，取美洲狼尾。
24、草茎尖顶部，作为脱毒组培用外植体；用质量浓度为75的乙醇溶液浸泡30S后再用另一份质量浓度为75的乙醇溶液浸泡60S，然后用无菌水冲洗3次，再用质量浓度为01的氯化汞溶液消毒5MIN，然后用无菌水冲洗3次；00292诱导培养步骤在无菌条件下，将消毒好的外植体切成1个顶芽或腋芽、且长度为1CM的茎段，接种于一次成苗培养基上，保持茎段形态学上端向上的方式将茎段垂直插入培养基中，置于20的黑暗条件下培养5天，然后转入光照条件培养，温度为20、湿度为60、光照强度为70MOLCM2S1、每天光照12H的条件下培养至无菌芽生长长度为1CM；00303继代培养步骤将增生的无菌芽一起转接于继代培养基中，在温。
25、度为25、湿度为70、光照强度为40MOLCM2S1、每天光照16H的条件下培养至无菌芽生长长度为2CM，即为微枝苗；00314壮苗培养步骤将每个微枝苗接种于壮苗培养基中，在温度为25、湿度为70、光照强度为40MOLCM2S1、每天光照16H的条件下培养至微枝生长长度为4CM；00325生根培养步骤将增壮后的微枝切割成带有1个顶芽或12个腋芽、且长度为1CM的茎段，然后逐段接种于生根培养基进行生根培养；00336炼苗移栽步骤将生根培养30天且根系达2CM的完整小苗，进行炼苗移栽；将成苗周围的生根基质压实并在生根基质表面和微枝叶面上略喷水，然后覆上保鲜膜在培养室内培养；每天以喷洒的方式浇水5次。
26、/周，每天早晚揭膜6MIN通风换气，7天后去膜，培养7天；00347病毒ELISA检测将田间病株所携带的花叶病毒FRITILLARYMOSAICVIRUS，FMV，经扩增、克隆和原核表达后，所获得的大量相关病毒外壳蛋白，制备成病毒特异性抗说明书CN101953304A4/5页8血清后，对美洲狼尾草组培成苗进行病毒ELISA检测。0035其中步骤2中诱导培养基是以改良1/2MS固体培养基为基本培养基，且还包含03MG/L的KT、003MG/L的IAA、3000MG/L的卡拉胶和质量浓度为15的白砂糖，PH值为50；步骤3中继代培养基是以改良MS固培养基为基本培养基，且还包含005MG/L的6BA。
27、、001MG/L的NAA和质量浓度为20的蔗糖，PH值为56；步骤4中壮苗培养基是以MS固培养基为基本培养基，且还包含质量浓度为20的蔗糖，PH值为56；步骤5中生根培养基是以改良1/4MS固培养基为基本培养基，且还包含05MG/L的NAA，1MG/L的IBA和质量浓度为20的白砂糖，PH值为56；步骤6中生根基质按质量比为50的草炭土、25的蛭石和25的珍珠岩组成，生根基质含水量为30。0036实施例二00371外植体的取材及灭菌步骤于10月份，晴好天气，取美洲狼尾草幼嫩心叶，作为脱毒组培用外植体；用质量浓度为75的乙醇溶液浸泡30S后再用另一份质量浓度为75的乙醇溶液浸泡60S，然后用无菌。
28、水冲洗5次，再用质量浓度为01的氯化汞溶液消毒10MIN，然后用无菌水冲洗5次；00382诱导培养步骤在无菌条件下，将消毒好的外植体切成1个顶芽或腋芽、且长度为2CM的茎段，接种于一次成苗培养基上，保持茎段形态学上端向上的方式将茎段垂直插入诱导培养基中，置于25的黑暗条件下培养5天，然后转入光照条件培养，温度为23、湿度为65、光照强度为80MOLCM2S1、每天光照14H的条件下培养至无菌芽生长长度为15CM；00393继代培养步骤将增生的无菌芽一起转接于继代培养基中，在温度为28、湿度为80、光照强度为60MOLCM2S1、每天光照18H的条件下培养至无菌芽生长长度为5CM，即为微枝苗；0。
29、0404壮苗培养步骤将每个微枝苗接种于壮苗培养基中，在温度为28、湿度为80、光照强度为60MOLCM2S1、每天光照18H的条件下培养至微枝生长长度为6CM；00415生根培养步骤将增壮后的微枝切割成带有1个顶芽或2个腋芽、且长度为2CM的茎段，然后逐段接种于生根培养基进行生根培养；00426炼苗移栽步骤将生根培养30天且根系达3CM的完整小苗，进行炼苗移栽；将成苗周围的生根基质压实并在生根基质表面和微枝叶面上略喷水，然后覆上保鲜膜在培养室内培养；每天以喷洒的方式浇水3次/周，每天早晚揭膜610MIN通风换气，10天后去膜，培养10天；00437病毒ELISA检测将田间病株所携带的Y病毒FR。
30、ITILLARYVIRUSY，FVY，经扩增、克隆和原核表达后，所获得的大量相关病毒外壳蛋白，制备成病毒特异性抗血清后，对美洲狼尾草组培成苗进行病毒ELISA检测。0044其中步骤2中诱导培养基是以改良1/2MS固体培养基为基本培养基，且还包含05MG/L的KT、005MG/L的IAA、4000MG/L的卡拉胶和质量浓度为20的白砂糖，PH值为55；步骤3中继代培养基是以改良MS固培养基为基本培养基，且还包含01MG/L的6BA、005MG/L的NAA和质量浓度为25的蔗糖，PH值为60；步骤4中壮苗培养基是以MS固培养基为基本培养基，且还包含质量浓度为25的蔗糖，PH值为60；步骤5中生根培。
31、养基是以改良1/4MS固培养基为基本培养基，且还包含15MG/L的NAA，125MG/说明书CN101953304A5/5页9L的IBA和质量浓度为25的白砂糖，PH值为60；步骤6中生根基质按质量比为50的草炭土、25的蛭石和25的珍珠岩组成，生根基质含水量为3040。0045采用本发明的技术方案，4050天左右即可得到带有少量根系的株高约35CM的瓶苗，5070天左右，获得带根的美洲狼尾草完整小苗。一段美洲狼尾草梢部经5070天时间可繁殖出100200株种苗，利用本发明简化了美洲狼尾草组培苗生产的程序，节约成本，成苗率高，显著缩短了美洲狼尾草组培苗的生产周期。0046但以上所述仅为本发明的较佳可行实施例，并非用以局限本发明的专利范围，故凡运用本发明说明书内容所作的等效结构变化，均同理包含在本发明的范围内。说明书。