植物血凝素长效剂型的制备方法 【技术领域】
本发明属于生物药物的制备技术，特别涉及一种植物血凝素长效剂型的制备方法。
背景技术
植物血凝素多数是指从菜豆属(Phaseolus Vulgaris)如红芸豆(Redkidney bean)和金雀花(P.Communis)中提取的凝集素。提纯后蛋白质含量较高，它具有凝集红血球，促进淋巴细胞的分化、成熟和分裂的作用。植物血凝素为广谱抗病毒和免疫调节药植物血凝素主要为D-甘露糖、氨基葡萄糖酸衍生物所构成的低聚糖辅基与蛋白质的复合物，属于高分子糖蛋白类物质。植物血凝素具有抗病毒、促进细菌感染的恢复以及调节机体免疫功能等达到紧急防治动物疫病作用。适用于猪、牛、羊、鸡、鸭、鹅、鸽等畜禽由于各种病毒感染后的早期治疗和潜伏期感染阶段的紧急预防，如口蹄疫病毒、猪瘟病毒、圆环病毒、病毒性腹泻病毒、痘病毒、新城疫病毒、传染性鸭肝炎病毒、法氏囊病毒、小鹅瘟病毒，传染性支气管炎病毒、流行性感冒病毒、鹅副粘病毒等早期感染的治疗。
目前，植物血凝素都是以注射的途径给药，通常有较好的治疗效果，但多者每天需要注射1-2次，连用2-5天，给养殖业主的使用带来很多不便，因此将其制成长效剂型便成为人们追求的目标。已有的植物血凝素存在需要长期频繁注射、使用不便、生物利用度低以及药物使用量大等缺陷。
因此，提供一种植物血凝素长效剂型的制备方法，有效预防和治疗各种畜、禽病毒性疾病，是该技术领域科研人员急需开发的新课题之一。
【发明内容】
本发明的目的是为克服已有技术的不足之处，提供一种制备简单、应用方便、效果显著的植物血凝素长效剂型的制备方法。
一种植物血凝素长效剂型的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)将一定量的植物血凝素溶解在含有稳定剂的PBS缓冲溶液，制成水相溶液(W1)，植物血凝素的含量为0.5-50毫克/毫升；
(2)将丙交脂/乙交脂共聚物用二氯甲烷溶解制成油相溶液(O)，丙交脂/乙交脂共聚物的含量为0.1-0.5克/毫升；将上述含植物血凝素的水相溶液(W1)加入到油相溶液(O)中，油相溶液(O)与水相溶液(W1)的比例为20∶1至2∶1，使这两种溶液在温度5-30℃下搅拌混合均匀，制成初乳W1/O，在4-10℃下保存；
(3)将聚乙烯醇充分溶解于水制成水相溶液(W2)，聚乙烯醇的重量浓度为0.5-50％；将上述初乳W1/O加入到水相溶液(W2)搅拌均匀，初乳W1/O与水相溶液(W2)的比例为1∶50至1∶200，制成复乳W1/O/W2，在4-10℃下保存；
(4)将复乳W1/O/W2转移到NaCl水溶液中，搅拌均匀，使有机溶剂挥发，然后离心收集微球；
(5)所述步骤(2)中的搅拌温度为5-30℃，搅拌速度为500-8000转/分，搅拌时间为0.02-0.2小时；
(6)所述步骤(3)中的搅拌温度为5-30℃，搅拌速度为100-3000转/分，搅拌时间为0.2-0.5小时；
(7)所述步骤(4)中的搅拌温度为5-30℃，搅拌速度为500-3000转/分，搅拌时间为0.2-0.5小时；
(8)为了保持溶液的稳定，加入一定量的稳定剂，稳定剂直接加入到所述制备步骤(1)溶液中。
所述稳定剂选自海藻糖、牛血清白蛋白和聚乙二醇的一种或一种以上。
所述稳定剂的加入量为最终溶液的0.1％-10％。
本发明方法的有益效果是：该注射用植物血凝素长效剂型能够减少植物血凝素用药次数，是一种理想的植物血凝素长效剂型。具有制备工艺简单，容易实现，应用方便，所需成本低等特点，该方法采用毒性小，注射安全的分散剂及油相等材料，使植物血凝素均匀的分散溶解到油相中，最终成为一种植物血凝素的长效剂型。采用该方法制成的植物血凝素的长效剂型体外实验表明，用畜、禽扰素为包裹对象，所制得的植物血凝素微球形态圆整，粒度分布均匀，粒径分布在40微米以下，载药量可达6.0％以上，包封率在30.0％以上，体外缓释可以达4周释药，符合长效制剂特征。一次注射后能够在较长时间内发挥抗病毒药效。将植物血凝素做成微球制剂，可以延长药物作用时间，大大提高药物疗效和经济效益。
【具体实施方式】
以下结合实施例，对依据本发明提供的具体实施方式详述如下：
实施例1
一种植物血凝素长效剂型的制备方法，其特征在于具体实施步骤如下：
(1)将70.0毫克植物血凝素溶解在1.0毫升含有2％的聚乙二醇4000的PBS缓冲溶液，制成水相溶液(W1)；
(2)将900.0毫克丙交脂/乙交脂共聚物溶解于2毫升二氯甲烷制成油相溶液(O)；
(3)将上述含植物血凝素的水相溶液(W1)加入到油相溶液(O)中，使这两种溶液在温度15℃下、搅拌速度为8000转/分、搅拌时间为0.05小时，搅拌混合，制成初乳W1/O，在4-10℃下保存；
(4)将上述初乳W1/O在2000转/分搅拌情况下加入到400毫升3％的聚乙烯醇中，搅拌温度为5-30℃，搅拌时间为0.2小时，制成复乳W1/O/W2，在4-10℃下保存；
(5)将复乳W1/O/W2加入到3倍复乳体积的3％NaCl水溶液中，通过800转/分搅拌，使有机溶剂挥发，然后1800转/分离心10分钟，收集微球，存放于冰箱中冷藏。
所制得的植物血凝素微球形态圆整，粒度分布均匀，平均粒径在19.4微米，载药量可达9.1％，包封率在35.5％，体外释放实验表明，缓释可以达3周，符合长效制剂特征。动物实验证明这种新型植物血凝素除具有植物血凝素的抗畜、禽病毒作用外，其在体内的半衰期是普通植物血凝素地4.3倍，从而延长了其在体内的作用时间。
实施例2
一种植物血凝素长效剂型的制备方法，其特征在于具体实施步骤如下：
(1)将90毫克植物血凝素溶解在1毫升含有2％的海藻糖的PBS缓冲溶液，制成水相溶液(W1)；
(2)将1000毫克丙交脂/乙交脂共聚物溶解于4毫升二氯甲烷制成油相溶液(O)；
(3)将上述含植物血凝素的水相溶液(W1)加入到油相溶液(O)中，使这两种溶液在温度15℃下、搅拌速度为8000转/分、搅拌时间为0.05小时，搅拌混合，制成初乳W1/O，在4-10℃下保存；
(4)将上述初乳W1/O在1500转/分搅拌情况下加入到300毫升2％的聚乙烯醇中，搅拌温度为5-30℃，搅拌时间为0.2小时，制成复乳W1/O/W2，在4-10℃下保存；
(5)将复乳W1/O/W2加入到3倍复乳体积的2％NaCl水溶液中，通过1500转/分搅拌使有机溶剂挥发，然后2000转/分，离心15分钟，收集微球，存放于冰箱中冷藏。
所制得的植物血凝素微球形态圆整，粒度分布均匀，平均粒径在15.5微米，载药量可达9.5％，包封率在37.1％，体外释放实验表明，缓释可以达4周，符合长效制剂特征。动物实验证明这种新型植物血凝素除具有植物血凝素的抗畜、禽病毒作用外，其在体内的半衰期是普通植物血凝素的2.0倍，从而延长了其在体内的作用时间。
实施例3
一种植物血凝素长效剂型的制备方法，其特征在于具体实施步骤如下：
(1)将150.0毫克植物血凝素溶解在2.5毫升含有2％的牛血清白蛋白的PBS缓冲溶液，制成水相溶液(W1)；
(2)将1000毫克丙交脂/乙交脂共聚物溶解于3.5毫升二氯甲烷制成油相溶液(O)；
(3)将上述含植物血凝素的水相溶液(W1)加入到油相溶液(O)中，使这两种溶液在温度15℃下、搅拌速度为8000转/分、搅拌时间为0.05小时，搅拌混合，制成初乳W1/O，在4-10℃下保存；
(4)将上述初乳W1/O在2000转/分搅拌情况下加入到400毫升3％的聚乙烯醇中，搅拌温度为5-30℃，搅拌时间为0.2小时，制成复乳W1/O/W2，在4-10℃下保存；
(5)将复乳W1/O/W2加入到2倍复乳体积的1％NaCl水溶液中，通过1000转/分搅拌使有机溶剂挥发，然后1300转/分离心20分钟，收集微球，存放于冰箱中冷藏。
所制得的植物血凝素微球形态圆整，粒度分布均匀，平均粒径在19.4微米，载药量可达8.2％，包封率在32.3％，体外释放实验表明，缓释可以达3周，符合长效制剂特征。动物实验证明这种新型植物血凝素除具有植物血凝素的抗畜、禽病毒作用外，其在体内的半衰期是普通植物血凝素的3.0倍，从而延长了其在体内的作用时间。
上述参照实施例对该植物血凝素长效剂型的制备方法进行的详细描述，是说明性的而不是限定性的，可按照所限定范围列举出若干个实施例，因此在不脱离本发明总体构思下的变化和修改，应属本发明的保护范围之内。