《用于治疗缺血性脑血管疾病的制剂及其制备方法.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《用于治疗缺血性脑血管疾病的制剂及其制备方法.pdf（11页珍藏版）》请在专利查询网上搜索。
1、10申请公布号CN101940592A43申请公布日20110112CN101940592ACN101940592A21申请号201010265672722申请日20100827A61K35/14200601A61K35/28200601C12N5/0789201001A61P9/1020060171申请人上海士腾生物技术有限公司地址201203上海市晨晖路377弄169号701室申请人杨子江72发明人杨肖泱杨子江顾丽娅54发明名称用于治疗缺血性脑血管疾病的制剂及其制备方法57摘要本发明涉及一种治疗缺血性脑血管疾病的制剂及其制备方法，该制剂的制备方法是通过诱导单核细胞获得血管内皮祖细胞ENDO。
2、THELIALPROGENITORCELLS，EPC，进而在低血清及低氧条件培养上述EPC细胞，最后分离EPC细胞获得无细胞培养基，并对该无细胞培养基进行相应后处理，即可获得所述制剂。体外和体内实验表明，本发明所述的治疗缺血性脑血管疾病的制剂能够显著的促进由脑缺血导致坏死的脑组织的修复。51INTCL19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书2页说明书7页附图1页CN101940596A1/2页21一种治疗缺血性脑血管疾病的制剂的制备方法，其特征在于，该制剂的制备方法包括如下步骤步骤1从健康人血液中通过密度梯度离心的方法或白细胞置换LEUKAPHERESIS获取外周血单核细胞，。
3、或从骨髓中通过密度梯度离心的方法获取骨髓单核细胞；步骤2培养单核细胞以获得EPC细胞；步骤3在特定条件下培养EPC细胞使其分泌促血管生成的生长因子和细胞活素，分离EPC细胞和培养基，获得富含促血管生成因子和细胞活素的无细胞培养基；步骤4对步骤3中所获得的无细胞培养基进行后处理，该后处理步骤包括过滤细胞碎片、纯化该无细胞培养基、检测各有效生长因子成分及含量、对该培养基进行冻干处理或冷冻保存，即获得治疗缺血性脑血管疾病的制剂。2根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤1所述的健康人血液的来源可以是自体来源，或异体来源，或通过血库购买的健康人白细胞悬液样本，或通过临床白细胞置换。3根据权利要求。
4、12任一所述的制备方法，其特征在于，步骤1所述的从血液中或骨髓中通过密度梯度离心获取外周血单细胞的方法为使用梯度剂为FICOLLPAQUE、HISTOPAQUE1077或其他同类产品，温度为1525，离心力为200G500G，时间2040分钟，离心完成后，吸取当中不透明层，即为单核细胞悬液。4根据权利要求13任一所述的制备方法，其特征在于，步骤2中的培养单核细胞以获得EPC细胞时，所用的培养基为M119、DMEM、RPMI1640、EBM、EBM2中的一种，并添加有051的生长因子添加剂EGM、EGMMV、EGM2或EGM2MV中的一种可由瑞士LONZA公司购买，其中含血管内皮生长因子VEGF。
5、1、碱性成纤维细胞生长因子FGF2、表皮生长因子EGF，和胰岛素样生长因子IGF1；或添加有内皮细胞生长因子ECGF10100G/ML；或添加有内皮细胞生长因子ECGF10100G/ML；培养基中另含有质量比为5至20的胎牛血清或者人血清白蛋白；培养条件为温度37，二氧化碳浓度为5。5根据权利要求14任一所述的制备方法，其特征在于，步骤2所述的培养单核细胞以获得EPC细胞的方法为以下所述方法、或中的一种方法将单核细胞以每平方厘米5105至2106个细胞的密度培养24天，将贴壁细胞用胰蛋白酶消化收集后以每平方厘米1105至2105个细胞的密度重新培养37天，获I型EPC细胞；方法将单核细胞以每平。
6、方厘米5105至2106个细胞的密度培养2天，收集悬浮细胞，并以每平方厘米1105至2105个细胞的密度重新培养37天，获II型EPC细胞；方法将单核细胞以每平方厘米5105至2106个细胞的密度培养16天，将贴壁细胞用胰蛋白酶消化收集后以每平方厘米1105至2105个细胞的密度重新培养1021天，获III型EPC细胞；方法将单核细胞通过CD34特异性抗体进行磁珠分选，筛选出富含CD34的单核细胞亚群，将此CD34单核细胞亚群在步骤2中所描述的培养基及培养条件下以每平方厘米1105至1106个细胞的密度培养26天，获IV型EPC细胞。6根据权利要求15任一所述的制备方法，其特征在于，步骤3所述。
7、的在特定条件下培养EPC细胞的方法为将步骤2所获得的EPC细胞置于不含任何生长因子的培养基内，权利要求书CN101940592ACN101940596A2/2页3在氧浓度为05至2的环境中培养1至3天，所用的培养基为M119、DMEM、RPMI1640、EBM、EBM2、PH值为74的磷酸盐缓冲液PBS或09的医用生理盐水，并添加1的医用人血清白蛋白。7根据权利要求16任一所述的制备方法，其特征在于，不添加1的医用人血清白蛋白。8根据权利要求17任一所述的制备方法，其特征在于，所述EPC细胞为I型EPC细胞。9一种由权利要求18任一所述的方法制备获得的制剂。10权利要求9所述的制剂在制备治疗缺。
8、血性脑血管疾病的药物中的应用。权利要求书CN101940592ACN101940596A1/7页4用于治疗缺血性脑血管疾病的制剂及其制备方法技术领域0001本发明涉及一种可以治疗缺血性脑血管疾病的制剂及其制备方法。背景技术0002心脑血管疾病是世界上致死率和发病率最高的疾病。根据2010年美国心脏学会的统计报告指出，2005年全世界大约有1750万人死于各类心脑血管疾病，大约占死亡总人数的30。预计到2020年，全球因心脑血管疾病死亡人数将达2500万人。另据WHO的报告指出，在2006年到2015年的10年之间，中国在因心血管病及糖尿病而导致的收入损失将高达5580亿美元。在2004年欧洲有。
9、430万人死于各类心脑血管疾病，高达总死亡人数的48。在各类心脑血管疾病中，动脉粥样硬化所导致的血栓及血管堵塞是最常见和最重要的发病机理。在疾病初期，由活性氧激发的对低密度脂蛋白的修饰会逐渐导致血管内皮机能障碍。机体的免疫系统对此产生慢性炎症并持续分泌富含T细胞，巨噬细胞，肥大细胞的白血球细胞群，并形成脂纹，纤维斑块，粥样斑块，使血管腔狭窄并导致血流量减少。当最终粥样斑块破碎后，脱落的碎斑会导致血小板聚集并产生大规模的闭合性血栓及其他继发性改变，包括由该动脉所供应养份的组织或器官的缺血或坏死。由动脉粥样硬化所导致的缺血性心脑血管疾病主要包括有冠心病，缺血性中风，以及外周闭塞性动脉疾病。缺血性中。
10、风是由血栓脑部形成阻塞血块，栓塞栓塞从其他地方形成，见下，系统性供血不足一般性系统性供血不足，如休克或静脉血栓引起的脑部供血不足，导致脑组织功能障碍及坏死。全球每年的中风患者有1500万人，并导致500万人终身残疾及570万人死亡，其中87属于缺血性中风。在美国，平均每40秒就有一人会发生中风，平均每4分钟就有一名患者死于中风。在世界范围内中风也是第2大死因。尽管有保守锻炼，抗凝药物，和手术颈动脉内膜切除或颈动脉血管成形的传统治疗手段，大部分由动脉粥样硬化所导致的缺血性中风病患者依然无法获得有效的治疗，究其原因，主要是因为对抗凝药物的副作用，以及身体或疾病条件而无法进行有效的手术等。0003干。
11、细胞疗法是近年来在治疗癌症和心脑血管疾病等领域最受人期待的新发展方向。从理论上讲，干细胞可以用于各种疾病的治疗，但其最适合的疾病主要是组织坏死性疾病如缺血引起的心肌坏死，退行性病变如帕金森综合征，自体免疫性疾病如胰岛素依赖型糖尿病等。尤其是其具有的促进血管再生和器官功能恢复的特殊功效，在心脑血管疾病的治疗中有着巨大疗效。0004在全球现阶段开展的临床试验中，针对缺血性心脑血管疾病的促血管再生干细胞移植作为一种极有希望替代传统疗法的再生疗法已取得了很好的效果。然而，考虑到异体移植所带来的免疫应答及其严重的组织排斥甚至致死后果，包括患者自身的免疫系统对异体干细胞的排斥及异体干细胞群落中不可避免的含。
12、有的异源免疫细胞亚群对患者组织的排斥，此类临床试验都使用了患者自体同源的细胞。另外，在检测了不同器官组织来源的干细胞种群之后发现，来源于骨髓及外周血液的成体CD34干细胞亚类具有极强的促血管再生能力，在治疗缺血性血管疾病中有较好的效果，也免除了采用胚胎干细胞所带来的说明书CN101940592ACN101940596A2/7页5伦理问题。然而，现阶段一系列技术和应用上的不足极大的限制了干细胞疗法在临床上的进一步推广和应用，这些限制包括并不局限于1此类干细胞在骨髓及血液中的极低含量大约001；2此类细胞疗法所需细胞的极大数量11051106个/千克体重；3细胞移植入体内后的极低存活率和存活细胞的。
13、实际效率低于10；以及4患者自体干细胞因慢性疾病及长期大量心血管危险因子的影响所导致的功能失常。0005基于上述事实，特别是现有的干细胞疗法应用于临床时的缺陷和不足，有必要提供更为有效、普适的治疗缺血性心脑血管疾病药物，以改善现有的由动脉粥样硬化所导致的缺血性心脑血管疾病的临床治疗状况。0006血管内皮祖细胞ENDOTHELIALPROGENITORCELLS，EPC是调节和诱导新血管生成的主要干细胞亚类。动物体内实验数据表明，EPC参与血管生成的过程主要有1少量细胞分化为成熟的内皮细胞，形成新的血管内壁以及2大部分细胞分泌出大量促血管新生的生长因子和细胞活素，激发缺血组织内部的内皮细胞，平滑。
14、肌细胞，壁细胞及其他干细胞亚群及祖细胞亚群共同参与新血管的形成。事实上，此类EPC在缺血组织中分泌出的生长因子和细胞活素，可借由EPC在体外特定环境中所分泌的条件培养基中获得，并完全可能将其应用于受损血管的修复和再生，从而恢复缺血性坏死的组织的相应功能。因此，EPC在体外人工环境中分泌的促血管新成的生长因子和细胞活素在临床上有巨大的潜力，可以作为干细胞疗法的有效替代品或辅助药物。发明内容0007本发明的目的在于提供一种能够有效的治疗缺血性脑血管疾病的制剂，用于克服现有药物的不足，为临床治疗缺血性脑血管疾病提供一种新的治疗药物。0008上述缺血性脑血管疾病主要指由于动脉粥样硬化导致的血管阻塞类的。
15、疾病，具体包括脑动脉硬化引起的中风，脑缺血、脑梗塞，脑萎缩，梗塞型痴呆。0009本发明的目的还在于提供一种制备能够有效的治疗缺血性脑血管疾病的制剂的方法，该方法步骤为00101从健康人血液中通过密度梯度离心的方法或白细胞置换LEUKAPHERESIS获取外周血单核细胞，或从骨髓中通过密度梯度离心的方法获取骨髓单核细胞；00112培养单核细胞以获得EPC细胞；00123在特定条件下培养EPC细胞使其分泌促血管生成的生长因子和细胞活素，分离EPC细胞和培养基，获得富含促血管生成因子和细胞活素的无细胞培养基；00134对步骤3中所获得的无细胞培养基进行后处理，该后处理步骤包括过滤细胞碎片、纯化该无细。
16、胞培养基、检测各有效生长因子的成分及含量、对该培养基进行冻干处理或冷冻保存，即获得治疗缺血性脑血管疾病制剂。0014本发明所述制备能够有效的治疗缺血性脑血管疾病的制剂的方法中，步骤1所述的健康人血液的来源可以是自体来源仅局限于无症状的轻度外周闭塞性动脉疾病或异体来源，获得途径可以是直接抽血，或由血库直接购买的健康人白细胞悬液样本，或通过临床白细胞置换。血液提供者的限制范围为50岁以下，无烟酒史，无传染性疾病，血液疾病的健康人群。所述的梯度离心以获取单核细胞的步骤为将所获得的血液或白细胞悬液在密度梯度剂中梯度离心，所用的梯度剂可为FICOLLPAQUEGEHEALTHCARE、说明书CN1019。
17、40592ACN101940596A3/7页6HISTOPAQUE1077SIGMA，或其他公司同类产品，优选为HISTOPAQUE1077；适用温度范围为15到25，优选为25；每15MLHISTOPAQUE可分离15至30ML全血样品。具体操作为将含有血液及梯度剂的容器在200G500G下离心2040分钟，分层后，用无菌一次性针管吸取当中不透明层，即为富含单核细胞的悬浮液，经鉴定，此单核细胞群体来源于骨髓髓系干细胞，丰富表达单核细胞特异性受体CD14，其内所含多种细胞亚群，呈多形性。0015本发明所述制备能够有效的治疗缺血性脑血管疾病的制剂的方法中，步骤2中的培养单核细胞以获得EPC细胞时。
18、，所用的培养基可为M119、DMEM、RPMI1640、EBM、EBM2中的一种，并添加有051的生长因子添加剂EGM、EGMMV、EGM2或EGM2MV中的一种可由瑞士LONZA公司购买，其中含血管内皮生长因子VEGF1、碱性成纤维细胞生长因子FGF2、表皮生长因子EGF，和胰岛素样生长因子IGF1；或添加有内皮细胞生长因子ECGF10100G/ML。培养基中另含有质量比为5至20的胎牛血清或者人血清白蛋白。在预设条件为培养温度37，二氧化碳浓度为5的细胞培养箱中培养。0016本发明所述制备能够有效的治疗缺血性脑血管疾病的制剂的方法中，步骤2中的培养单核细胞以获得EPC细胞的步骤为以下所述方。
19、法，或中的一种0017方法将单核细胞以每平方厘米5105至2106个细胞的密度培养24天，将贴壁细胞用胰蛋白酶消化收集后以每平方厘米1105至2105个细胞的密度重新培养37天。所获I型EPC为纺锤状细胞，具有内吞乙缩醛化的低密度脂蛋白ACETYLATEDLDL及结合荆豆凝集素UEA1LECTIN的典型内皮细胞特性，并且大量表达血管内皮细胞生长因子受体KDR，CD31，单核细胞受体CD14，造血细胞受体CD45，少量表达干细胞特有受体CD34，CD133。0018方法将单核细胞以每平方厘米5105至2106个细胞的密度培养2天，收集悬浮细胞，并以每平方厘米1105至2105个细胞密度重新培养3。
20、7天。所获II型EPC为细胞集落，其中心分布为圆形细胞，周围为纺锤状细胞。此II型EPC具有典型内皮细胞特性并表达内皮细胞特有受体KDR，CD31及TIE2。0019方法将单核细胞以每平方厘米5105至2106个细胞的密度培养16天，将贴壁细胞用胰蛋白酶消化收集后以每平方厘米1105至2105个细胞的密度重新培养1021天。所获III型EPC为细胞集落，并可持续培养及增殖12个星期以上，此III型EPC具有典型内皮细胞特性并表达内皮细胞特有受体KDR，CD31，TIE2，及VECADHERIN。0020方法将单核细胞通过CD34特异性抗体进行磁珠分选由德国MILTENYIBIOTEC公司生产，。
21、筛选出富含CD34的单核细胞亚群，将此CD34单核细胞亚群在步骤2中所描述的培养基及培养条件下以每平方厘米1105至1106个细胞的密度培养26天。所获IV型EPC为CD34细胞集落，此IV型EPC具有典型内皮细胞特性并表达内皮细胞特有受体KDR及干细胞特有受体CD34。0021本发明所述制备能够有效的治疗缺血性脑血管疾病的制剂的方法中，步骤3中的在特定条件下培养EPC细胞的方法为将步骤2所获得的I、II、III或IV型EPC置于不含任何生长因子的培养基内，在氧浓度为05至2的环境中培养1至3天，所用的培养基为M119、DMEM、RPMI1640、EBM、EBM2、PH74的磷酸盐缓冲液PBS。
22、或09的医用生理盐水，并可添加1的医用人血清白蛋白。0022培养完成后收集富含细胞生长因子的条件培养基，弃去EPC细胞。说明书CN101940592ACN101940596A4/7页70023本发明所述制备能够有效的治疗缺血性脑血管疾病的制剂的方法中，步骤4所述的后处理步骤包括0024对步骤3中所收集的无细胞培养基进行过滤，可通过高速离心或过滤器将细胞杂质及碎片去除。0025对过滤后的无细胞培养基进行成分鉴定，并对其中所含的代表性促血管生长因子及细胞活素如MCP1，EGF，MMP9，IL8，ANGIOGENIN，VEGF的含量进行鉴定，鉴定方法可为蛋白组学PROTEOMICS，细胞活素阵列CY。
23、TOKINEARRAY，酶联免疫吸附测定ELISA，或BIOPLEXTM细胞因子测试。0026对过滤后的无细胞培养基进行冻干或分装冷冻保存，以便长期保存其中的生长因子及细胞活素成分的活性。附图说明0027图1本发明所述治疗缺血性脑血管疾病制剂对大鼠脑微血管内皮细胞的激活及促进迁移及修复损伤功效。0028图2本发明所述治疗缺血性脑血管疾病制剂对大鼠脑缺血性梗塞的修复。具体实施方式0029以下通过具体的实例对本发明的内容作进一步的阐述说明，本发明包括但不限于下述步骤和内容。0030实施例1单核细胞的制备。0031将100ML血液加入密度梯度剂HISTOPAQUE1077SIGMA，每15MLHIS。
24、TOPAQUE中加入30ML血液。将含有血液及梯度剂的试管在400G的速度下常温离心30分钟。分层后，用无菌一次性针管吸取当中不透明层，即为富含单核细胞的悬浮液。视具体情况，每100ML血液可以获得1X1081X1010个单核细胞。0032实施例2EPC细胞的获取。0033针对I类EPC细胞的获取方法将富含单核细胞的悬浮液在添加有10人血清白蛋白及1的生长因子添加剂EGM可由瑞士LONZA公司购买的EBM2培养基下以每平方厘米1106细胞的密度培养4天，将贴壁细胞用胰蛋白酶消化收集后以每平方厘米2105的密度重新培养2天。所获I型EPC为纺锤状细胞，具有内吞乙缩醛化的低密度脂蛋白ACETYLA。
25、TEDLDL及结合荆豆凝集素UEA1LECTIN的典型内皮细胞特性，并且大量表达血管内皮细胞生长因子受体KDR、CD31、CD14、CD45、少量表达CD34、CD133及血管内皮钙粘蛋白VECADHERIN。0034针对II类EPC细胞的获取方法将富含单核细胞的悬浮液在添加有10人血清白蛋白及1的生长因子添加剂EGM可由瑞士LONZA公司购买的EBM2培养基下以每平方厘米1106细胞的密度培养2天，收集悬浮细胞，并以每平方厘米2105个细胞的密度重新培养3天。所获II型EPC为细胞集落，其中心分布为圆形细胞，周围为纺锤状细胞。此II型EPC具有典型内皮细胞特性并表达内皮细胞特有受体KDR，C。
26、D31及TIE2。0035针对III类EPC细胞的获取方法将富含单核细胞的悬浮液在添加有10人血清白蛋白及1的生长因子添加剂EGM可由瑞士LONZA公司购买的EBM2培养基下以每说明书CN101940592ACN101940596A5/7页8平方厘米1106个细胞的密度培养3天，将贴壁细胞用胰蛋白酶消化收集后以每平方厘米2105个细胞的密度重新培养20天。所获III型EPC为细胞集落，具有典型内皮细胞特性并表达内皮细胞特有受体KDR，CD31，TIE2，及VECADHERIN。0036针对IV类EPC细胞的获取方法将单核细胞通过CD34特异性抗体通过磁珠分选由德国MILTENYIBIOTEC公。
27、司生产，筛选出富含CD34的单核细胞亚群，将此CD34单核细胞亚群在在添加有10人血清白蛋白及1的生长因子添加剂EGM可由瑞士LONZA公司购买的EBM2培养基下以每平方厘米5105个细胞的密度培养2天。所获IV型EPC为CD34细胞集落，此IV型EPC具有典型内皮细胞特性并表达内皮细胞特有受体KDR及干细胞特有受体CD34。0037视具体情况，所获得的各型EPC细胞的量约为单核细胞量的110。0038实施例3治疗缺血性脑血管疾病制剂的获取。0039将实施例2所获得的I型EPC细胞置于不含任何生长因子的磷酸盐缓冲液PBS内每平方厘米2105个细胞，在氧浓度为15的环境中培养2天，并添加1的医用。
28、人血清白蛋白。培养完成后收集富含细胞生长因子的无细胞培养基，弃去贴壁的EPC细胞。将收集的无细胞培养基通过孔径为02微米的过滤器将细胞杂质及碎片去除并分装于80冷库冷藏备用。视具体情况，每1X106个EPC细胞可以制备25ML所述治疗缺血性脑血管疾病制剂。0040实施例4治疗缺血性脑血管疾病制剂中的生长因子及细胞活素的鉴定。0041实施例3所制得的治疗缺血性脑血管疾病制剂中含有的生长因子及细胞活素成分通过细胞活素阵列CYTOKINEARRAY鉴定由RDSYSTEMS购买，此治疗缺血性脑血管疾病制剂的有效成分包含并不局限于以下生长因子MCP1、EGF、IL8、MMP9、PAR、ANGIOGENI。
29、N、SDF1、HGF、VEGF以及PDGF。通过BIOPLEXTM细胞因子测试检测由BIORAD公司生产，其中有效成分的含量为，IL814G/ML；SDF150100NG/ML；HGF510NG/ML；ANGIOGENIN15NG/ML；PDGFBB15NG/ML；VEGF011NG/ML。其他成分组成见表1。0042表1本发明所述治疗缺血性脑血管疾病制剂中的成分列表包含并不局限于以下成分0043ACTIVINAFGF4IL1RAMMP9AGRPFGF9IL1RIIMPIF1ANGIOGENINGITRIL2RALPHANAP2B71CD80GITRLIGANDIL2RBETANT4BMP4G。
30、MCSFIL2RONCOSTATINMBMP5GROIL4PDGF说明书CN101940592ACN101940596A6/7页9BMP6HCC4IL6RRANTESBNGFHGFIL8SCFCARDIOTROPHIN1ICAM1IL9SDF1CD14ICAM3LEPTINRSIGLEC5CTACKIGFBP3LIFSTNFRICXCL16IGFILSELECTINSTNFRIIDTKIGFIIMCP1TECKEGFIGFISRMCP2TGFBETA2ENA78IL10MCP4THROMBOPOIETINEOTAXINIL10RBETAMCSFTIMP1EOTAXIN2IL12P40MCSFR。
31、TRAILR4EOTAXIN3IL13RALPHA2MDCUPARERBB3IL18BPALPHAMIFVECADHERINFAS/TNFRSF6IL18RBETAMIP1VEGFFASLIGANDIL1R4/ST2MMP13VEGFD0044实施例5体外检测治疗缺血性脑血管疾病制剂对大鼠脑微血管内皮细胞的激活及促进迁移及修复损伤功效。0045将大鼠脑微血管内皮细胞RATBRAINCAPILLARYENDOTHELIALCELL以每孔5104个细胞的密度接种于24孔板中，在含10人血清白蛋白及生长因子添加剂EGM由瑞士LONZA公司生产，其中含05ML血管内皮生长因子VEGF1、2ML碱性成纤。
32、维细胞生长因子FGF2、05ML表皮生长因子EGF和05ML胰岛素样生长因子IGF1的EBM2培养基下中培养24小时，弃去原培养基并用移液管尖将在板底的细胞层上划出一道细胞空白区域即损伤区域，将细胞重新置于本发明所述的治疗缺血性脑血管疾病制剂或阴性对照培养基即只含有1人血清白蛋白的PBS，PH74中继续培养24小时后检测此刮伤愈合SCRATCHWOUNDHEALING的程度即损伤区域面积比；结果见图1。结果显示，本发明所述的治疗缺血性脑血管疾病制剂能够显著的激活大鼠脑微血管内皮细胞在低血清说明书CN101940592ACN101940596A7/7页10环境中的对损伤区域的修复及迁移速度，相比。
33、阴性对照组的愈合速度刮伤面积减少至890005，本发明所述的治疗缺血性脑血管疾病制剂能够以更快的速度减小刮伤面积至58227P005。0046实施例6大鼠脑缺血性梗塞的修复。0047在持久性脑缺血PERMANENTOCCLUSIONOFTHEMIDDLECEREBRALARTERY，MCAO大鼠模型上验证本发明所述的治疗缺血性脑血管疾病制剂对脑梗塞部位的保护及恢复作用。具体方法为对大鼠进行持久性大脑中动脉堵塞24小时，3天，和7天后，分别对脑梗塞周边部位注射本发明所述的治疗缺血性脑血管疾病制剂每次总注射量为51，在注射结束2周后将大鼠大脑切片用TTC氯化三苯四氮唑染色法检测梗塞面积，其中红色为非梗塞部位，白色为梗塞部位见图2A。结果显示对比安慰剂对照组中36027的脑梗面积即方法相同，但注射的制剂为只含有1人血清白蛋白的PH74的PBS，本发明所述治疗缺血性脑血管疾病制剂显著的减小了脑梗塞部位的面积至12519见图2B，P005。说明书CN101940592ACN101940596A1/1页11图1图2说明书附图CN101940592A。