一种缘管浒苔孢子的采集和培养方法.pdf

本发明公开了一种缘管浒苔孢子的采集和培养方法，是取成熟的缘管浒苔片段置于载玻片上并滴加海水，用光照强度3500-4200Lx的光照射刺激，发现游孢子释放即将其收集，然后进行培养。本发明通过对成熟的缘管浒苔进行强光照射，可促使游孢子的释放，满足大量采集的需要；本发明的采集培养方法操作简便实用，对藻体成熟度要求不高，不仅可为实验工作稳定持续提供具备正常生长发育能力的大量孢子，而且便于大批量观察孢子的附着萌发状况。所提供述的方法填补了缘管浒苔孢子采集培养领域的空白，为大规模人工培养奠定了技术基础，在海藻养殖及防除测试研究等方面具有广阔的应用前景。

1.  一种缘管浒苔孢子的采集和培养方法，其特征是取成熟的缘管浒苔片段置于载玻片上并滴加海水，用光照强度3500-4200Lx的光照射刺激，发现游孢子释放即将其收集，收集后进行培养。

2.  如权利要求1所述的采集和培养方法，其特征在于所述光照的光源采用显微镜的内置光源。

3.  如权利要求2所述的采集和培养方法，其特征在于所述培养是将收集到的游孢子用海水稀释，室温下置于黑暗环境中使其均匀分布，均匀分布后进行间歇性光照培养。

4.  如权利要求3所述的采集和培养方法，其特征在于所述室温下进行间歇性光照培养是每天光照强度为900~1300Lx照射12小时，重复4天，室温为21-23℃。

5.  如权利要求4所述的采集和培养方法，其特征在于所述游孢子用海水稀释的密度为3.5×10^-2个/mm²。

6.  如权利要求5所述的采集和培养方法，其特征在于所述置于黑暗环境下使游孢子均匀分布时间为2h。

7.  如权利要求1~6所述的任一种采集和培养方法，其特征在于所述海水经过滤、煮沸消毒、冷却至室温的消毒处理。

一种缘管浒苔孢子的采集和培养方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种缘管浒苔孢子的采集和培养方法。
背景技术
根据我国沿海各海区污损生物的调查结果可以看出，缘管浒苔、石莼、水云等大型藻类均为秋、冬、春季节常见的藻类污损生物优势种。藻类的附着会显著增大波浪和海流对海洋设施产生的动力载荷效应，引发漂移甚至倾覆；堵塞水产养殖网箱、笼具、围网等的网孔，影响内外环境水体交换，降低内部环境的溶解氧，妨碍养殖对象的正常生长发育；某些藻类分泌的化学物质还可能会对其他海洋生物造成不利影响。
浒苔属藻类(Enteromorpha Link)隶属绿藻门石莼科。藻体直立，管状中空或者至少在藻体的柄部和藻体边缘部分呈中空，管状部分由单层细胞组成。藻体单条或者有分枝，圆柱形，有时部分扁压。藻体基部细胞生出假根丝，向下形成固着器。营养繁殖时，藻体断裂形成新藻体。无性生殖是形成顶端有4条鞭毛的游动孢子。有性生殖为同配或者异配。多数种类海产，广泛分布在全世界各海洋中。常生长在潮间带岩石上或石沼中，或泥沙滩的石砾上，有时也可附生在大型海藻和各类人工设施上。中国沿海常见种类有缘管浒苔、浒苔、扁浒苔、条浒苔。
缘管浒苔(Enteromorpha linza)藻体鲜绿色或暗绿色，成带状或叶片状，边缘波状皱折，边缘中空，系世界性泛暖温带性海藻，生长在中低潮带的礁石上或内湾滩涂的石砾上，生长期长，全年均有繁殖，生长盛期在1-5月，为秋、冬、春期间主要污损生物。因此，人们在从事涉海经济活动中必须认识到这类生物的危害并采取相应防除措施。要取得良好防除效果，在开展防污剂筛选研究阶段就选择其作为防除测试对象极为必要。目前，虽已开展了缘管浒苔的单性生殖及其生活史研究，但未见有关该类生物孢子采集、定量培养的报道，更不要说将其应用于防污剂筛选测试、环境保护及监测研究等方面。另外，缘管浒苔又是重要的经济海藻，具有较高的营养和药用价值，掌握相关的孢子大量采集和培养技术，在大规模养殖和人工栽培领域也具有广阔的应用前景。
虽然在研究该属的另一个常见种类——浒苔(Enteromorpha prolifera)生活史时，研究人员发现在光的刺激下，大量的游孢子可持续不断地从其孢子囊中放散出去，但现有技术中并没有探讨大量采集游孢子的方法，而且也没有提出借助何种方法和设备来持续稳定地获得大量的游孢子。此外，缘管浒苔和浒苔又是不同的种类，因此，了解和掌握缘管浒苔孢子大量采集的方法和在此基础上的培养技术，是本技术领域中亟待开发的。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种通过人工生物培养技术，能在小水体中短时间内采集到大量缘管浒苔孢子并进行培养的方法。
本发明通过以下技术方案实现上述目的：
一种缘管浒苔孢子的采集和培养方法，是取成熟的缘管浒苔片段置于载玻片上并滴加适量海水，用光照强度3500-4200Lx的光照射刺激，时间控制在10min以内(具体时间的长短取决于孢子释放状况，且需要适时滴加海水防止蒸发导致藻体干枯)，发现游孢子大量释放时即将其收集，收集后进行培养。
本发明上述的方法优选是在显微镜下完成，并利用显微镜的内置光源来照射；承载成熟的缘管浒苔片段优选采用载玻片，但载玻片并非本发明实施的唯一方式，与载玻片起到相同或相近似作用的承载物仍然是本发明的保护范围。
为更好地实施本发明，在上述采集方法的基础上，本发明还可进一步进行培养，所述培养是完成采集后将采集到的游孢子计数并用海水稀释至特定浓度，室温下置于黑暗环境中使其均匀分布，均匀分布后进行间歇性光照培养。
孢子采集是观察分析藻类孢子附着萌发状况的基础，没有足够数量的孢子就不能满足生物统计分析的要求，从而妨碍利用这种我国沿海常见的大型海洋藻类孢子开展防除测试及环境监测等方面的工作；然而，如果没有一个适当的孢子附着萌发培养技术来匹配，即使能采集到大量孢子仍然无法开展相关方面的研究，因此，孢子采集和培养技术的这两个环节是相互相承、作为一个专有技术的整体而存在，任一环节的缺失都不能完成相关测试分析工作，故将其分割开来仅掌握其中一个方面没有任何意义。
所述室温下进行间歇性光照培养是每天光照强度为900-1300Lx照射12小时，培养4天为优选方案，室温为21-23℃。
所述用海水稀释至特定浓度是将游孢子接种培养时的密度调整为3.5×10^-2个/mm²；本发明采用这一孢子密度进行接种培养，是因为该密度下最易进行观察和操作，能更好地实施本发明。
所述黑暗环境下使游孢子均匀分布的时间为2h，这是由于游孢子具趋光性，在黑暗环境下可使之均匀分布在培养皿底部；本发明所述的2h是优选方案。
所述海水为天然海水，但为更好地实现为本发明，海水需经过滤、煮沸消毒、冷却至室温的消毒处理后，放置于经高温消毒的器皿中备用。
所述成熟的缘管浒苔为黄褐色藻体，长度2cm左右。
本发明所述培缘管浒苔孢子的培养在直径为60mm左右的培养皿中进行，是一种在小水体中培养缘管浒苔孢子的方法。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：本发明为本技术领域提供了一种完全可行的在小水体中大量采集缘管浒苔孢子并进行培养观察其附着萌发状况的方法，填充了这一技术领域中的空白。
本发明通过对成熟的缘管浒苔进行强光照射，可促进游孢子的释放，满足大量采集的需要。本发明的培养方法操作简便实用，周期短，对藻体成熟度要求不高，不仅可稳定持续获得大量孢子，而且产量大，孢子繁殖力强，并便于观察其附着萌发状况，为大规模人工培养奠定了技术基础，可用于解决稳定、持续、大量获得其孢子的难题，确保防污测试、环境毒理研究、培苗育种等方面工作的顺利进行，满足基础研究和应用开发等领域工作的需要，在海藻养殖及防除测试研究等方面具有广阔的应用前景。
具体实施方式
以下通过具体的实施例进一步说明本发明的技术方案。
实施例1
培养介质为天然海水，海水经过滤、煮沸消毒、冷却至室温后，放置于经高温消毒的器皿中备用。
样品采集取成熟的缘管浒苔，置于消毒海水中通气暂养。
取黄褐色藻体约2cm于载玻片上并滴加少量消毒海水，置于Nikon MD-TS100型显微镜载物台上。
孢子采集试验分三个组，分别为：A组，光强度3500Lx；B组，光强度500-3000Lx；C组，对照组，室内自然光照射。光照时间均为10分钟，期间适时滴加海水防止蒸发导致藻体干枯。镜检，用吸管吸取释放的发现游孢子，即以吸管吸取，置于50ml小烧杯中备用。重复以上步骤继续采集孢子2次。另换新鲜藻体片段，重复上述步骤采集孢子。
实验结果表明，B组和C组的光照强度对藻体的成熟度要求较高，常因藻体成熟度较差而不能有效地释放足够数量的孢子；A组光照强度则较为理想，在其刺激下，能稳定、持续、大量获得所需孢子。可见，强度为3500Lx的光照射可促进游孢子的释放，方便在短时间内大量采集游孢子。
实施例2
培养介质为天然海水，海水经过滤、煮沸消毒、冷却至室温后，放置于经高温消毒的器皿中备用。
样品采集取成熟的缘管浒苔，置于消毒海水中通气暂养。
取黄褐色藻体约2cm于载玻片上并滴加少量消毒海水，置于Nikon MD-TS100型显微镜载物台上，以4000Lx的光照强度刺激5min。镜检发现游孢子即以吸管吸取，置于50ml小烧杯中备用。重复以上步骤继续采集孢子2次。另换新鲜藻体片段，重复上述步骤采集孢子。
取少量烧杯中的孢子液于血球计数板进行计数，确定每毫升水体中游孢子的数量，用消毒海水将其稀释为浓度为不同浓度的孢子液稀释液。
将孢子液稀释液置于直径为60mm培养皿中，置于黑暗环境下培养2h后游孢子均匀分布，再移至光照藻类培养架上，每天光照12h，光照强度为900Lx，21-23℃下培养4天。
实验分5个组进行，区别在于孢子液经稀释后的浓度分别为1.7×10^-2个/mm²；3.5×10^-2个/mm²；1.7×10^-1个/mm²；3.5×10^-1个/mm²；7.0×10^-1个/mm²。
实验结果表明，当接种培养时孢子浓度大于或等于1.7×10^-1个/mm²时，可以发现培养皿底部附着萌发的孢子数量过多，密度极大，严重妨碍统计观察的进行。浓度为3.5×10^-2个/mm²时，附着在培养皿底部的孢子数量最为合适，便于观察统计其附着萌发状况。
实施例3
培养介质为天然海水，海水经过滤、煮沸消毒、冷却至室温后，放置于经高温消毒的器皿中备用。
样品采集取成熟的缘管浒苔，置于消毒海水中通气暂养。
取黄褐色藻体约2cm于载玻片上并滴加少量消毒海水，置于Nikon MD-TS100型显微镜载物台上，以4200Lx的光照强度刺激3min。镜检发现游孢子释放即以吸管吸取，置于50ml小烧杯中备用。重复以上步骤继续采集孢子2次。另换新鲜藻体片段，重复上述步骤采集孢子。
取少量烧杯中的孢子液于血球计数板进行计数，确定每毫升水体中游孢子的数量，用消毒海水将其稀释为浓度为不同浓度的孢子液稀释液。
将孢子液稀释液置于直径为60mm培养皿中，置于黑暗环境下培养2h后游孢子均匀分布，再移至光照藻类培养架上，每天光照12 h，光照强度为1300Lx，21-23℃下培养。
实验分三个组进行，区别在于培养时间分别为2天、4天和6天。
实验结果表明，当培养时间为2天时，孢子尚未萌发，不便观察；而当培养时间为6天时，孢子已发育形成完整的幼孢子体；当培养时间为4天时，孢子开始发育形成叶状体的细胞团，故此时观察孢子的附着萌发状况最为理想。