肝硬化微生物标志物及应用.pdf

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摘要
申请专利号:

CN201410334287.1

申请日:

2014.07.15

公开号:

CN104195146A

公开日:

2014.12.10

当前法律状态:

撤回

有效性:

无权

法律详情:

发明专利申请公布后的视为撤回IPC(主分类):C12N 15/31申请公布日:20141210|||实质审查的生效IPC(主分类):C12N 15/31申请日:20140715|||公开

IPC分类号:

C12N15/31; C12Q1/68; A23L1/29; A61K45/00; A61P1/16

主分类号:

C12N15/31

申请人:

浙江大学

发明人:

李兰娟; 秦楠

地址:

310027 浙江省杭州市西湖区浙大路38号

优先权:

专利代理机构:

杭州求是专利事务所有限公司 33200

代理人:

林松海

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内容摘要

本发明公开了肝硬化微生物标志物及应用。微生物标志物,选自肝硬化患者组中富集的一种微生物VeillonellaatypicaACS-134-V-Col7a或健康组富集的两种微生物BacteroidesuniformisATCC8492Clostridiales中的一种或多种。治疗肝硬化的药物,所述药物促进或者增加所述的选自健康组富集两种微生物BacteroidesuniformisATCC8492Clostridiales中的一种或两种,和/或抑制或清除所述的选自肝硬化患者组中富集的微生物VeillonellaatypicaACS-134-V-Col7a。针对肠道菌群中的微生物标志物的相对丰度进行检测,通过所得到的相对丰度值与预定的cutoff值进行比较。有益微生物组合或者功能性食品,含有选自所述的健康组富集的两种微生物BacteroidesuniformisATCC8492Clostridiales中的一种或两种。检测肝硬化、监测治疗进程,或者生产、筛选药物的试剂盒,用于检测所述的微生物标志物。

权利要求书

1.  一种微生物标志物,其特征在于,选自微生物Veillonella atypica ACS-134-V-Col7a、Bacteroides uniformis ATCC 8492、Clostridiales中的一种或多种。

2.
  根据权利要求1所述的微生物标志物,其特征在于,同时具有Veillonella atypica ACS-134-V-Col7a和选自微生物Bacteroides uniformis ATCC 8492、Clostridiales的一种或两种。

3.
  一种治疗肝硬化的药物,其特征在于,所述药物促进或者增加Bacteroides uniformis ATCC 8492、Clostridiales中的一种或两种,和/或抑制或清除微生物Veillonella atypica ACS-134-V-Col7a。

4.
  一种生产或筛选药物的方法,其特征在于,所述药物促进或者增加Bacteroides uniformis ATCC 8492、Clostridiales中的一种或两种,和/或抑制或清除微生物Veillonella atypica ACS-134-V-Col7a。

5.
  根据权利要求4所述的方法,其特征在于,所述的药物治疗或干预前,检测对象肠道菌群中是否富集有如权利要求1或2中所述的微生物标志物。

6.
  根据权利要求5所述的方法,其特征在于,所述的检测步骤包括:
 a、从对象粪便中提取DNA样本;
  b、针对DNA样本构建测序文库;
  c、对测序文库进行高通量测序,获得测序结果;
  d、根据测序结果,确定所述对象的肠道菌群中是否存在所述的微生物标志物。

7.
  根据权利要求6所述的方法,其特征在于,所述的步骤d中进一步包括:针对肠道菌群中的微生物标志物的相对丰度进行检测,通过所得到的相对丰度值与预定的cutoff值进行比较。

8.
  根据权利要求6所述的方法,其特征在于,所述的步骤c中,根据测序结果得到基因聚类方法,提出一种宏基因物种(MGS)的方法。

9.
  一种有益微生物组合或者功能性食品,其特征在于,含有选自微生物Bacteroides uniformis ATCC 8492、Clostridiales中的一种或两种。

10.
  一种检测肝硬化、监测治疗进程,或者生产、筛选药物的试剂盒,其特征在于,用于检测如权利要求1中所述的微生物标志物。

说明书

肝硬化微生物标志物及应用
技术领域
本发明涉及基因工程和生物医药领域,具体涉及肝硬化的微生物标志物及其应用。
背景技术
肝硬化(Liver cirrhosis)是临床常见的慢性进行性肝病,由一种或多种病因长期或反复作用形成的弥漫性肝损害。肝硬化是许多肝脏疾病的晚期病变,是由病毒性肝炎、酒精中毒、营养障碍、胆汁淤积、血吸虫病、循环障碍等各种原因所致,其特点是肝细胞变性和坏死。早期肝硬化通过及时防治可以逆转或不再进展,而晚期将不可逆转,严重影响患者的生活质量,甚至危及生命。
在中国最常见的病因是病毒性肝炎,主要是乙型病毒性肝炎,其次为丙型肝炎。而自发性腹膜炎、肝腹水、肝肾综合征、肝性脑病、食道静脉曲张、出血、原发性肝癌等这些肝硬化并发症的危害也是有目共睹的。面对现代如此多的治疗手段,却有很大一部分肝硬化患者依旧痛苦不堪,每日仍遭受着肉体上的折磨、心理上的恐惧以及精神上的摧残。
肝硬化患者由于门脉高压,肝脏功能障碍致胆汁分泌异常,解毒能力下降,宿主抵抗力降低等因素,导致肠道屏蔽功能破坏,微生物环境发生改变,肠道菌群失调。然而,与肝硬化进程相关的肠道微生物的系统发育及功能成分的变化还不清楚。尽管有些研究(Garcia et al2004,Wiest et al2012,Bass et al2010)表明肠道微生物的改变在末期肝硬化并发症中起重要作用(如自发细菌腹膜炎及肝性脑病),以及诱导早期肝脏疾病及促进肝损伤作用(如酒精性肝病及非酒精性脂肪肝病),肠道菌群与人肝脏病理之间的明确关联仍未知。有研究(Yi JH et al1999,Paik YH et al2003)表明可能是由于患者肠道细菌过度繁殖并产生内毒素,抑制肠上皮细胞蛋白质合成,小肠微绒毛出现形态学的改变,肠细胞质膜异常,细胞支架组织结构发生改变,肠刷状缘载体位置或细胞骨架上载体锚定点改变,导致氨基酸和碳水化合物在通过空肠刷状缘薄膜的运输过程缺陷,然而其具体机制有待于进一步的研究。
肝硬化及酒精性肝病患者通过16S rRNA测序研究揭示了一个肠道微生物中的类似实质性的改变(Chen Y et al2011,Yan A W.et al2011)。肠道微生物中系统发育机制怎样发生改变尚不清晰。
发明内容
本发明旨在提供更多肝硬化患者肠道菌群修饰的知识,提供有针对性的微生物标志物, 为早期发现疾病提供一种非侵入性方法。合理有效地应用微生物标志物,扶持肠道有益菌(如双歧杆菌)的生长,抑制肠道潜在致病菌(如肠杆菌科细菌)等,可以阻止肠道屏障的缺损,改善并恢复肠道微生态结构,对于降低血内毒素水平,减轻肝硬化的临床症状具有重要意义。
本发明的目的是提供肝硬化微生物标志物及应用。
一种微生物标志物,选自肝硬化患者组中富集的微生物Veillonella atypica ACS-134-V-Col7a或健康组富集的两种微生物Bacteroides uniformis ATCC8492、Clostridiales中的一种或多种。富集是指通过失踪基因找到显著差异基因,并且同源性大于95%的基因进行的聚类。
所述的微生物标志物,同时具有选自肝硬化患者组中富集的微生物,以及选自健康组富集的两种微生物中的一种或两种。
治疗肝硬化的药物,所述药物促进或者增加所述的选自健康组富集两种微生物Bacteroides uniformis ATCC8492、Clostridiales中的一种或两种,和/或抑制或清除所述的选自肝硬化患者组中富集的微生物Veillonella atypica ACS-134-V-Col7a。
生产或筛选药物的方法,所述药物促进或者增加所述的选自健康组富集两种微生物Bacteroides uniformis ATCC8492、Clostridiales中的一种或两种,和/或抑制或清除所述的选自肝硬化患者组中富集的微生物Veillonella atypica ACS-134-V-Col7a。
所述的药物治疗或干预前,检测对象肠道菌群中是否富集有所述的微生物标志物。
所述的检测步骤包括:
a、从对象粪便中提取DNA样本;
b、针对DNA样本构建测序文库;
c、对测序文库进行高通量测序,获得测序结果;
d、根据测序结果,确定所述对象的肠道菌群中是否存在所述的微生物标志物。
所述的步骤d中进一步包括:针对肠道菌群中的微生物标志物的相对丰度进行检测,通过所得到的相对丰度值与预定的cutoff值进行比较。
步骤c中,根据测序结果得到基因聚类方法,提出一种宏基因物种(MGS)的方法。
有益微生物组合或者功能性食品,含有选自所述的健康组富集的两种微生物Bacteroides uniformis ATCC8492、Clostridiales中的一种或两种。
检测肝硬化、监测治疗进程,或者生产、筛选药物的试剂盒,用于检测所述的微生物标志物。
本发明的有益效果:提供了诊断或治疗肝硬化患者,或者易感肝硬化人群的微生物标志物,可以有效监测肝硬化的易感人群(包括家族遗传和外来因素引起)或者发现早期患者, 以及监控肝硬化的治疗效果;将该微生物标志物用于治疗肝硬化的药物,或者生产或筛选治疗肝硬化的药物方法;提供了利用微生物标志物的有益微生物组合或者功能性食品;提供了利用微生物标志物的试剂盒等。
附图说明
图1为实验分析流程示意图;
图2a、图2b为宏基因组物种分类学示意图;
2a中中国肝硬化患者及健康人群富集的MGS。一个MGS中的基因,如果通过blastN与已知的基因组数据库对比后,若对比上两条序列的覆盖度>90%,覆盖部分的相似度>95%,那么就把这个就把这个MGS分类给所比对上的基因组。未达到阀值的MGS,归类到最低分类水平,即至少80%的基因与最佳BlastP分类一致;本标准适用于所有更高水平的分类。
2b中58个样本的分类归类与丹麦人肠道基因富集相关联。
具体实施方式
下面将结合附图和实施例对本发明的实施方案进行详细描述,但是本领域技术人员将理解,下列附图和实施例仅用于说明本发明,而不是对本发明的范围的限定。根据附图和优选实施方案的下列详细描述,本发明的各种目的和有利方面对于本领域技术人员来说将变得显然。在本发明中,除非另有说明,否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且,本文中所使用的各种实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的常规步骤。
实施例中,我们从98个肝硬化患者、83个健康对照的粪便样品开展整个肠道菌群微生物的关联分析研究描述粪便微生物群落及功能成分特征。总的来说,我们获得约860Gb高质量的测序数据,构建了肝硬化参照基因集。这个基因集包含269万个基因,36.1%是之前未公布的。定量宏基因组分析显示在大量的病人及健康对照组中,75,245个基因呈现显著差异(fdr<0.0001)。一大部分的基因可以归类为66个代表细菌物种的基因簇,其中肝硬化患者组中主要富集的是1个MGS(metagenomic species,表3),健康组中主要富集的是2个MGS(表2)。实施例的第一阶段为发现阶段:98个肝硬化患者及83个健康对照组的肠道微生物成分及功能改变阶段;第二阶段为验证阶段:25个肝硬化患者及31个健康对照组验证第一阶段结果的准确性。
实施例1:样本收集和DNA提取
肝硬化患者来自杭州浙江大学第一附属医院,匹配健康对照组是志愿者,实验共采集了181例粪便样品,98个中国肝硬化患者的粪便样品及83个健康中国人的粪便样品,其中每个 个体的新鲜粪便样品分成200mg/份,共5份,立即-80℃冰箱冷冻保存。
98个中国肝硬化患者的粪便样品及83个健康中国人的粪便样品中提取总DNA。苯酚三氯甲烷处理提取DNA方法提取DNA。
实施例2:构建文库及测序
DNA建库按仪器制造商(Illumina)的操作指南进行。对文库进行PE2*100bp测序。Illumina HiSeq2000(Illumina,San Diego,CA)平台对181个样品的文库进行测序。每个样本平均产生4.74Gb(sd.±2.04Gb)高质量测序结果,总计858Gb测序数据量。
参照图1的实验流程,鉴定肝硬化的相关微生物标志物,其中省略的步骤或者细节为本领域技术人员所熟知,几个重要步骤介绍如下面几个实施例所述。
实施例3:生物标志物的鉴定
3.1测序数据的基本处理
获得第一期的181个样品的测序数据以后,对其进行过滤,质控按以下标准进行:a)移除大于3个N碱基的reads;b)去除低质量(Q20)的N50reads;c)移除超过10个低质量(Q2)的碱基或指定尾部N碱基数。丢失成对reads的序列被认为是单条reads用于组装。
3.2获得一套肝硬化微生物组基因集
宏基因组生物标志物主体是基因和相对应的功能,因此需要对测序序列进行组装和基因预测,去冗余,构建非冗余参考基因集。用SOAPdenovo软件将所有样品reads组装成contigs(组装片段)。将样本的未组装reads合并进行从新(de novo)组装。终由总reads数的61.68%产生440万contigs(最小片段长度为500bp)。这些contigs总长11.1Gb,N50长度范围为1,673~48,822bp,平均长度为8,644bp。
为了预测181个样本的每个样本微生物基因,我们采用MetaHIT人类肠道基因组研究中的方法。MetaGene程序从预测到13,371,697个长度大于100bp的开放阅读框(ORFs)。预测的ORFs总长为9,495,923,532bp,占contigs总长度的90.28%。在ORFs中,1,047,855(54.6%)是完整的基因,869,808(45.4%)是不完整的。通过去除多余ORFs来建立非冗余“LC基因集”,定义为配对后超过95%与90%配对的短ORFs一致。最终的非冗余肝硬化肠道基因集包含2,668,468个ORFs,平均长度750bp,42%的reads可比对到基因库。
将我们的LC基因集与3个其他肠道微生物基因集对比,MetaHIT,HMP和T2D。比对时所有基因预测使用相同的标准。MetaHIT库包含3,452,726个基因,HMP含4,768,112个基因,T2D含2,148,029个基因。四个基因集的有674,131共有基因。LC、MetaHIT、HMP、T2D 基因集分别包含794,647、1,429,517、2,620,096、623,570个unique基因。
来自LC、T2D、MetaHIT基因库的基因与非冗余基因集合并,随后进行分析。不包含HMP肠道基因集,因为它包含sanger、454或Illumina16S序列,除了整个宏基因组数据,它由对照组健康人群产生,而非患者。库含5,382,817个基因,其中797,690个为其他三个基因库共有。LC基因集中的基因有63.9%存在于其他一个或两个基因集中,37.1%是独特(unique)基因。中国人基因在LC基因集和T2D基因集中存在极大的差异。
3.3生物丰度分析
SOAPalign2.21用于匹配针对冗余基因组的paired-end clean reads,参数为–r2–m200–x1000。Reads与冗余基因组比对,可能被分为两部分:a)Unique reads(U):reads只与一个基因组比对;这些基因被定义为unique reads。b)Multiple reads(M):如果这些基因组来着同一物种,reads与一个以上的基因组比对;我们将这些reads定义为unique reads。如果来着不同物种,我们定义为multiple reads。
对于物种S,如果丰度为Ab(S),可能与U特有reads和M共享reads相关,评估方式如下:
Ab(S)=Ab(U)+Ab(M)
Ab(U)=U/l
Ab(M)=(Σi=1MCo*{M})/l]]>
Ab(U)和Ab(M)分别为unique和multiple的丰度,l表示基因组长度。每个multiple reads,有特异物种系数Co;使我们假设{M}在不同物种中有相关N,然后按以下方法计算CO:
Co=UΣi=1NAb(U)]]>
对于这些reads,我们加N的unique丰度作为标准。
3.4基因丰度分析
当末端基因能对其在同一个基因上计算基因的丰度。如果一个基因上配对末端只有一个read可以对齐,通过检查将先前未对齐的翻译区域或不读取read与组装序列进行匹配。如果为匹配上了将读取的基因数进行验证,如果没有,那么就忽略。
当计算基因的丰度,我们使用生物的丰度分析相同的策略。对于给定的基因G,其丰度为Ab(G),可能与U独有reads和M共享reads相关,评估方式如下:
Ab(S)=Ab(U)+Ab(M)
Ab(U)=U/l
Ab(M)=(Σi=1MCo*{M})/l]]>
Ab(U)和Ab(M)分别为unique和multiple的丰度,l表示基因组长度。每个multiple reads,有特有物种系数Co;使我们假设{M}在不同物种中有相关N,然后按以下方法计算CO:
Co=UΣi=1NAb(U)]]>
对于这些reads,我们加N的unique丰度作为标准。
实施例4关联分析/筛选物种标记物(微生物标志物)
为了研究正常人(83例)与肝硬化患者(98例)的肠道宏基因组学的相关性,在合并后的基因集中做了一个相关性的研究。基于181个样本的基因集上鉴定不同丰度的基因,通过结合Benjamini Hochberg的多重检验的Wilcoxon秩和检验进行检验。使用一个非常严格的阈值(fdr<0.0001)发现在健康组和肝硬化组之间的显著差异基因有75245个。采用中位数检验发现其中49830个基因在肝硬化病人中更富集,25415个基因在健康组富集。在这75245个基因基础上做PCA分析,显示在健康组和肝硬化组之间有显著差异。
为了探索及理解与肝硬化相关的物种标记物,根据丰度表将基因进行分组。同个个体中已给物种的基因丰度相似,而不同个体的同一物种基因差异显著,所以同一物种的基因可以通过丰度相关有效聚类。由此产生的簇表示宏基因组物种(MGS)。为了从结构上整体上分析大量的宏基因组数据,减少信息量进行分类描述,以Le Chatelier等在2013年Nature上发表的关于宏基因组物种(MGS)聚类的研究为依据。简单地说,首先用所有个体的基因丰度计算不同基因两两斯皮尔曼相关系数,将给定阀值的相关基因聚类(单聚类)。将同一物种的基因归为一类,设定了阀值为rho>0.7。为了矫正第一次分类的部分丢失,进行了第二次分类,这次分类使用的是每组中相关性最好的前50个基因丰度的平均值。如果平均值之间的斯皮尔曼相关系数大于0.85,就将这两个组合并。
这部分用的分别是49,830个肝硬化病人基因以及25,415健康人群基因。健康人群25,415基因中的21,423个基因第一次51个基因到2702个基因分类成43个簇,第二次分类形成的51个基因到2970基因组成的38个簇。肝硬化患者49,830基因中的31386个第一步51-300个基因分类成60个簇,第二步51个基因到5755个基因分类形成28个簇。
为了证明基因簇中的基因属于基因组且与MGS分类注释一致,对6006个基因组(参照截止2012年8月的第三版的NCBI中的有效参考基因组和HMP、MetaHIT的DACC肠道基因组,)进行了blastN及blastP分析。当blastN后有大于80%示踪基因比对到基因组上,比 对上的部分占较短ORF的90%,相似度达到95%,将MGS分配到基因组。6个“健康”和24个“肝硬化”MGS归类到种属水平(图2a和表1)。剩余的MGS用blastP分析注释,如其50失踪基因大于80%与归类一致,则将其归类到相应属、目分类水平。所有36个剩余物种,除了1个可归类到给定的属、种或目。标记基因均匀注释验证了聚类质量,适用于整个MGS基因,通过50个示踪基因完成了66个MGS的计算。
表1物种标记物


探索物种水平注释的MGS本质,我们建立了参考库,收集114个公开的有效链球菌,梭菌属,乳酸菌,韦尔氏球菌属及巨型球菌属基因集,主要是口腔或肠道分离出来的微生物。用Blast及T值比对MGS,16个相似的肝硬化MGS归为一类,注意几点:
(1)达到95%同源性&90%覆盖率(Q);
(2)平均同源性(R);
(3)theaverage覆盖度(S);
(4)T=Q*R*S。
这种标准得到的大多数肝硬化患者MGS(15/28)是来自口腔,但有6个来自肠道或粪便,包括回肠单物种。为进一步解释肝硬化富集的MGS的来源,我们用BlastN将它们与3个有效回肠宏基因组比对。
75,245个显著差异基因的大多数(70%)聚类成66MGS。其中38个MGS包含健康个体的21,423个基因,28MGS包含患者的31,386个基因(表1)。之前结果表明示踪基因只存在于同源基因组,当更多测序后存在于所有同源基因组,由此可用于大量的MGS。健康人与肝硬化患者66MGS的丰度存在显著差异。
实施例5验证
为了证实实施例4中的发现,进一步比较验证群中的31个健康人及21个肝硬化患者的MGS丰度,DNA的提取和测序以及基因丰度的分析按照实施例1、实施例2和实施例3进行。尽管由于研究人群数减少而降低了统计可靠性,本发明仍发现存在显著差异(q<0.05)。
富集在健康人群38MGS中,只有小部分(15.8%)通过BlastN(95%)、overlap(90%)处理分配到物种发育系统信息。结果反映缺乏分离及测序的肠道菌株。此外,令人惊讶的是中国健康人富含的38MGS同时存在于丹麦人群中(图2b)。由于在整体基因丰度功能中,细菌群落的组成差异很大,我们对中国及丹麦人群的38MGS进行了检查。之前报道其中33MGS(86.8%)与q<10-3的中国人群一一对应,26MGS(78.8%)与丹麦人群中相似。另外,15MGS中国人群基因丰度存在显著差异(q≤10-11),10MGS(66.7%)与相同阀值的丹麦人群一一对应。这些发现表明可能与欧洲大陆健康人肠道群落相似。这提示我们比较健康人和肝硬化患者的基因丰度;另外之前有报道指出肥胖和炎症性肠病病人基因丰度较低。健康人群富集的38个MGS中至少有2个MGS追溯到菌种的分类水平,其中如下表(表2)所示。
表2健康人群中富集的物种标记物

MGSTaxonomic assignmentH_4Bacteroides uniformis ATCC8492H_7Clostridiales

与健康人的MGS形成鲜明对比,绝大多数患者MGS(28个中占24)可比对到一个物种。由于单独改变使得这种差异难以察觉,表示肠道微生物组成被高度修改。
肝硬化患者中富集的其中一个物种如下表(表3)所示为:非典型韦荣菌Veillonella atypica,细菌会导致感染如自发性细菌性腹膜炎、肝脓肿、难治性呼吸道感染、后天性关节感染、心内膜炎和菌血症。潜在病原体取代有助于缺少胆汁使小部位肠道变得更加宽松健康的丁酸生产菌,反过来导致与肝硬化相关的危及生命的感染。
表3肝硬化患者富集的物种标记物
MGSTaxonomic assignmentL_4Veillonella atypica ACS-134-V-Col7a

利用上述物种标记物来诊断、治疗肝硬化患者,监测治疗进程,或者生产筛选药物、功能性食品、益生菌,生产检测上述物种标记物的试剂盒以及装置等为本领域技术人员所知悉,皆在本发明的保护范围之内。
物种标志物可以选自肝硬化患者富集的物种标记物或者健康人群中富集的物种标记物中的一种或者多种。优选的,对于肝硬化患者或易感人群,应该检测到表3中的物种标志物被富集,同时表2中物种标记物不被富集。
治疗方案中,优选的,使表3中的物种标志物生长得到抑制或者清除,使表2中物种标记物被富集。

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1、10申请公布号CN104195146A43申请公布日20141210CN104195146A21申请号201410334287122申请日20140715C12N15/31200601C12Q1/68200601A23L1/29200601A61K45/00200601A61P1/1620060171申请人浙江大学地址310027浙江省杭州市西湖区浙大路38号72发明人李兰娟秦楠74专利代理机构杭州求是专利事务所有限公司33200代理人林松海54发明名称肝硬化微生物标志物及应用57摘要本发明公开了肝硬化微生物标志物及应用。微生物标志物,选自肝硬化患者组中富集的一种微生物VEILLONELLAA。

2、TYPICAACS134VCOL7A或健康组富集的两种微生物BACTEROIDESUNIFORMISATCC8492、CLOSTRIDIALES中的一种或多种。治疗肝硬化的药物,所述药物促进或者增加所述的选自健康组富集两种微生物BACTEROIDESUNIFORMISATCC8492、CLOSTRIDIALES中的一种或两种,和/或抑制或清除所述的选自肝硬化患者组中富集的微生物VEILLONELLAATYPICAACS134VCOL7A。针对肠道菌群中的微生物标志物的相对丰度进行检测,通过所得到的相对丰度值与预定的CUTOFF值进行比较。有益微生物组合或者功能性食品,含有选自所述的健康组富集的。

3、两种微生物BACTEROIDESUNIFORMISATCC8492、CLOSTRIDIALES中的一种或两种。检测肝硬化、监测治疗进程,或者生产、筛选药物的试剂盒,用于检测所述的微生物标志物。51INTCL权利要求书1页说明书10页附图2页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书10页附图2页10申请公布号CN104195146ACN104195146A1/1页21一种微生物标志物,其特征在于,选自微生物VEILLONELLAATYPICAACS134VCOL7A、BACTEROIDESUNIFORMISATCC8492、CLOSTRIDIALES中的一种或多种。2。

4、根据权利要求1所述的微生物标志物,其特征在于,同时具有VEILLONELLAATYPICAACS134VCOL7A和选自微生物BACTEROIDESUNIFORMISATCC8492、CLOSTRIDIALES的一种或两种。3一种治疗肝硬化的药物,其特征在于,所述药物促进或者增加BACTEROIDESUNIFORMISATCC8492、CLOSTRIDIALES中的一种或两种,和/或抑制或清除微生物VEILLONELLAATYPICAACS134VCOL7A。4一种生产或筛选药物的方法,其特征在于,所述药物促进或者增加BACTEROIDESUNIFORMISATCC8492、CLOSTRIDI。

5、ALES中的一种或两种,和/或抑制或清除微生物VEILLONELLAATYPICAACS134VCOL7A。5根据权利要求4所述的方法,其特征在于,所述的药物治疗或干预前,检测对象肠道菌群中是否富集有如权利要求1或2中所述的微生物标志物。6根据权利要求5所述的方法,其特征在于,所述的检测步骤包括、从对象粪便中提取DNA样本;、针对DNA样本构建测序文库;、对测序文库进行高通量测序,获得测序结果;、根据测序结果,确定所述对象的肠道菌群中是否存在所述的微生物标志物。7根据权利要求所述的方法,其特征在于,所述的步骤中进一步包括针对肠道菌群中的微生物标志物的相对丰度进行检测,通过所得到的相对丰度值与预。

6、定的CUTOFF值进行比较。8根据权利要求所述的方法,其特征在于,所述的步骤中,根据测序结果得到基因聚类方法,提出一种宏基因物种(MGS)的方法。9一种有益微生物组合或者功能性食品,其特征在于,含有选自微生物BACTEROIDESUNIFORMISATCC8492、CLOSTRIDIALES中的一种或两种。10一种检测肝硬化、监测治疗进程,或者生产、筛选药物的试剂盒,其特征在于,用于检测如权利要求中所述的微生物标志物。权利要求书CN104195146A1/10页3肝硬化微生物标志物及应用技术领域0001本发明涉及基因工程和生物医药领域,具体涉及肝硬化的微生物标志物及其应用。背景技术0002肝硬。

7、化LIVERCIRRHOSIS是临床常见的慢性进行性肝病,由一种或多种病因长期或反复作用形成的弥漫性肝损害。肝硬化是许多肝脏疾病的晚期病变,是由病毒性肝炎、酒精中毒、营养障碍、胆汁淤积、血吸虫病、循环障碍等各种原因所致,其特点是肝细胞变性和坏死。早期肝硬化通过及时防治可以逆转或不再进展,而晚期将不可逆转,严重影响患者的生活质量,甚至危及生命。0003在中国最常见的病因是病毒性肝炎,主要是乙型病毒性肝炎,其次为丙型肝炎。而自发性腹膜炎、肝腹水、肝肾综合征、肝性脑病、食道静脉曲张、出血、原发性肝癌等这些肝硬化并发症的危害也是有目共睹的。面对现代如此多的治疗手段,却有很大一部分肝硬化患者依旧痛苦不堪。

8、,每日仍遭受着肉体上的折磨、心理上的恐惧以及精神上的摧残。0004肝硬化患者由于门脉高压,肝脏功能障碍致胆汁分泌异常,解毒能力下降,宿主抵抗力降低等因素,导致肠道屏蔽功能破坏,微生物环境发生改变,肠道菌群失调。然而,与肝硬化进程相关的肠道微生物的系统发育及功能成分的变化还不清楚。尽管有些研究GARCIAETAL2004,WIESTETAL2012,BASSETAL2010表明肠道微生物的改变在末期肝硬化并发症中起重要作用如自发细菌腹膜炎及肝性脑病,以及诱导早期肝脏疾病及促进肝损伤作用如酒精性肝病及非酒精性脂肪肝病,肠道菌群与人肝脏病理之间的明确关联仍未知。有研究YIJHETAL1999,PAI。

9、KYHETAL2003表明可能是由于患者肠道细菌过度繁殖并产生内毒素,抑制肠上皮细胞蛋白质合成,小肠微绒毛出现形态学的改变,肠细胞质膜异常,细胞支架组织结构发生改变,肠刷状缘载体位置或细胞骨架上载体锚定点改变,导致氨基酸和碳水化合物在通过空肠刷状缘薄膜的运输过程缺陷,然而其具体机制有待于进一步的研究。0005肝硬化及酒精性肝病患者通过16SRRNA测序研究揭示了一个肠道微生物中的类似实质性的改变CHENYETAL2011,YANAWETAL2011。肠道微生物中系统发育机制怎样发生改变尚不清晰。发明内容0006本发明旨在提供更多肝硬化患者肠道菌群修饰的知识,提供有针对性的微生物标志物,为早期发。

10、现疾病提供一种非侵入性方法。合理有效地应用微生物标志物,扶持肠道有益菌如双歧杆菌的生长,抑制肠道潜在致病菌如肠杆菌科细菌等,可以阻止肠道屏障的缺损,改善并恢复肠道微生态结构,对于降低血内毒素水平,减轻肝硬化的临床症状具有重要意义。0007本发明的目的是提供肝硬化微生物标志物及应用。说明书CN104195146A2/10页40008一种微生物标志物,选自肝硬化患者组中富集的微生物VEILLONELLAATYPICAACS134VCOL7A或健康组富集的两种微生物BACTEROIDESUNIFORMISATCC8492、CLOSTRIDIALES中的一种或多种。富集是指通过失踪基因找到显著差异基因。

11、,并且同源性大于95的基因进行的聚类。0009所述的微生物标志物,同时具有选自肝硬化患者组中富集的微生物,以及选自健康组富集的两种微生物中的一种或两种。0010治疗肝硬化的药物,所述药物促进或者增加所述的选自健康组富集两种微生物BACTEROIDESUNIFORMISATCC8492、CLOSTRIDIALES中的一种或两种,和/或抑制或清除所述的选自肝硬化患者组中富集的微生物VEILLONELLAATYPICAACS134VCOL7A。0011生产或筛选药物的方法,所述药物促进或者增加所述的选自健康组富集两种微生物BACTEROIDESUNIFORMISATCC8492、CLOSTRIDIA。

12、LES中的一种或两种,和/或抑制或清除所述的选自肝硬化患者组中富集的微生物VEILLONELLAATYPICAACS134VCOL7A。0012所述的药物治疗或干预前,检测对象肠道菌群中是否富集有所述的微生物标志物。0013所述的检测步骤包括0014A、从对象粪便中提取DNA样本;0015B、针对DNA样本构建测序文库;0016C、对测序文库进行高通量测序,获得测序结果;0017D、根据测序结果,确定所述对象的肠道菌群中是否存在所述的微生物标志物。0018所述的步骤D中进一步包括针对肠道菌群中的微生物标志物的相对丰度进行检测,通过所得到的相对丰度值与预定的CUTOFF值进行比较。0019步骤C。

13、中,根据测序结果得到基因聚类方法,提出一种宏基因物种MGS的方法。0020有益微生物组合或者功能性食品,含有选自所述的健康组富集的两种微生物BACTEROIDESUNIFORMISATCC8492、CLOSTRIDIALES中的一种或两种。0021检测肝硬化、监测治疗进程,或者生产、筛选药物的试剂盒,用于检测所述的微生物标志物。0022本发明的有益效果提供了诊断或治疗肝硬化患者,或者易感肝硬化人群的微生物标志物,可以有效监测肝硬化的易感人群包括家族遗传和外来因素引起或者发现早期患者,以及监控肝硬化的治疗效果;将该微生物标志物用于治疗肝硬化的药物,或者生产或筛选治疗肝硬化的药物方法;提供了利用微。

14、生物标志物的有益微生物组合或者功能性食品;提供了利用微生物标志物的试剂盒等。附图说明0023图1为实验分析流程示意图;0024图2A、图2B为宏基因组物种分类学示意图;00252A中中国肝硬化患者及健康人群富集的MGS。一个MGS中的基因,如果通过BLASTN与已知的基因组数据库对比后,若对比上两条序列的覆盖度90,覆盖部分的相似度95,那么就把这个就把这个MGS分类给所比对上的基因组。未达到阀值的MGS,归类到最低分类水平,即至少80的基因与最佳BLASTP分类一致;本标准适用于所有更高水平的分说明书CN104195146A3/10页5类。00262B中58个样本的分类归类与丹麦人肠道基因富。

15、集相关联。具体实施方式0027下面将结合附图和实施例对本发明的实施方案进行详细描述,但是本领域技术人员将理解,下列附图和实施例仅用于说明本发明,而不是对本发明的范围的限定。根据附图和优选实施方案的下列详细描述,本发明的各种目的和有利方面对于本领域技术人员来说将变得显然。在本发明中,除非另有说明,否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且,本文中所使用的各种实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的常规步骤。0028实施例中,我们从98个肝硬化患者、83个健康对照的粪便样品开展整个肠道菌群微生物的关联分析研究描述粪便微生物群落及功能成分特征。总的来说,我们获得约860GB。

16、高质量的测序数据,构建了肝硬化参照基因集。这个基因集包含269万个基因,361是之前未公布的。定量宏基因组分析显示在大量的病人及健康对照组中,75,245个基因呈现显著差异FDR07。为了矫正第一次分类的部分丢失,进行了第二次分类,这次分类使用的是每组中相关性最好的前50个基因丰度的平均值。如果平均值之间的斯皮尔曼相关系数大于085,就将这两个组合并。0064这部分用的分别是49,830个肝硬化病人基因以及25,415健康人群基因。健康人群25,415基因中的21,423个基因第一次51个基因到2702个基因分类成43个簇,第二次分类形成的51个基因到2970基因组成的38个簇。肝硬化患者49。

17、,830基因中的31386个第一步51300个基因分类成60个簇,第二步51个基因到5755个基因分类形成28个簇。0065为了证明基因簇中的基因属于基因组且与MGS分类注释一致,对6006个基因组参照截止2012年8月的第三版的NCBI中的有效参考基因组和HMP、METAHIT的DACC肠说明书CN104195146A6/10页8道基因组,进行了BLASTN及BLASTP分析。当BLASTN后有大于80示踪基因比对到基因组上,比对上的部分占较短ORF的90,相似度达到95,将MGS分配到基因组。6个“健康”和24个“肝硬化”MGS归类到种属水平图2A和表1。剩余的MGS用BLASTP分析注释。

18、,如其50失踪基因大于80与归类一致,则将其归类到相应属、目分类水平。所有36个剩余物种,除了1个可归类到给定的属、种或目。标记基因均匀注释验证了聚类质量,适用于整个MGS基因,通过50个示踪基因完成了66个MGS的计算。0066表1物种标记物0067说明书CN104195146A7/10页90068说明书CN104195146A8/10页100069探索物种水平注释的MGS本质,我们建立了参考库,收集114个公开的有效链球菌,梭菌属,乳酸菌,韦尔氏球菌属及巨型球菌属基因集,主要是口腔或肠道分离出来的微生物。用BLAST及T值比对MGS,16个相似的肝硬化MGS归为一类,注意几点00701达到。

19、95同源性90覆盖率Q;00712平均同源性R;00723THEAVERAGE覆盖度S;00734TQRS。0074这种标准得到的大多数肝硬化患者MGS15/28是来自口腔,但有6个来自肠道或粪便,包括回肠单物种。为进一步解释肝硬化富集的MGS的来源,我们用BLASTN将它们与说明书CN104195146A109/10页113个有效回肠宏基因组比对。007575,245个显著差异基因的大多数70聚类成66MGS。其中38个MGS包含健康个体的21,423个基因,28MGS包含患者的31,386个基因表1。之前结果表明示踪基因只存在于同源基因组,当更多测序后存在于所有同源基因组,由此可用于大量的。

20、MGS。健康人与肝硬化患者66MGS的丰度存在显著差异。0076实施例5验证0077为了证实实施例4中的发现,进一步比较验证群中的31个健康人及21个肝硬化患者的MGS丰度,DNA的提取和测序以及基因丰度的分析按照实施例1、实施例2和实施例3进行。尽管由于研究人群数减少而降低了统计可靠性,本发明仍发现存在显著差异Q005。0078富集在健康人群38MGS中,只有小部分158通过BLASTN95、OVERLAP90处理分配到物种发育系统信息。结果反映缺乏分离及测序的肠道菌株。此外,令人惊讶的是中国健康人富含的38MGS同时存在于丹麦人群中图2B。由于在整体基因丰度功能中,细菌群落的组成差异很大,。

21、我们对中国及丹麦人群的38MGS进行了检查。之前报道其中33MGS868与Q103的中国人群一一对应,26MGS788与丹麦人群中相似。另外,15MGS中国人群基因丰度存在显著差异Q1011,10MGS667与相同阀值的丹麦人群一一对应。这些发现表明可能与欧洲大陆健康人肠道群落相似。这提示我们比较健康人和肝硬化患者的基因丰度;另外之前有报道指出肥胖和炎症性肠病病人基因丰度较低。健康人群富集的38个MGS中至少有2个MGS追溯到菌种的分类水平,其中如下表表2所示。0079表2健康人群中富集的物种标记物0080MGSTAXONOMICASSIGNMENTH_4BACTEROIDESUNIFORMI。

22、SATCC8492H_7CLOSTRIDIALES0081与健康人的MGS形成鲜明对比,绝大多数患者MGS28个中占24可比对到一个物种。由于单独改变使得这种差异难以察觉,表示肠道微生物组成被高度修改。0082肝硬化患者中富集的其中一个物种如下表表3所示为非典型韦荣菌VEILLONELLAATYPICA,细菌会导致感染如自发性细菌性腹膜炎、肝脓肿、难治性呼吸道感染、后天性关节感染、心内膜炎和菌血症。潜在病原体取代有助于缺少胆汁使小部位肠道变得更加宽松健康的丁酸生产菌,反过来导致与肝硬化相关的危及生命的感染。0083表3肝硬化患者富集的物种标记物0084MGSTAXONOMICASSIGNMEN。

23、TL_4VEILLONELLAATYPICAACS134VCOL7A0085利用上述物种标记物来诊断、治疗肝硬化患者,监测治疗进程,或者生产筛选药说明书CN104195146A1110/10页12物、功能性食品、益生菌,生产检测上述物种标记物的试剂盒以及装置等为本领域技术人员所知悉,皆在本发明的保护范围之内。0086物种标志物可以选自肝硬化患者富集的物种标记物或者健康人群中富集的物种标记物中的一种或者多种。优选的,对于肝硬化患者或易感人群,应该检测到表3中的物种标志物被富集,同时表2中物种标记物不被富集。0087治疗方案中,优选的,使表3中的物种标志物生长得到抑制或者清除,使表2中物种标记物被富集。说明书CN104195146A121/2页13图1图2A说明书附图CN104195146A132/2页14图2B说明书附图CN104195146A14。

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