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1、10申请公布号CN104195146A43申请公布日20141210CN104195146A21申请号201410334287122申请日20140715C12N15/31200601C12Q1/68200601A23L1/29200601A61K45/00200601A61P1/1620060171申请人浙江大学地址310027浙江省杭州市西湖区浙大路38号72发明人李兰娟秦楠74专利代理机构杭州求是专利事务所有限公司33200代理人林松海54发明名称肝硬化微生物标志物及应用57摘要本发明公开了肝硬化微生物标志物及应用。微生物标志物,选自肝硬化患者组中富集的一种微生物VEILLONELLAA。
2、TYPICAACS134VCOL7A或健康组富集的两种微生物BACTEROIDESUNIFORMISATCC8492、CLOSTRIDIALES中的一种或多种。治疗肝硬化的药物,所述药物促进或者增加所述的选自健康组富集两种微生物BACTEROIDESUNIFORMISATCC8492、CLOSTRIDIALES中的一种或两种,和/或抑制或清除所述的选自肝硬化患者组中富集的微生物VEILLONELLAATYPICAACS134VCOL7A。针对肠道菌群中的微生物标志物的相对丰度进行检测,通过所得到的相对丰度值与预定的CUTOFF值进行比较。有益微生物组合或者功能性食品,含有选自所述的健康组富集的。
3、两种微生物BACTEROIDESUNIFORMISATCC8492、CLOSTRIDIALES中的一种或两种。检测肝硬化、监测治疗进程,或者生产、筛选药物的试剂盒,用于检测所述的微生物标志物。51INTCL权利要求书1页说明书10页附图2页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书10页附图2页10申请公布号CN104195146ACN104195146A1/1页21一种微生物标志物,其特征在于,选自微生物VEILLONELLAATYPICAACS134VCOL7A、BACTEROIDESUNIFORMISATCC8492、CLOSTRIDIALES中的一种或多种。2。
4、根据权利要求1所述的微生物标志物,其特征在于,同时具有VEILLONELLAATYPICAACS134VCOL7A和选自微生物BACTEROIDESUNIFORMISATCC8492、CLOSTRIDIALES的一种或两种。3一种治疗肝硬化的药物,其特征在于,所述药物促进或者增加BACTEROIDESUNIFORMISATCC8492、CLOSTRIDIALES中的一种或两种,和/或抑制或清除微生物VEILLONELLAATYPICAACS134VCOL7A。4一种生产或筛选药物的方法,其特征在于,所述药物促进或者增加BACTEROIDESUNIFORMISATCC8492、CLOSTRIDI。
5、ALES中的一种或两种,和/或抑制或清除微生物VEILLONELLAATYPICAACS134VCOL7A。5根据权利要求4所述的方法,其特征在于,所述的药物治疗或干预前,检测对象肠道菌群中是否富集有如权利要求1或2中所述的微生物标志物。6根据权利要求5所述的方法,其特征在于,所述的检测步骤包括、从对象粪便中提取DNA样本;、针对DNA样本构建测序文库;、对测序文库进行高通量测序,获得测序结果;、根据测序结果,确定所述对象的肠道菌群中是否存在所述的微生物标志物。7根据权利要求所述的方法,其特征在于,所述的步骤中进一步包括针对肠道菌群中的微生物标志物的相对丰度进行检测,通过所得到的相对丰度值与预。
6、定的CUTOFF值进行比较。8根据权利要求所述的方法,其特征在于,所述的步骤中,根据测序结果得到基因聚类方法,提出一种宏基因物种(MGS)的方法。9一种有益微生物组合或者功能性食品,其特征在于,含有选自微生物BACTEROIDESUNIFORMISATCC8492、CLOSTRIDIALES中的一种或两种。10一种检测肝硬化、监测治疗进程,或者生产、筛选药物的试剂盒,其特征在于,用于检测如权利要求中所述的微生物标志物。权利要求书CN104195146A1/10页3肝硬化微生物标志物及应用技术领域0001本发明涉及基因工程和生物医药领域,具体涉及肝硬化的微生物标志物及其应用。背景技术0002肝硬。
7、化LIVERCIRRHOSIS是临床常见的慢性进行性肝病,由一种或多种病因长期或反复作用形成的弥漫性肝损害。肝硬化是许多肝脏疾病的晚期病变,是由病毒性肝炎、酒精中毒、营养障碍、胆汁淤积、血吸虫病、循环障碍等各种原因所致,其特点是肝细胞变性和坏死。早期肝硬化通过及时防治可以逆转或不再进展,而晚期将不可逆转,严重影响患者的生活质量,甚至危及生命。0003在中国最常见的病因是病毒性肝炎,主要是乙型病毒性肝炎,其次为丙型肝炎。而自发性腹膜炎、肝腹水、肝肾综合征、肝性脑病、食道静脉曲张、出血、原发性肝癌等这些肝硬化并发症的危害也是有目共睹的。面对现代如此多的治疗手段,却有很大一部分肝硬化患者依旧痛苦不堪。
8、,每日仍遭受着肉体上的折磨、心理上的恐惧以及精神上的摧残。0004肝硬化患者由于门脉高压,肝脏功能障碍致胆汁分泌异常,解毒能力下降,宿主抵抗力降低等因素,导致肠道屏蔽功能破坏,微生物环境发生改变,肠道菌群失调。然而,与肝硬化进程相关的肠道微生物的系统发育及功能成分的变化还不清楚。尽管有些研究GARCIAETAL2004,WIESTETAL2012,BASSETAL2010表明肠道微生物的改变在末期肝硬化并发症中起重要作用如自发细菌腹膜炎及肝性脑病,以及诱导早期肝脏疾病及促进肝损伤作用如酒精性肝病及非酒精性脂肪肝病,肠道菌群与人肝脏病理之间的明确关联仍未知。有研究YIJHETAL1999,PAI。
9、KYHETAL2003表明可能是由于患者肠道细菌过度繁殖并产生内毒素,抑制肠上皮细胞蛋白质合成,小肠微绒毛出现形态学的改变,肠细胞质膜异常,细胞支架组织结构发生改变,肠刷状缘载体位置或细胞骨架上载体锚定点改变,导致氨基酸和碳水化合物在通过空肠刷状缘薄膜的运输过程缺陷,然而其具体机制有待于进一步的研究。0005肝硬化及酒精性肝病患者通过16SRRNA测序研究揭示了一个肠道微生物中的类似实质性的改变CHENYETAL2011,YANAWETAL2011。肠道微生物中系统发育机制怎样发生改变尚不清晰。发明内容0006本发明旨在提供更多肝硬化患者肠道菌群修饰的知识,提供有针对性的微生物标志物,为早期发。
10、现疾病提供一种非侵入性方法。合理有效地应用微生物标志物,扶持肠道有益菌如双歧杆菌的生长,抑制肠道潜在致病菌如肠杆菌科细菌等,可以阻止肠道屏障的缺损,改善并恢复肠道微生态结构,对于降低血内毒素水平,减轻肝硬化的临床症状具有重要意义。0007本发明的目的是提供肝硬化微生物标志物及应用。说明书CN104195146A2/10页40008一种微生物标志物,选自肝硬化患者组中富集的微生物VEILLONELLAATYPICAACS134VCOL7A或健康组富集的两种微生物BACTEROIDESUNIFORMISATCC8492、CLOSTRIDIALES中的一种或多种。富集是指通过失踪基因找到显著差异基因。
11、,并且同源性大于95的基因进行的聚类。0009所述的微生物标志物,同时具有选自肝硬化患者组中富集的微生物,以及选自健康组富集的两种微生物中的一种或两种。0010治疗肝硬化的药物,所述药物促进或者增加所述的选自健康组富集两种微生物BACTEROIDESUNIFORMISATCC8492、CLOSTRIDIALES中的一种或两种,和/或抑制或清除所述的选自肝硬化患者组中富集的微生物VEILLONELLAATYPICAACS134VCOL7A。0011生产或筛选药物的方法,所述药物促进或者增加所述的选自健康组富集两种微生物BACTEROIDESUNIFORMISATCC8492、CLOSTRIDIA。
12、LES中的一种或两种,和/或抑制或清除所述的选自肝硬化患者组中富集的微生物VEILLONELLAATYPICAACS134VCOL7A。0012所述的药物治疗或干预前,检测对象肠道菌群中是否富集有所述的微生物标志物。0013所述的检测步骤包括0014A、从对象粪便中提取DNA样本;0015B、针对DNA样本构建测序文库;0016C、对测序文库进行高通量测序,获得测序结果;0017D、根据测序结果,确定所述对象的肠道菌群中是否存在所述的微生物标志物。0018所述的步骤D中进一步包括针对肠道菌群中的微生物标志物的相对丰度进行检测,通过所得到的相对丰度值与预定的CUTOFF值进行比较。0019步骤C。
13、中,根据测序结果得到基因聚类方法,提出一种宏基因物种MGS的方法。0020有益微生物组合或者功能性食品,含有选自所述的健康组富集的两种微生物BACTEROIDESUNIFORMISATCC8492、CLOSTRIDIALES中的一种或两种。0021检测肝硬化、监测治疗进程,或者生产、筛选药物的试剂盒,用于检测所述的微生物标志物。0022本发明的有益效果提供了诊断或治疗肝硬化患者,或者易感肝硬化人群的微生物标志物,可以有效监测肝硬化的易感人群包括家族遗传和外来因素引起或者发现早期患者,以及监控肝硬化的治疗效果;将该微生物标志物用于治疗肝硬化的药物,或者生产或筛选治疗肝硬化的药物方法;提供了利用微。
14、生物标志物的有益微生物组合或者功能性食品;提供了利用微生物标志物的试剂盒等。附图说明0023图1为实验分析流程示意图;0024图2A、图2B为宏基因组物种分类学示意图;00252A中中国肝硬化患者及健康人群富集的MGS。一个MGS中的基因,如果通过BLASTN与已知的基因组数据库对比后,若对比上两条序列的覆盖度90,覆盖部分的相似度95,那么就把这个就把这个MGS分类给所比对上的基因组。未达到阀值的MGS,归类到最低分类水平,即至少80的基因与最佳BLASTP分类一致;本标准适用于所有更高水平的分说明书CN104195146A3/10页5类。00262B中58个样本的分类归类与丹麦人肠道基因富。
15、集相关联。具体实施方式0027下面将结合附图和实施例对本发明的实施方案进行详细描述,但是本领域技术人员将理解,下列附图和实施例仅用于说明本发明,而不是对本发明的范围的限定。根据附图和优选实施方案的下列详细描述,本发明的各种目的和有利方面对于本领域技术人员来说将变得显然。在本发明中,除非另有说明,否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且,本文中所使用的各种实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的常规步骤。0028实施例中,我们从98个肝硬化患者、83个健康对照的粪便样品开展整个肠道菌群微生物的关联分析研究描述粪便微生物群落及功能成分特征。总的来说,我们获得约860GB。
16、高质量的测序数据,构建了肝硬化参照基因集。这个基因集包含269万个基因,361是之前未公布的。定量宏基因组分析显示在大量的病人及健康对照组中,75,245个基因呈现显著差异FDR07。为了矫正第一次分类的部分丢失,进行了第二次分类,这次分类使用的是每组中相关性最好的前50个基因丰度的平均值。如果平均值之间的斯皮尔曼相关系数大于085,就将这两个组合并。0064这部分用的分别是49,830个肝硬化病人基因以及25,415健康人群基因。健康人群25,415基因中的21,423个基因第一次51个基因到2702个基因分类成43个簇,第二次分类形成的51个基因到2970基因组成的38个簇。肝硬化患者49。
17、,830基因中的31386个第一步51300个基因分类成60个簇,第二步51个基因到5755个基因分类形成28个簇。0065为了证明基因簇中的基因属于基因组且与MGS分类注释一致,对6006个基因组参照截止2012年8月的第三版的NCBI中的有效参考基因组和HMP、METAHIT的DACC肠说明书CN104195146A6/10页8道基因组,进行了BLASTN及BLASTP分析。当BLASTN后有大于80示踪基因比对到基因组上,比对上的部分占较短ORF的90,相似度达到95,将MGS分配到基因组。6个“健康”和24个“肝硬化”MGS归类到种属水平图2A和表1。剩余的MGS用BLASTP分析注释。
18、,如其50失踪基因大于80与归类一致,则将其归类到相应属、目分类水平。所有36个剩余物种,除了1个可归类到给定的属、种或目。标记基因均匀注释验证了聚类质量,适用于整个MGS基因,通过50个示踪基因完成了66个MGS的计算。0066表1物种标记物0067说明书CN104195146A7/10页90068说明书CN104195146A8/10页100069探索物种水平注释的MGS本质,我们建立了参考库,收集114个公开的有效链球菌,梭菌属,乳酸菌,韦尔氏球菌属及巨型球菌属基因集,主要是口腔或肠道分离出来的微生物。用BLAST及T值比对MGS,16个相似的肝硬化MGS归为一类,注意几点00701达到。
19、95同源性90覆盖率Q;00712平均同源性R;00723THEAVERAGE覆盖度S;00734TQRS。0074这种标准得到的大多数肝硬化患者MGS15/28是来自口腔,但有6个来自肠道或粪便,包括回肠单物种。为进一步解释肝硬化富集的MGS的来源,我们用BLASTN将它们与说明书CN104195146A109/10页113个有效回肠宏基因组比对。007575,245个显著差异基因的大多数70聚类成66MGS。其中38个MGS包含健康个体的21,423个基因,28MGS包含患者的31,386个基因表1。之前结果表明示踪基因只存在于同源基因组,当更多测序后存在于所有同源基因组,由此可用于大量的。
20、MGS。健康人与肝硬化患者66MGS的丰度存在显著差异。0076实施例5验证0077为了证实实施例4中的发现,进一步比较验证群中的31个健康人及21个肝硬化患者的MGS丰度,DNA的提取和测序以及基因丰度的分析按照实施例1、实施例2和实施例3进行。尽管由于研究人群数减少而降低了统计可靠性,本发明仍发现存在显著差异Q005。0078富集在健康人群38MGS中,只有小部分158通过BLASTN95、OVERLAP90处理分配到物种发育系统信息。结果反映缺乏分离及测序的肠道菌株。此外,令人惊讶的是中国健康人富含的38MGS同时存在于丹麦人群中图2B。由于在整体基因丰度功能中,细菌群落的组成差异很大,。
21、我们对中国及丹麦人群的38MGS进行了检查。之前报道其中33MGS868与Q103的中国人群一一对应,26MGS788与丹麦人群中相似。另外,15MGS中国人群基因丰度存在显著差异Q1011,10MGS667与相同阀值的丹麦人群一一对应。这些发现表明可能与欧洲大陆健康人肠道群落相似。这提示我们比较健康人和肝硬化患者的基因丰度;另外之前有报道指出肥胖和炎症性肠病病人基因丰度较低。健康人群富集的38个MGS中至少有2个MGS追溯到菌种的分类水平,其中如下表表2所示。0079表2健康人群中富集的物种标记物0080MGSTAXONOMICASSIGNMENTH_4BACTEROIDESUNIFORMI。
22、SATCC8492H_7CLOSTRIDIALES0081与健康人的MGS形成鲜明对比,绝大多数患者MGS28个中占24可比对到一个物种。由于单独改变使得这种差异难以察觉,表示肠道微生物组成被高度修改。0082肝硬化患者中富集的其中一个物种如下表表3所示为非典型韦荣菌VEILLONELLAATYPICA,细菌会导致感染如自发性细菌性腹膜炎、肝脓肿、难治性呼吸道感染、后天性关节感染、心内膜炎和菌血症。潜在病原体取代有助于缺少胆汁使小部位肠道变得更加宽松健康的丁酸生产菌,反过来导致与肝硬化相关的危及生命的感染。0083表3肝硬化患者富集的物种标记物0084MGSTAXONOMICASSIGNMEN。
23、TL_4VEILLONELLAATYPICAACS134VCOL7A0085利用上述物种标记物来诊断、治疗肝硬化患者,监测治疗进程,或者生产筛选药说明书CN104195146A1110/10页12物、功能性食品、益生菌,生产检测上述物种标记物的试剂盒以及装置等为本领域技术人员所知悉,皆在本发明的保护范围之内。0086物种标志物可以选自肝硬化患者富集的物种标记物或者健康人群中富集的物种标记物中的一种或者多种。优选的,对于肝硬化患者或易感人群,应该检测到表3中的物种标志物被富集,同时表2中物种标记物不被富集。0087治疗方案中,优选的,使表3中的物种标志物生长得到抑制或者清除,使表2中物种标记物被富集。说明书CN104195146A121/2页13图1图2A说明书附图CN104195146A132/2页14图2B说明书附图CN104195146A14。