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1、10申请公布号CN104086522A43申请公布日20141008CN104086522A21申请号201410339604922申请日20140716C07D319/08200601C12P17/06200601A61K31/357200601A61P35/02200601C12R1/64520060171申请人沈阳药科大学地址110016辽宁省沈阳市沈河区文化路103号72发明人白皎裴月湖华会明李占林陈刚吕晓景74专利代理机构沈阳杰克知识产权代理有限公司21207代理人靳玲54发明名称一种螺二萘类化合物及其制备方法57摘要本发明涉及喜树植物内生真菌LASIODIPLODIAPSEUDOT。
2、HEOBROMAE发酵产物中提取分离的一种新的螺二萘类化合物及其在制备人急性早幼粒白血病细胞株HL60抑制剂中的应用。该化合物具有式I化学结构式，实验研究表明，它对人急性早幼粒白血病细胞株HL60具有较强的生长抑制作用，且其制备方法简单易行，重现性好，有利于对进行进一步的药理和临床研究，开发其在制备治疗白血病药物的应用。51INTCL权利要求书1页说明书5页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书5页10申请公布号CN104086522ACN104086522A1/1页21如式（I）所示的螺二萘类化合物。2根据权利要求1所述的螺二萘类化合物，其特征在于该化合物是从喜。
3、树植物内生真菌LASIODIPLODIAPSEUDOTHEOBROMAE发酵产物中分离得到的。3如权利要求1所述的螺二萘类化合物的制备方法，其特征在于将植物内生真菌LASIODIPLODIAPSEUDOTHEOBROMAE进行大量发酵，发酵产物经过滤得到发酵液和菌丝体，发酵液经浓缩后，用乙酸乙酯萃取；菌丝体用80丙酮水溶液超声提取，浓缩除去丙酮后，再用乙酸乙酯萃取，将发酵液乙酸乙酯萃取物和菌丝体乙酸乙酯萃取物合并后，从提取物中分离纯化出式（I）化合物。4根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于将合并的乙酸乙酯萃取物经硅胶柱色谱，用体积配比为10000100的二氯甲烷甲醇溶液或三氯甲烷甲醇溶液进。
4、行梯度洗脱，其中二氯甲烷甲醇或三氯甲烷甲醇体积配比为10011002的洗脱物再经SEPHADEXLH20凝胶柱色谱，用甲醇洗脱，并经半制备ODS高效液相色谱进行纯化，以体积配比为70305050的甲醇水溶液为流动相洗脱，得式I化合物。5一种药物组合物，其特征在于，包含权利要求1所述的螺二萘类化合物。6权利要求1所述的螺二萘类化合物或权利要求5所述的组合物在制备治疗白血病药物中的应用。权利要求书CN104086522A1/5页3一种螺二萘类化合物及其制备方法技术领域0001本发明属于医药技术领域，涉及从喜树来源植物内生真菌LASIODIPLODIAPSEUDOTHEOBROMAE发酵液中提取分离。
5、得到的一种新的螺二萘类化合物及其制备方法及其在制备人急性早幼粒白血病细胞株HL60抑制剂中的用途。背景技术0002螺二萘类化合物是一类结构独特的天然产物，文献报道其主要从植物内生真菌NATTRASSIAMANGIFERAE、海洋真菌ASCOCHYTASPNGB4以及一些植物的茎干如JATROPHACURCAS和BRUGUIERAGYMNORRHIZA中分离得到，而本发明所涉及的真菌LASIODIPLODIAPSEUDOTHEOBROMAE代谢产物中尚未有该类化合物的报道。0003根据文献记载，该类化合物具有抗肿瘤、抗菌、免疫抑制等作用。例如从NATTRASSIAMANGIFERAE中分离得到的。
6、SCH50673和SCH50676对人纤维肉瘤细胞HT1080具有细胞毒作用，其IC50值分别为62和28M；从海洋真菌ASCOCHYTASPNGB4中分得的ASCOCHYTATIN对人肺癌细胞A549和白血病JURKAT细胞均表现出明显的生长抑制作用，其IC50值分别为48和63M，且其具有非常强的抗革兰氏阳性菌和白色念珠菌的作用；从植物BRUGUIERAGYMNORRHIZA的茎干中分离得到的PALMARUMYCINBG5对人乳腺癌细胞MCF7和人白血病细胞HL60均具有强的细胞毒作用，其IC50值分别为76和31M。本发明所涉及的螺二萘类化合物迄今在国内外尚未见有相关专利或文献报道。发明。
7、内容0004本发明提供一种从喜树植物内生真菌LASIODIPLODIAPSEUDOTHEOBROMAE发酵液中提取分离的新螺二萘类化合物，其结构如式I所示00050006本发明还提供所述化合物在制备治疗白血病药物中的应用。0007本发明的制备技术方案包括如下步骤0008将分离自四川攀枝花喜树植物树枝部分的内生真菌LASIODIPLODIAPSEUDOTHEOBROMAE进行大量发酵，发酵产物经过滤得到发酵液和菌丝体。发酵液经浓缩后，用乙酸乙酯萃取；菌丝体用80丙酮水溶液超声提取，浓缩除去丙酮后，再用乙酸乙酯萃说明书CN104086522A2/5页4取。将发酵液乙酸乙酯萃取物和菌丝体乙酸乙酯萃取。
8、物合并后，经硅胶柱色谱，用体积配比为10000100的二氯甲烷甲醇或三氯甲烷甲醇溶液进行梯度洗脱，其中二氯甲烷甲醇体积配比为10011002的洗脱物再经SEPHADEXLH20凝胶柱色谱，用甲醇水洗脱，并经半制备ODS高效液相色谱进行纯化，以体积配比为70305050的甲醇水溶液为流动相洗脱，得式I化合物。0009式I化合物为灰色粉末甲醇。10硫酸乙醇溶液V/V显色呈深灰色。35C04,MEOH；UVMEOH219,309,325,340NM；IRKBR3399,2927,2833,1642,1450,1384,1118,1030CM1；ECDMEOHNM221385,311149,36321。
9、4。HRESIMS中给出准分子离子峰MHM/Z3670808CALCDFOR3670812，结合其核磁共振波谱数据，确定式I化合物的分子式为C20H14O7。1HNMR600MHZ,DMSOD6谱中，给出三个酚羟基质子信号H12001H,S、9881H,S和9001H,S，和七个芳香氢信号H7691H,D,J85HZ、7391H,DD,J85,74HZ、7251H,D,J91HZ、7011H,D,J91HZ、6951H,D,J74HZ、6891H,D,J81HZ、6861H,D,J82HZ，一个活泼质子信号H5661H,D,J30HZ，一个次甲基质子信号H4231H,M和两个亚甲基质子信号H3。
10、161H,DD,J162,23HZ、2641H,DD,J164,41HZ。13CNMR150MHZ,DMSOD6谱给出20个碳信号，其中包括1个酮羰基碳信号C2035；1个缩酮碳信号C1004；16个SP2杂化的碳信号C1545、1498、1481、1479、1385、1286、1264、1249、1207、1199、1158、1156、1139、1107、1097、1093和2个SP3杂化的碳信号C656、434。0010将式I化合物的1HNMR、13CNMR信号通过HSQC和HMBC谱进行归属。在HMBC谱中，芳香质子信号7691H,D,J85HZ,H9与1481C1、1139C5、109。
11、3C7相关，7391H,DD,J85,74HZ,H8与1249C10相关，6951H,D,J74HZ,H7与1479C6、1158C9、1139C5相关，6891H,D,J81HZ,H3与1481C1、1385C4、1139C5相关，6861H,D,J82HZ,H2与1481C1、1385C4、1249C10相关，提示存在萘环结构片段；芳香质子信号7251H,D,J91HZ,H7与1545C9、1498C6、1199C5、1004C4相关，7011H,D,J91HZ,H8与1545C9、1498C6、1156C10相关，12001H,S,9OH与1545C9、1207C8、1156C10相关，。
12、9001H,S,6OH与1498C6、1286C7、1199C5相关，饱和碳上质子信号3161H,DD,J162,23HZ,H2与2035C1、656C3相关，5661H,D,J30HZ,3OH与1004C4相关，提示存在四氢化萘环结构片段；根据化合物不饱和度为14，提示结构中除了上述两个片段外，还有1个环状结构存在，1004C4通过2个氧原子将两个片段连接起来。0011通过以上解析，最终确定式I化合物即为本发明的螺二萘类化合物。0012表1式I化合物的1HNMR600MHZ,DMSOD6和13CNMR125MHZ,DMSOD6数据以及主要的HMBC相关0013说明书CN104086522A3。
13、/5页500140015对所得到的式I化合物进行肿瘤细胞生长抑制方面的研究。体外实验结果表明，式I化合物在体外对人急性早幼粒白血病细胞株HL60的具有显著的生长抑制作用，其IC50值为239M，与阳性对照药物5氟尿嘧啶5FU相当。因此，本发明所述的新螺二萘类化合物具有制备临床预防和治疗白血病药物的前景。0016本发明的优点在于，所得到的化合物结构新颖，且具有显著抑制肿瘤细胞生长的活性，其提取分离方法简易，重现性好，可通过微生物发酵培养大量获得，也可通过化学方法合成该类化合物，便于对其进行进一步的药理和临床研究，为开发疗效好且毒副作用小的新型抗白血病药物提供物质基础。具体实施方式0017下面所列。
14、实施例有助于本领域技术人员更好地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。0018实施例1式I化合物的发酵生产及分离精制00191发酵生产说明书CN104086522A4/5页60020生产菌的发酵培养喜树植物内生真菌LASIODIPLODIAPSEUDOTHEOBROMAE菌株经复苏后，从斜面转接到装有125ML培养液培养基组成甘露醇2，葡萄糖2，酵母膏05，蛋白胨1，KH2PO4005，MGSO47H2O003，玉米浆01，陈自来水配制的三角瓶500ML中，于28摇床上180RPM振荡培养2天后，获得种子培养液。然后将种子液按5的接种量接种到含有200ML新鲜、灭菌的真菌4号液体培养基的500。
15、ML三角瓶中，在室温条件下静置培养30天,获得发酵培养物约75L。00212粗提物的获得0022发酵培养物用16层纱布过滤，将菌丝体和发酵液分离。发酵液减压浓缩至10L，用等体积的乙酸乙酯萃取4次，减压浓缩得到发酵液乙酸乙酯萃取物。菌丝体菌丝体用80丙酮超声提取3次，每次1小时，浓缩除去丙酮后，再用乙酸乙酯萃取4次，浓缩后得到菌丝体乙酸乙酯萃取物。将发酵液乙酸乙酯萃取物和菌丝体乙酸乙酯萃取物合并后，得到总粗提物600G。00233化合物的分离精制0024总粗提取物600G经硅胶柱色谱，用体积配比为10000100的二氯甲烷甲醇进行梯度洗脱，其中二氯甲烷甲醇体积配比为10011002的洗脱物FR。
16、4再经SEPHADEXLH20凝胶柱色谱，用甲醇水洗脱，并经半制备高效液相色谱进行纯化，使用长度为250MM，内径为10MM的色谱柱，以内径为5MM的ODS为填料，以体积配比为5842的甲醇水为流动相洗脱，得式I化合物60MG，TR38MIN。0025实施例2式I化合物在体外对人急性早幼粒白血病细胞株HL60的生长抑制实验0026HL60细胞培养于含有10经加热灭活的胎牛血清、100IU/ML青霉素、100MG/ML链霉素及1MMOL/LL谷氨酰胺RPMI1640培养液中，37、5CO2饱和湿度培养箱中孵育。称取台盼蓝，加少量蒸馏水研磨，加双蒸水稀释到4的储存浓度，用滤纸过滤，4保存。使用时，。
17、将该储存液用PBS稀释至04工作浓度。取上述细胞5104/ML接种于12孔板，每孔2ML。加入不同浓度药物孵育后制备单个细胞悬液，取50L细胞悬液加入50L的04台盼蓝溶液，混匀，在3分钟内，于显微镜下观察，死细胞被染成蓝色，而活细胞拒染。用血球计数板分别计数活细胞和死细胞。化合物对HL60细胞的生长抑制作用通过细胞计数测得。取HL60细胞5104/ML接种于12孔板，每孔2ML。加入不同浓度式I化合物孵育后制备单个细胞悬液，用血球计数板分别计数对照孔和加药孔的细胞数。利用下列公式求得细胞生长抑制率1加药孔细胞数/对照孔细胞数100。按相同方法对阳性对照药5氟尿嘧啶进行测试。其IC50结果如表2所示。0027表2式I化合物在体外对人急性早幼粒白血病细胞株HL60的生长抑制作用0028COMPOUNDSIC50M式I化合物2395FU1870029体外实验结果表明，式I化合物在体外显示出较强的抑制人急性早幼粒白血病细说明书CN104086522A5/5页7胞株HL60生长的活性，其IC50为239M，与阳性对照药物5氟尿嘧啶5FU相当，有望开发其在制备人急性早幼粒白血病细胞株HL60抑制剂中的用途。说明书CN104086522A。