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1、10申请公布号CN104043111A43申请公布日20140917CN104043111A21申请号201410293289022申请日20140625A61K38/21200601A61K48/00200601C12N15/70200601C12N1/21200601A61P31/14200601C12R1/1920060171申请人中国水产科学研究院黑龙江水产研究所地址150070黑龙江省哈尔滨市道里区松发街43号72发明人曹永生徐黎明赵景壮卢彤岩74专利代理机构北京纪凯知识产权代理有限公司11245代理人关畅54发明名称虹鳟IFN2在制备抗IHN病毒产品中的应用57摘要本发明公开了虹鳟。
2、IFN2在制备抗IHNV病毒产品中的应用。本发明提供了RTIFN2蛋白或其编码基因或含有其编码基因的重组载体在制备抑制传染性造血器官坏死病病毒产品中的应用；所述RTIFN2蛋白的氨基酸序列为序列表中的序列2。本发明发现虹鳟IFN2可以抗IHNV的活性，本发明能够补充目前我国无抗IHNV有效制剂的现状，同时干扰素还具有免疫调节活性，可将RTIFN2进一步开发为虹鳟鱼用的天然免疫增强剂或佐剂。51INTCL权利要求书1页说明书5页序列表3页附图1页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书5页序列表3页附图1页10申请公布号CN104043111ACN104043111A。
3、1/1页21RTIFN2蛋白或其编码基因或含有其编码基因的重组载体在制备抑制传染性造血器官坏死病病毒产品中的应用；所述RTIFN2蛋白的氨基酸序列为序列表中的序列2。2根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述抑制病毒为抑制病毒的活性；所述RTIFN2蛋白来源于虹鳟。3根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于所述RTIFN2编码基因的核苷酸序列为序列表中序列1。4根据权利要求13中任一所述的应用，其特征在于所述重组载体为将所述RTIFN2编码基因插入表达载体得到的重组载体，所述表达载体具体为PET32A。5根据权利要求14中任一所述的应用，其特征在于所述产品为试剂盒或疫苗。6一种抑制传染性造血器。
4、官坏死病病毒的重组载体，为将所述RTIFN2编码基因插入表达载体得到的重组载体。7根据权利要求6所述的重组载体，其特征在于所述表达载体为PET32A。8一种抑制传染性造血器官坏死病病毒的重组菌，为将权利要求6或7所述的重组载体导入宿主细胞，得到的重组菌。9根据权利要求8所述的重组菌，其特征在于所述宿主细胞为大肠杆菌。10一种传染性造血器官坏死病疫苗，其活性成分为RTIFN2蛋白或其编码基因或含有其编码基因的重组载体或权利要求8所示的重组菌。权利要求书CN104043111A1/5页3虹鳟IFN2在制备抗IHN病毒产品中的应用技术领域0001本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种虹鳟IFN2在制备。
5、抗IHN病毒产品中的应用。背景技术0002近年鱼类干扰素的研究热度逐年提高，而干扰素的抗病毒作用一直是该项研究的焦点内容。较早的，2003年通过蚀斑减少实验，人工制备的大西洋鲑型干扰素1亚类被证实具有抗传染性胰腺坏死病毒感染的作用。随着研究的深入，斑马鱼、虹鳟、七带石斑鱼、草鱼被相继证实具备抵抗病毒复制的能力。其中值得注意的是以制备的七带石斑鱼和草鱼干扰素注射鱼，能使其各自能够抵抗病毒的感染，这为人工制备的鱼类干扰素临床应用的有效性提供了有力的证据。2005年虹鳟干扰素被首次克隆，并证实利用原核表达系统能够成功制备出具有活性的重组虹鳟干扰素，而2009年研究表明虹鳟干扰素有第二个亚型的存在RT。
6、IFN2，且其在疫苗免疫和病毒感染的初期表达水平显著高于RTIFN1。2011年研究者将虹鳟的IFN和大西洋鲑的型干扰素1亚类的抗病毒作用进行了比较，结果表明IFN能够上调MX蛋白、ISG15蛋白基因的表达，并很好的抑制传染性胰腺坏死病毒所导致的蚀斑形成，而与型干扰素1亚类相比，IFN能更为有效的诱导抗病毒蛋白GBP、干扰素调节转录因子、趋化因子IP10的产生。因此，利用低成本、易操作、高效的原核表达系统制备具有活性的虹鳟IFN2将具有很好的发展前景。0003随着我国鱼类养殖行业的发展，由于养殖密度的增大和环境的变化，鱼类病害的发生越发频繁。鱼类干扰素作为天然的抗病毒制剂，为防治乃至根治鱼类病。
7、毒病指出了崭新的应用前景。我国鱼干扰素的人工制备已逐渐受到重视，相关发明专利有3项，其中虹鳟干扰素制备及纯化的发明专利有1项2012年，2013年我国学者也对虹鳟型干扰素RTIFN3进行了人工制备。传染性造血器官坏死病INFECTIOUSHEMATOPOIETICNECROSIS，IHN常引起鱼苗或幼鱼高死亡率，并能隐性感染，是目前我国虹鳟养殖业的威胁因素之一，但截至目前还没有文献明确阐述传染性造血器官坏死病病毒INFECTIOUSHEMATOPOIETICNECROSISVIRUS，IHNV对虹鳟干扰素的敏感性。发明内容0004本发明的一个目的是提供RTIFN2蛋白或其编码基因或含有其编码基。
8、因的重组载体的用途。0005本发明提供的RTIFN2蛋白或其编码基因或含有其编码基因的重组载体在制备抑制传染性造血器官坏死病病毒产品中的应用；0006所述RTIFN2蛋白的氨基酸序列为序列表中的序列2。0007上述应用中，所述抑制病毒为抑制病毒的活性；所述RTIFN2蛋白来源于虹鳟。0008上述应用中，所述RTIFN2编码基因的核苷酸序列为序列表中序列1。0009上述应用中，所述重组载体为将所述RTIFN2编码基因插入表达载体得到的重说明书CN104043111A2/5页4组载体，所述表达载体具体为PET32A，在本发明的实施例中，重组载体为将序列表中序列1所示的IFN2基因插入载体PET32。
9、A的BAMHI和HINDIII酶切位点间得到的质粒。0010上述应用中，所述产品为试剂盒或疫苗。0011本发明的另一个目的是提供一种抑制传染性造血器官坏死病病毒的重组载体。0012本发明提供的重组载体，为将所述RTIFN2编码基因插入表达载体得到的重组载体。0013上述重组载体中，所述表达载体为PET32A。0014本发明的第三个目的是提供一种抑制传染性造血器官坏死病病毒的重组菌。0015本发明提供的重组菌，为将上述的重组载体导入宿主细胞，得到的重组菌。0016上述的重组菌中，所述宿主细胞为大肠杆菌。0017本发明第四个目的是提供一种传染性造血器官坏死病疫苗。0018本发明提供的传染性造血器官。
10、坏死病疫苗，其活性成分为RTIFN2蛋白或其编码基因或含有其编码基因的重组载体或上述重组菌。0019本发明的实验证明，本发明发现在RTIFN2可在大肠杆菌中高效表达，0051G/ML的RTIFN2在CHSE214细胞上对IHNV的抑制率为50，并能显著抑制IHNV在CHSE214细胞上蚀斑的形成，最终确定其抗IHNV的活性为663106U/MG，本发明能够补充目前我国无抗IHNV有效制剂的现状，同时干扰素还具有免疫调节活性，可将RTIFN2进一步开发为虹鳟鱼用的天然免疫增强剂或佐剂。附图说明0020图1为基因克隆及重组表达质粒构建0021图2为重组蛋白表达与纯化0022图3为蛋白RTIFN2抑。
11、制IHNV作用0023图4为蚀斑减少实验具体实施方式0024下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。0025下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。0026实施例1、虹鳟IFN2基因及表达其重组载体的获得00271、目的基因的克隆0028处死虹鳟ONCORHYNCHUSMYKISS，实验室保存、饲养，为常规虹鳟鱼种，迅速于冰上无菌剥取头肾和脾，加入适量的含10FBS的MEM培养基，注射器内柱碾压后经70M的尼龙网FISHERSCIENTIC公司产品过滤，经5G/ML的植物血凝素刺激后利用PROMEGA公司的RNA提取试剂盒提取总RNA，按照MMLV反转。
12、录酶说明书，以引物OLIGODT18进行反转录，获得CDNA第一条链。0029参考已发表的虹鳟IFN2序列GENBANKFM8643451，设计用于扩增RTIFN2的上下游引物，上游引物5ATCGGATCCGCTCAGTACACATCAATTAAC3下划线所示为BAMHI酶切位点，下游引物5GACAAGCTTTTACATGATGTGTGATTTGAG3下划线所示为HINDIII酶切位点。说明书CN104043111A3/5页50030以上述CDNA为模板，用上述上下游引物进行PCR扩增。0031PCR反应条件为94预变性7MIN，94变性30SEC，55退火30SEC，72延伸30SEC，共2。
13、5个循环后，再进行72终延伸10MIN。0032将PCR产物电泳检测，结果如图1A所示，A目的基因的克隆MDL2000DNAMARKER；1以头肾CDNA的RTPCR扩增；2以脾脏CDNA的RTPCR；3阴性对照，图1A显示以经PHA刺激后的头肾、脾淋巴细胞CDNA为模板均能够成功扩增出目的基因PCR产物，大小约为489BP。0033回收PCR产物，连接PMD18TSIMPLE载体，转化大肠杆菌DH5，得到转化子提取质粒送去测序，结果，PCR产物具有序列表中序列1所示的核苷酸，为IFN2基因，其编码的蛋白RTIFN2的氨基酸序列为序列表中序列2。将含有该PCR产物的质粒命名为PMD18TSIM。
14、PLEIFN2。00342、重组载体的构建0035利用限制性内切酶BAMHI和HINDIII切割PMD18TSIMPLEIFN2，回收489BP的酶切片段，将酶切片段与经过同样酶切的载体PET32A690153CN连接，转化大肠杆菌DH5，得到转化子。0036提取转化子的质粒，分别进行PCR鉴定引物为上下游引物、BAMHI单酶切鉴定和双酶切鉴定BAMHI和HINDIII酶切。0037结果如图1B所示，M1DL2000DNAMARKER；M2DL15000DNAMARKER；1重组质粒的PCR鉴定；2重组质粒的单切鉴定；3重组质粒的双酶切鉴定，可以看出，PCR和双酶切均得到489BP的产物，说明。
15、为阳性质粒。0038将阳性送去测序，结果该阳性质粒为将序列表中序列1所示的IFN2基因插入载体PET32A的BAMHI和HINDIII酶切位点间得到的质粒，其表达蛋白RTIFN2，命名为PET32ARTIFN2。0039将含有PET32ARTIFN2的转化子命名为DH5/PET32ARTIFN2。0040实施例2、虹鳟IFN2基因的应用00411、蛋白的表达及表达形式分析0042将重组菌DH5/PET32ARTIFN2于含100G/MLAMP的5MLLB培养基中，37，220RPM震荡培养过夜。次日将过夜培养物以1100比例接种于100MLLB培养基中，220RPM震荡培养至OD值达到0608。
16、，加入1MMIPTG诱导表达，4H后4000RPM，4下离心收集菌体。0043以1/10初始培养基体积的PBS重悬菌体，超声裂解破碎后分为上清和沉淀，SDSPAGE分析目的蛋白存在形式。0044结果如图2所示，M为蛋白质分子质量标准；1为表达菌株诱导前；2为表达菌株诱导后；3为表达菌株诱导后超声上清；4为表达菌株诱导后超声沉淀；5为目的蛋白的纯化，可以看出，SDSPAGE结果显示诱导后的重组菌在预期位置384KD处有明显的表达条带出现，而诱导前无此条带出现，表明目的蛋白能够在原核表达系统中正确表达泳道2，菌体经超声裂解后取上清和沉淀进行SDSPAGE分析，显示目的蛋白主要以包涵体形式表达泳道4。
17、。00452、目的蛋白的纯化及复性说明书CN104043111A4/5页60046纯化以适当体积的复性液2M尿素、04MTRISBASE、1MM2巯基乙醇、05MM氧化型谷胱甘肽、05MM还原型谷胱甘肽、10甘油、10丙酮，PH80充分洗涤包涵体两次。加入3ML变性液8M尿素、01MNAH2PO4、001MTRISCL，PH80，于4下溶解过夜。0047复性将溶解物逐滴加入到27ML冰浴的复性液中，边加边搅拌，4下静置过夜。次日5000RPM4下离心30MIN，将上清转至透析袋中，在含3M尿素的PBS溶液中，于4下静置12H，而后更换两次PBS溶液含1M和0M尿素，同样于4下静置12H。004。
18、8复性后的电泳结果如图2的泳道5所示，所得的包涵体经洗涤、溶解后，获得了纯度较高的目的蛋白RTIFN2。0049目的蛋白采用稀释复性法进行复性，过程中仅产生少量沉淀，最终利用紫外分光光度计法测得复性后目的蛋白浓度约为0207MG/ML。0050将同样利用PET32A表达的其他无关蛋白的质粒导入大肠杆菌DH5中，得到对照重组菌，采用上述表达、纯化目的蛋白，得到40KD的对照蛋白。00513、目的蛋白RTIFN2在抑制IHNV活性中的中应用00521抗病毒实验0053于96孔细胞细胞培养板中培养CHSE214细胞ATCCCRL1681至单层，将4倍倍比稀释纯化的RTIFN2蛋白以100L的量加入到。
19、96孔板中，于15的CO2培养箱中培养12H，弃去培养液后加入100TCID50的IHNV记载在如下文献中徐黎明,刘洪柏与卢彤岩,传染性造血器官坏死病毒SN株基质蛋白基因克隆及生物信息学分析水产学报,201309第14091415页徐黎明，刘红柏，徐进，卢彤岩，传染性造血器官坏死病病毒高效RTPCR检测方法的建立水生生物学报第1页；公众可从中国水产科学研究院黑龙江水产研究所获得，同时设立不加干扰素的对照组、加入对照蛋白组、不加病毒的对照组，继续培养并逐日观察和记录细胞病变情况，最后以PBS洗涤细胞后每孔加入01结晶紫染色10MIN，辅助判断细胞死亡情况。参照病毒TCID50测定方法将病变抑制孔。
20、代替毒价测定中的病变孔，按REEDMEUNCH法计算RTIFN2在CHSE214细胞上抗IHNV的活性。0054抗病毒实验结果如图3所示，A不加干扰素的对照组；B加入对照蛋白组；C干扰素处理组，D不加病毒对照组。显示对照蛋白组细胞生长良好，阳性对照组细胞A组和B组完全病变，而目的蛋白RTIFN2处理的CHSE214细胞无病变发生；不加病毒的对照组IHNV抑制率为100，不加干扰素的对照组IHNV抑制率为0，对照蛋白组IHNV抑制率为0。经计算目的蛋白RTIFN2在CHSE214细胞上抑制IHNV活性约为663106U/MG。0055采用不同浓度的RTIFN2进行上述抗病毒实验，结果如表1所示0。
21、056表1为不同浓度的RTIFN2的IHNV抑制率结果0057RTIFN2G/MLIHNV抑制率10020701005189375说明书CN104043111A5/5页712987503281250081700020625000515357142857000134687500582蚀斑减少实验0059于6孔细胞培养板中培养CHSE214细胞至单层，每孔加入含120倍稀释的重组RTIFN2蛋白的细胞培养液，于15的CO2培养箱中培养12H，弃去培养液后分别加入103、104、105倍稀释的IHNV，继续培养1H，同时设立不加干扰素的对照组。弃上清每孔加入11体积混合的2MEM培养液和15低熔点琼。
22、脂糖，于15的CO2培养箱中培养，逐日观察，待显微镜下可观察到明显蚀斑出现后，加入终浓度为005的中性红染色液，避光培养1H，观察蚀斑形成情况。0060蚀斑减少实验结果如图4所示，显示103倍稀释的IHNV接种CHSE214细胞时，对照组蚀斑过多无法准确计数，而重组RTIFN2处理组蚀斑显著减少具体为约40个,104倍稀释的IHNV接种CHSE214细胞时RTIFN2处理后蚀斑能够减少至1/10具体为8个，而105倍稀释的IHNV接种CHSE214细胞时RTIFN2处理无蚀斑产生具体为0个。0061上述结果证实所制备的目的蛋白具有较好的抗IHNV活性。说明书CN104043111A1/3页80001序列表CN104043111A2/3页900020003序列表CN104043111A3/3页10序列表CN104043111A101/1页11图1图2图3图4说明书附图CN104043111A11。