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1、10申请公布号CN104046641A43申请公布日20140917CN104046641A21申请号201410292658422申请日20140625C12N15/56200601C12N15/113201001C12N15/10200601A01N61/00200601A01P7/0420060171申请人山西大学地址030006山西省太原市小店区坞城路92号72发明人李大琪张建琴马恩波张建珍孙毅74专利代理机构山西五维专利事务所有限公司14105代理人张福增54发明名称昆虫型几丁质酶基因特异性DSRNA的应用57摘要本发明提供一种昆虫型几丁质酶基因CHT10特异性DSRNA的应用，它可。
2、沉默型几丁质酶基因使飞蝗死亡，而对其他昆虫并无影响。对飞蝗的型几丁质酶基因进行克隆、测序后，分析其功能域；然后选择独有几丁质结合域，设计序列为SEQIDNO1的该基因片段，用于特异性双链RNADSRNA的合成。该基因DSRNA注入飞蝗的体腔后，此种昆虫蜕皮时无法顺利蜕出进入下一龄期，导致死亡，死亡率达到100。而其它昆虫注射该DSRNA并不导致死亡。本发明为基于RNA干扰的专一害虫防治提供靶标，可用于特定害虫飞蝗的防治。51INTCL权利要求书1页说明书3页序列表2页附图2页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书3页序列表2页附图2页10申请公布号CN104046。
3、641ACN104046641A1/1页21一种昆虫型几丁质酶基因，其核苷酸序列是SEQIDNO1。2如权利要求1所述的昆虫型几丁质酶基因的DSRNA的合成方法，用上游引物SEQIDNO2，下游引物SEQIDNO3，合成PCR产物，经SVGELANDPCRCLEANUPSYSTEMPROMEGA试剂盒纯化后按照T7RIBOMAXTMEXPRESSRNAISYSTEMPROMEGA试剂盒说明体外转录合成的DSRNA。3如权利要求2所述方法合成的昆虫型几丁质酶基因的DSRNA。4如权利要求3所述的DSRNA在致死飞蝗中的应用。权利要求书CN104046641A1/3页3昆虫型几丁质酶基因特异性DS。
4、RNA的应用技术领域0001本发明涉及生物技术领域。具体涉及昆虫型几丁质酶基因特异性DSRNA的应用。背景技术0002对于农业虫害，我国长期施用有机氯、有机磷等化学杀虫剂加以控制，这引起一系列问题害虫出现抗药性,需加大农药剂量,生产成本上升；农药残留导致环境污染严重，危害人类身体健康等。随着社会的发展，迫切需要新型的害虫防治方法。本发明提供一种基于RNA干扰的害虫防治应用。0003RNA干扰RNAI是一种通常由双链RNA分子引起的特异性转录后基因沉默现象，是21世纪以来十大热门科技之一，并于2006年获得诺贝尔奖。这一发现促进了生物学上许多新方法、新技术的出现，并应用于人们的生活当中，例如人类。
5、的疾病治疗、基因功能研究和作物害虫防治等。2008年，PRICE和GATEHOUSE总结了众多实验结果后，提出了基于RNAI的害虫防治策略。基于RNA干扰技术的害虫防治具有如下优势对害虫独有基因进行干扰，抗虫具有专一性，对高等动物和和人类是安全的；对环境无毒无害。0004昆虫的几丁质酶基因家族包含多个基因，不同的基因负责不同的生物学功能。型几丁质酶基因即为昆虫几丁质酶基因10CHT10，它主要负责蜕皮时外骨骼几丁质的降解，昆虫缺失此基因后表现为蜕皮困难而致死。由于高等动物中并没有同类型的基因，故对该基因进行RNA干扰是安全的。该基因在不同昆虫中分化较大，可以设计特异性的DSRNA进行专一的害虫。
6、防治，而不影响其他昆虫。发明内容0005本发明的目的提供一种昆虫型几丁质酶基因特异性DSRNA在致死害虫中的应用。0006本发明提供的昆虫型几丁质酶基因特异性DSRNA的应用，其核苷酸序列是SEQIDNO1。该序列是通过对飞蝗型几丁质酶基因LMCHT10氨基酸序列分析后，选择飞蝗所特有的几丁质结合域CHITINBINDINGDOMAIN，CBD，设计上游引物SEQIDNO2和下游引物SEQIDNO3，通过PCR扩增获得SEQIDNO1，其含有T7启动子，核苷酸序列长度为332BP。进一步利用试剂盒合成DSRNADSCBD。0007SEQIDNO1合成的DSRNADSCBD在致死害虫中的应用注射。
7、上述DSRNA到昆虫体腔，结果表明SEQIDNO1合成的DSRNA可以特异性地沉默飞蝗型几丁质酶基因的MRNA表达，并导致飞蝗蜕皮困难而死亡。储粮害虫赤拟谷盗注射该DSRNA后，此昆虫的型几丁质酶基因TCCHT10并没有受到干扰，幼虫也没有出现蜕皮困难的情况，并可以发育至成虫。由此可见，该DSRNA只针对性的干扰飞蝗型几丁质酶基因，而对其他昆虫同源基因并没有影响。说明书CN104046641A2/3页4附图说明0008图1飞蝗型几丁质酶基因功能域分布示意图。黄色部分为几丁质酶催化域，绿色部分为几丁质结合域。第一个几丁质结合域为飞蝗所特有，为红圈标识。0009图2飞蝗注射SEQIDNO1合成的D。
8、SRNA，24H后飞蝗型几丁质酶基因的MRNA表达，ACTIN做为内参基因。P001。0010图3五龄飞蝗注射SEQIDNO1合成的DSRNA后出现蜕皮困难而死亡的表型。左侧为注射DSGFP的对照，右侧为注射SEQIDNO1合成的DSRNA。0011图4赤拟谷盗幼虫注射SEQIDNO1合成的DSRNA，24H后赤拟谷盗型几丁质酶基因的MRNA表达，ACTIN做为内参基因。0012图5赤拟谷盗幼虫注射SEQIDNO1合成的DSRNA后发育正常。左侧为注射DSGFP的对照，右侧为注射SEQIDNO1合成的DSRNA。具体实施方式0013实施例1飞蝗型几丁质酶基因特异性DSRNA的获得00141、飞。
9、蝗型几丁质酶基因氨基酸序列分析0015基于飞蝗的转录组数据库，采用生物信息学方法对飞蝗型几丁质酶基因进行搜索，经过序列分析及比对后，获得飞蝗型几丁质酶基因LMCHT10序列，该序列编码2964个氨基酸。在SMART网站上对其进行功能域分析HTTP/SMARTEMBLHEIDELBERGDE/，得到其独有的几丁质结合域1图1。00162、飞蝗型几丁质酶基因特异性DSRNA合成00171飞蝗型几丁质酶基因特异性DSRNA引物的设计0018基于飞蝗型几丁质酶基因独有的几丁质结合域1的序列，采用PRIMERPREMIER50软件设计。设计DSRNA引物，其序列分别为SEQIDNO2和SEQIDNO3。。
10、所有引物均由上海英潍捷基生物有限公司合成。00192飞蝗型几丁质酶基因特异性DSRNA的合成0020上述DSRNA引物合成序列为SEQIDNO1的PCR产物，经SVGELANDPCRCLEANUPSYSTEMPROMEGA试剂盒纯化后按照T7RIBOMAXTMEXPRESSRNAISYSTEMPROMEGA试剂盒说明体外转录合成DSRNADSCBD。DSRNA浓度采用酶标仪SPECTRAMAX190测定，并浓缩至终浓度为3G/L。0021实施例2飞蝗型几丁质酶基因特异性DSRNA致死五龄飞蝗00221、飞蝗型几丁质酶基因特异性DSRNA注射0023将2L6GSEQIDNO1的DSRNADSCB。
11、D用25L规格微量注射器注射到五龄飞蝗第2日龄若虫二、三腹节之间，共注射30只，雌雄各半。注射相同体积浓度的DSGFP至对照组体内。将注射后飞蝗置于30恒温生化培养箱中饲养。00242、飞蝗型几丁质酶基因沉默检测0025对于五龄DSRNA注射后24H检测其沉默效率，整虫虫体作为RNA提取对象，每组设置3个生物学重复。提取各样品的总RNA并反转录成第一链CDNA，REALTIMEPCR检测目的基因LMCHT10和管家基因ACTIN的相对表达量，以计算目的基因的沉默效率图2。说明书CN104046641A3/3页500263、注入DSRNA后五龄飞蝗表型的观察0027五龄若虫注射DSRNA后，对照。
12、组虫体6天后开始蜕皮并在注射后第7天全部成功发育至成虫，蜕皮时间约为15MIN，蜕皮发育为成虫后虫体状态良好。注射飞蝗型几丁质酶基因特异性DSRNADSCBD的处理组若虫共30头，与对照组相比未出现蜕皮延迟的现象，但蜕皮一直持续直至死亡。30头若虫均未能够蜕至成虫，死亡率达到100。30头死亡若虫出现表型图3为蝗蝻蜕皮时翅芽张开、背部弓起，旧表皮未开裂，腹部底端出现红肿腐烂，昆虫死亡。0028实施例3飞蝗型几丁质酶基因特异性DSRNA对赤拟谷盗幼虫发育无影响。00291、飞蝗型几丁质酶基因特异性DSRNA注射赤拟谷盗0030将400NGSEQIDNO1的DSRNADSCBD用显微注射仪注射到赤。
13、拟谷盗幼虫体内，共注射28头，雌雄各半。注射相同质量的DSGFP至对照组体内。将注射后赤拟谷盗幼虫置于30恒温生化培养箱中饲养。00312、赤拟谷盗型几丁质酶基因沉默检测0032对于赤拟谷盗幼虫DSRNA注射后24H检测其沉默效率，整虫虫体作为RNA提取对象，每组设置3个生物学重复。提取各样品的总RNA并反转录成第一链CDNA，半定量PCR检测目的基因TCCHT10和管家基因ACTIN的表达水平，以观察其是否沉默图4。00333、注入DSRNA后赤拟谷盗幼虫的观察0034注射不同DSRNA后，两组赤拟谷盗幼虫在体长、重量及活跃度都无明显差异，也均可顺利化蛹和羽化为成虫，没有出现蜕皮困难导致死亡的现象。说明书CN104046641A1/2页600010002序列表CN104046641A2/2页7序列表CN104046641A1/2页8图1图2图3图4说明书附图CN104046641A2/2页9图5说明书附图CN104046641A。