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1、10申请公布号CN104042623A43申请公布日20140917CN104042623A21申请号201410256219822申请日20140610A61K31/715200601C08B37/00200601A61P35/0020060171申请人山东大学地址250100山东省济南市历城区山大南路27号72发明人陈靠山侯东于志丹禹文茜陈国创石磊周南74专利代理机构济南金迪知识产权代理有限公司37219代理人朱家富54发明名称一种黑根霉胞外多糖在制备治疗或预防消化道肿瘤药物中的应用57摘要本发明涉及一种黑根霉胞外多糖在制备治疗或预防消化道肿瘤药物中的应用，所述的黑根霉胞外多糖的制备方法如。
2、下1取菌种保藏号为CGMCCNO8436的黑根霉，经活化和发酵培养，制得发酵液；2将发酵液经分离纯化，制得粗提液；3将粗提液经树脂柱脱色，SEVEAGE试剂振荡脱蛋白，SEPHADEXG50葡聚糖凝胶柱层析纯化，制得黑根霉胞外多糖。本发明利用黑根霉胞外多糖通过建立动物肿瘤模型，对黑根霉胞外多糖的实体抗消化道系统肿瘤活性进行探究，动物肿瘤实验抗肿瘤结果表明，黑根霉胞外多糖可以明显抑制胃癌肿瘤小鼠、结肠癌肿瘤小鼠的肿瘤块的生长，并且和现有化疗药物环磷酰胺联合用药抗肿瘤疗效明显高于环磷酰胺单独用药的抗肿瘤效果。51INTCL权利要求书1页说明书9页附图5页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利。
3、申请权利要求书1页说明书9页附图5页10申请公布号CN104042623ACN104042623A1/1页21一种黑根霉胞外多糖在制备治疗或预防消化道肿瘤药物中的应用，其特征在于，所述的黑根霉胞外多糖的制备方法如下1取菌种保藏号为CGMCCNO8436的黑根霉接种于PDA培养基中，在2530的条件下活化培养35D，制得活化后的菌丝；将活化后的菌丝转接于液体培养基中，在2530、100200RPM/MIN的条件下培养510D，制得发酵液；2将步骤1制得的发酵液经固液分离，收集分离后的液体，经浓缩后，在室温条件下，向浓缩液中加入34倍体积的体积百分比为95的酒精，静置后，分离沉淀，将沉淀溶于蒸馏水。
4、中，再次分离沉淀，取上清液，制得粗提液；3将步骤2制得的粗提液经D301R型树脂柱脱色，收集洗脱液，然后加入洗脱液体积1/4的SEVEAGE试剂振荡脱蛋白，取上清液，除去有机溶剂，制得粗糖溶液，然后将粗糖溶液经过SEPHADEXG50葡聚糖凝胶柱层析纯化，经蒸馏水洗脱，流度为5ML/MIN，检测合并收集高峰区的多糖洗脱液，将洗脱液进行浓缩、冷冻干燥，制得黑根霉胞外多糖。2如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述步骤2中，浓缩为在5560的条件下经旋转蒸发进行浓缩。3如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述步骤2中，浓缩后浓缩液体积为浓缩前液体体积的三分之一。4如权利要求1所述的应用，其特征在于。
5、，所述步骤2中，分离沉淀为在12000RPM/MIN的条件下离心15MIN。5如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述步骤3中，SEVEAGE试剂为氯仿与正丁醇按体积比41的比例混合制得。6如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述步骤3中，检测为采用苯酚硫酸法检测糖含量。7如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的肿瘤药物包括药效成分为黑根霉胞外多糖与环磷酰胺以及药学上可接受的辅料。8如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的黑根霉胞外多糖与环磷酰胺的质量比为1354。9如权利要求8所述的应用，其特征在于，黑根霉胞外多糖与环磷酰胺的质量比为1375。10如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述。
6、的消化道肿瘤为胃癌与结肠癌。权利要求书CN104042623A1/9页3一种黑根霉胞外多糖在制备治疗或预防消化道肿瘤药物中的应用技术领域0001本发明涉及一种黑根霉胞外多糖在制备治疗或预防消化道肿瘤药物中的应用，属于医药及保健食品技术领域。背景技术0002随着社会的发展和经济的快速提高，人民的生活节奏加快、方式多样化，以及大气环境污染的日趋加重、人口老龄化加剧等因素，导致亚健康人群剧增，我国的恶性肿瘤的发病率及死亡率不断增长，如今癌症死亡率已经上升到首位，且成为人民日益关注的社会问题。消化道肿瘤是世界范围内的常见恶性肿瘤，主要包括胃癌、食管癌、大肠癌以及肝癌。随着我国人民生活水平的提高及饮食结。
7、构的改善及不良生活习惯的日积月累，我国已经成为消化道肿瘤高发地区，其发病率和死亡率抑制位于恶性肿瘤前列。据统计，平均每小时就有120个中国人死于消化道癌症，其中肝癌的发病率已经是世界之首，结直肠癌以每年39的幅度不断攀升，胃癌患者人数占世界的50，消化道肿瘤严重威胁着中国人的生命和健康。肿瘤的治疗方法主要包括药物治疗，放射治疗和手术治疗。各种治疗均能够杀死一定的肿瘤细胞，但是都存在各自的弊端，不能彻底治愈肿瘤。化疗是消化道治疗常用的方法，但化疗药物对靶点的选择性差，在杀伤肿瘤细胞时对机体的正常免疫细胞也具有杀伤作用，同时化疗药物可引起恶心和呕吐，引起营养不良，使患者免疫力严重下降。化疗药物产生。
8、的副作用和其引发的过敏反应限制了其临床应用，并且上述化疗治疗方法费用昂贵、预后较差。所以寻求一种针对消化道系统癌症疗效显著、副作用小、费用低廉的抗肿瘤药物和治疗方法具有重要意义。0003真菌多糖抗肿瘤药物属于中医药抗肿瘤药物的重要组成部分，我国真菌资源丰富，早在神农本草经中就对赤芝草、茯苓等真菌的扶正固本效用做了介绍。真菌多糖是真菌发挥功效的主要成分，分离于真菌子实体、菌丝体及发酵液中，由10个以上单糖分子主要以1,3和1,6糖苷键连接而成的天然高分子化合物。很多研究表明多种真菌多糖具有抗肿瘤、免疫调节、抗病毒、抗氧化、抗辐射等多种生物活性且毒性很低，现已成为开发癌症治疗药物的重要来源之一。我。
9、国对真菌多糖的研究近年取得很大的进展。有实验研究表明，香菇多糖已应用于治疗胃肠道肿瘤，治疗过程中机体的免疫球蛋白含量提高，相关细胞因子、CD3、CD4、CD4/CD8比值明显升高，血小板和白细胞含量也有所提高，并且香菇多糖、云芝多糖、灰树花多糖等作为抗肿瘤辅助药物已进入临床应用。0004除了传统的大型真菌来源的真菌多糖，许多研究表明霉菌来源的多糖也同样具有多种生物学活性，因其成本低廉、培养易操作等优势，开始受到关注。0005黑根霉RNIGRICANSEHRENB是一种丝状真菌，具有很强的生长势，液体发酵培养过程中分泌大量的胞外多糖。黑根霉胞外粗多糖包含多种组分，采用不同的分离纯化方法可以获得不。
10、同的均一多糖。前期研究表明黑根霉胞外多糖具有显著体外抗人胃癌细胞SGC7901、人白血病细胞K562、小鼠腹水瘤细胞S180体外增殖的活性，并且促进脾淋巴细说明书CN104042623A2/9页4胞体外增殖和IL2的分泌。目前，黑根霉胞外多糖的功能性研究已成为黑霉菌研究的热点，但黑根霉胞外多糖对抗实体瘤，特别是抗消化道系统肿瘤活性的研究还未见报道。发明内容0006本发明针对现有抗消化道类肿瘤药物不足，提供一种黑根霉胞外多糖在制备治疗或预防消化道肿瘤药物中的应用。0007一种黑根霉胞外多糖在制备治疗或预防消化道肿瘤药物中的应用，其特征在于，所述的黑根霉胞外多糖的制备方法如下00081取菌种保藏号。
11、为CGMCCNO8436的黑根霉接种于PDA培养基中，在2530的条件下活化培养35D，制得活化后的菌丝；将活化后的菌丝转接于液体培养基中，在2530、100200RPM/MIN的条件下培养510D，制得发酵液；00092将步骤1制得的发酵液经固液分离，收集分离后的液体，经浓缩后，在室温条件下，向浓缩液中加入34倍体积的体积百分比为95的酒精，静置后，分离沉淀，将沉淀溶于蒸馏水中，再次分离沉淀，取上清液，制得粗提液；00103将步骤2制得的粗提液经D301R型树脂柱脱色，收集洗脱液，然后加入洗脱液体积1/4的SEVEAGE试剂振荡脱蛋白，取上清液，除去有机溶剂，制得粗糖溶液，然后将粗糖溶液经过。
12、SEPHADEXG50葡聚糖凝胶柱层析纯化，经蒸馏水洗脱，流度为5ML/MIN，检测合并收集高峰区的多糖洗脱液，将洗脱液进行浓缩、冷冻干燥，制得黑根霉胞外多糖。黑根霉胞外多糖为淡黄色粉末状固体。0011所述步骤1中，PDA培养基每升组分如下0012马铃薯200G，蔗糖20G，琼脂15G，自来水定容至1L。0013液体培养基每升组分如下0014液体PDB发酵培养基，每升组分如下马铃薯200G，蔗糖20G，自来水定容至1L。0015根据本发明优选的，所述步骤2中，浓缩为在5560的条件下经旋转蒸发进行浓缩。0016根据本发明优选的，所述步骤2中，浓缩后浓缩液体积为浓缩前液体体积的三分之一。0017。
13、根据本发明优选的，所述步骤2中，分离沉淀为在12000RPM/MIN的条件下离心15MIN。0018根据本发明优选的，所述步骤3中，SEVEAGE试剂为氯仿与正丁醇按体积比41的比例混合制得。0019根据本发明优选的，所述步骤3中，检测为采用苯酚硫酸法检测糖含量。0020所述的黑根霉胞外多糖由两种多糖组分EPS1和EPS2构成，又进一步从EPS1中分离纯化出了EPS11。EPS11和EPS2为组分均一的多糖，分子量分别为9682DA和1979105DA。EPS11主要由葡萄糖、半乳糖、甘露糖以及果糖组成，其摩尔比例为589364321。EPS2主要由鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖以及少量未知化合物组。
14、成，半乳糖、鼠李糖、阿拉伯糖、摩尔比例为178231。0021根据本发明优选的，所述的肿瘤药物包括药效成分为黑根霉胞外多糖与环磷酰胺以及药学上可接受的辅料。说明书CN104042623A3/9页50022根据本发明进一步优选的，所述的黑根霉胞外多糖与环磷酰胺的质量比为1354；最优的，黑根霉胞外多糖与环磷酰胺的质量比为1375。0023根据本发明进一步优选的，所述的消化道肿瘤为胃癌与结肠癌。0024有益效果0025本发明利用黑根霉胞外多糖EPS通过建立动物肿瘤模型，如裸鼠胃癌模型、裸鼠结肠癌模型，S180昆明鼠肉瘤模型等，对黑根霉胞外多糖的实体抗消化道系统肿瘤活性进行探究，动物肿瘤实验抗肿瘤结。
15、果表明，黑根霉胞外多糖可以明显抑制胃癌肿瘤小鼠、结肠癌肿瘤小鼠的肿瘤块的生长，并且和现有化疗药物环磷酰胺联合用药抗肿瘤疗效明显高于环磷酰胺单独用药的抗肿瘤效果。结果表明EPS对消化道系统肿瘤有显著治疗作用，同时提高荷瘤小鼠的免疫功能，与多糖剂量呈正相关性。同时，在S180腹水瘤小鼠的寿命延长实验过程中，服用EPS的腹水小鼠生存质量提高，寿命明显延长。附图说明0026图1EPS11的高效凝胶渗透色谱图0027图2EPS2的高效凝胶渗透色谱图0028图3EPS11标准单糖液相色谱图0029图4EPS11单糖组成液相色谱图0030图5EPS2标准单糖液相色谱图0031图6EPS2单糖组成液相色谱图0。
16、032图7黑根霉胞外多糖预防给药途径对S180荷瘤小鼠实体瘤的抑制作用0033图8黑根霉胞外多糖治疗给药途径对S180荷瘤小鼠实体瘤的抑制作用0034图9预防末次给药后肿瘤模型组A与多糖高剂量组B小鼠对比；0035其中表示T检验后，与对照组相比呈显著性差异P0050036表示T检验后，与对照组相比呈极显著性差异P001具体实施方式0037下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步阐述，但本发明所保护范围不限于此。0038生物材料来源0039实施例中所述的黑根霉来源于中国普通微生物菌种保藏管理中心，菌种保藏号CGMCCNO8436。0040实施例1黑根霉胞外多糖的制备00411取黑根霉接种于PDA。
17、培养基中，在28的条件下活化培养3D，制得活化后的菌丝；将活化后的菌丝转接于液体培养基中，在28、120RPM/MIN的条件下培养7D，制得发酵液；0042PDA培养基每升组分如下0043马铃薯200G，蔗糖20G，琼脂15G，自来水1000ML，PH自然。0044液体培养基每升组分如下0045液体PDB发酵培养基，每升组分如下马铃薯200G，蔗糖20G，自来水1000ML，PH自说明书CN104042623A4/9页6然。00462用四层纱布过滤发酵液，除去菌丝和孢子，收集过滤后的发酵液，在4000RPM/MIN条件下离心15MIN，收集上清，将收集到的上清置于旋转蒸发仪中浓缩，60浓缩至原。
18、体积的三分之一，冷却至室温，制得浓缩液，向浓缩液中加入其3倍体积的体积百分比为95的酒精静置过夜，在12000RPM/MIN的条件下离心15MIN，收集沉淀，将收集的沉淀溶于蒸馏水，相同条件下再次离心取上清，并过D301R型树脂柱脱色，收集洗脱液，然后加入洗脱液体积1/4的SEVEAGE试剂氯仿正丁醇41，V/V振荡脱蛋白，将上清蒸馏除去有机溶剂，制得粗糖溶液，然后经过SEPHADEXG50葡聚糖凝胶柱层析进行进一步纯化，用蒸馏水进行洗脱，自动部分收集器收集，流度为5ML/MIN，采用苯酚硫酸法检测糖含量，合并收集高峰区的多糖洗脱液，将洗脱液进行浓缩，然后冷冻干燥，制得黑根霉胞外粗多糖，其为淡。
19、黄色粉末状固体。0047高效凝胶色谱HPGPC分析与测定，制得的黑根霉胞外粗多糖可分为两种多糖组分EPS1和EPS2，进一步分离纯化出两种组分均一的多糖组分，EPS11和EPS2。经过高效凝胶色谱HPGPC分析与测定，它们的分子量分别为9682DA和1979105DA见图1和图2。采用高效液相色谱法其单糖组成进行了分析，EPS11主要由葡萄糖、半乳糖、甘露糖以及果糖组成，其摩尔比例为589364321见图3和图4；EPS2主要由鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖以及少量未知化合物组成，半乳糖、鼠李糖、阿拉伯糖、摩尔比例为178231见图5和图6。0048实施例2黑根霉胞外多糖联合环磷酰胺对胃癌裸鼠移植瘤。
20、生长抑制作用0049通过对裸鼠接种胃癌细胞株，建立人胃癌裸鼠移植瘤模型，采用灌胃方法，对胃癌裸鼠进行治疗，观察黑根霉胞外多糖联合化疗药物对胃癌荷瘤小鼠的作用。0050实验方法0051收集对数期的胃癌MGC803细胞，PBS稀释至5107个/ML。无菌条件下，裸鼠左腋下接种02ML细胞悬浮液，观察35D，等腋下出现米粒大小较硬的结节作为建模成功的标准。0052待肿瘤快生长至直径为5MM时，随机4分组，每组6只，开始给药治疗实验。实验组分别为生理盐水对照组，黑根霉组75MG/KG，实施例1制得的黑根霉胞外粗多糖，环磷酰胺组20MG/KG，CY，联合给药组75MG/KGEPS20MG/KGCY。每天。
21、灌胃给药一次，连续给药10D。治疗期间每天观察动物的精神、活动、饮食、皮毛等征象。最后一次给药后，禁食不禁水24H后，结束称重并处死动物。剥取荷瘤小鼠的肿瘤组织并称重，计算抑瘤率。0053实验结果表明0054肿瘤模型建立开始，小鼠皮毛光滑，进食进水正常，反应灵活，组间差异不明显。0055随着肿瘤组织的增大，和给药治疗，组间出现不同程度的差异；对照组小鼠摄食量明显下降，精神萎靡加重，活动迟缓甚至不动。单独给药黑根霉组出现不同程度的皮毛失去光泽，行动缓慢。环磷酰胺组小鼠有些消瘦，但活动和摄食量较对照组和单独给药组比较灵活。联合给药组小鼠，体质较好，瘤体积也较小，活动较灵活。0056由表1可知，环磷。
22、酰胺组、联合给药组小鼠的瘤重与肿瘤对照组的差异显著P005，黑根霉组、环磷酰胺组、联合给药组对胃癌MGC803细胞小鼠实体瘤的抑瘤率分别为2811、3309和4412。说明书CN104042623A5/9页70057表1EPS联合CY治疗对裸鼠胃癌模型的抑瘤作用005800590060与模型对照组相比，P005,P0010061实施例3黑根霉胞外多糖对人直肠癌裸鼠移植瘤生长抑制作用0062通过建立人结肠癌SE480细胞移植瘤小鼠模型，研究EPS对结肠癌实体瘤的抑制作用。0063实验方法0064取人结肠癌细胞SE480移植瘤，磨碎制成细胞悬液，接种于24只裸鼠左腋下。接种的小鼠随机分为4组，每组。
23、6只，分别为模型组、多糖低剂量组25MG/KG，实施例1制得的黑根霉胞外粗多糖、多糖中剂量组50MG/KG，实施例1制得的黑根霉胞外粗多糖、多糖高剂量组75MG/KG，实施例1制得的黑根霉胞外粗多糖，模型组每天灌胃相同剂量的生理盐水，连续给药7天。最后一次给药后，禁食不禁水12H，处死小鼠。测量小鼠瘤重及体重，并观察肿瘤生长特征及病理学特征。0065根据WHO实体瘤的疗效标准分为完全缓解CR,部分缓解PR,无变化NC,进展PD。治疗10天后对各指标进行测量。根据肿瘤大小判断EPS的近期疗效，结果见表2。0066实验结果表明，EPS可以明显的抑制结肠癌肿瘤的生长。0067表2EPS对荷瘤小鼠的近。
24、期治疗00680069实施例4黑根霉胞外多糖及联合环磷酰胺对结肠癌治疗作用0070本实验室通过建立裸鼠结肠癌模型，黑根霉胞外多糖EPS治疗及联合环磷酰胺CY治疗结肠癌小鼠，研究EPS对结肠癌的治疗作用以及EPS对化疗药物的辅助作用。0071实验方法0072培养小鼠结肠癌细胞株C26，取对数期细胞，PBS稀释至5106个/ML。无菌条件说明书CN104042623A6/9页8下，02ML接种于小鼠皮下形成荷瘤小鼠模型。007324H后荷瘤小鼠随机分为4组，分别为模型对照组灌胃生理盐水05ML，黑根霉剂量组75MG/KG，实施例1制得的黑根霉胞外粗多糖，联合给药组7520MG/KGEPS20MG/。
25、KGCY，环磷酰胺组20MG/KGCY。每天灌胃一次，连续灌胃10D。治疗期间观察小鼠的精神、行动、毛色、进食量等状况，每天测量小鼠体重变化。末次给药后禁食24H，最后一次称重后处死小鼠，剥去肿瘤组织，称重计算抑瘤率。0074实验结果表明肿瘤模型建立后，随着给药治疗的进行，组间出现不同程度的差异。对照组小鼠活动迟缓甚至不动，每天进食量明显下降，精神低糜。黑根霉剂量组出现不同程度的皮毛失去光泽，行动缓慢。环磷酰胺组小鼠有些消瘦，但活动和摄食量较对照组和单独给药组比较灵活。联合给药组小鼠，体质较好，瘤体积也较小，活动较灵活。0075由表3可知，环磷酰胺组、联合给药组小鼠的瘤重与肿瘤对照组的差异显著。
26、P005，环磷酰胺组、黑根霉剂量组、联合给药组对结肠癌小鼠实体瘤的抑瘤率分别为3272、2398和3958。0076由小鼠体重记录表4可知，小鼠接种移植瘤后小鼠体重均增加，但黑根霉剂量组体重增加量高于模型组，联合化疗组增加量明显高于模型组环磷酰胺组及黑根霉剂量组。0077因此，EPS具有抑制结肠癌肿瘤生长的作用，并且可辅助化疗药物更有效的抑制肿瘤的生长。0078表3EPS及联合CY化疗对结肠癌小鼠的治疗00790080与模型对照组相比，P005，与环磷酰胺对照组相比，P0010081表4EPS及联合CY化疗对结肠癌小鼠体重的影响0082说明书CN104042623A7/9页90083实施例5黑。
27、根霉胞外多糖预防及治疗给药对S180荷瘤小鼠瘤重的影响0084预防治疗实验采用先灌胃给药再接种瘤株继续给药的途径进行试验，治疗途径采用先接肿瘤，第二天分组给药进行试验。旨在检测黑根霉胞外多糖对肿瘤预防和肿瘤治疗的的作用。0085实验方法0086移植瘤模型建立取荷瘤小鼠腹水01ML，用PBS稀释20倍，然后用台盼蓝染色，确保活体瘤细胞在95以上，并计算1ML瘤液中活细胞数，以计算需要稀释倍数。用PBS或生理盐水稀释成21076107/ML，75酒精消毒小鼠右腋皮下，每只小鼠接种02ML。0087预防治疗途径0088动物分组及给药小鼠随机分为5组，每组7只，其中4组小鼠，分别灌胃无菌过滤后的低、中。
28、、中高、高剂量实施例1制得的黑根霉胞外粗多糖溶液10、25、50、75MG/KG/D，每次灌胃05ML，肿瘤对照组则灌胃等体积的灭菌生理盐水，另外设一组健康给药组不接肿瘤，灌胃75MG/KG/D实施例1制得的黑根霉胞外粗多糖溶液，以及一组空白对照组不接肿瘤，灌胃灭菌生理盐水。连续给药7D后，多糖处理组以及模型对照组小鼠于右腋下接种瘤株，继续给药10D，常规饲养。0089直接给药途径移植瘤模型建立后，随机为5分组，每组7只。给药治疗方式同预防给药相同。0090观察试验给药期间每日对比观察各组动物的活动、进食、毛色等体征状况，及皮下肿瘤生长情况，并记录小鼠生存状况。0091小鼠末次给药后禁食不禁水。
29、12H，称重，脱颈椎处死，75酒精浸泡3MIN后，腹部朝上放置于解剖盘中，仔细剥离肿瘤组织、脾脏、胸腺后称重。并计算抑瘤率、脾脏指数和胸腺指数。0092抑瘤率对照组瘤重MG给药组瘤重MG/对照组瘤重MG100；0093预防治疗实验结果制得的黑根霉胞外多糖在预给药阶段至腋下接种肿瘤细胞3D内，外观并无明显变化，活动和饮食均表现正常；接种45D后，肿瘤对照组的小鼠可以触摸到腋下绿豆大小的肿块，多糖处理组的部分小鼠可触摸到皮下米粒大小的肿块形成；在接种6D后，肿瘤对照组小鼠的肿块明显增大，多糖处理组肿瘤生长较对照组缓慢，此时多糖高剂量组的部分小鼠可触及到肿块的形成。肿瘤对照组的小鼠从接种第4D开始饮。
30、食减少，皮毛无光泽，可见到明显竖毛现象，活动减少。多糖中、中高、高剂量组小鼠饮食均正说明书CN104042623A8/9页10常，毛色有光泽，竖毛现象观察不明显。0094从图7、图9可见具有显著的预防及抗肿瘤的作用，末次给药后多糖高剂量组小鼠皮下肿瘤体积明显小于其它肿瘤组图8。0095预防给药途径实验结果由表5可见多糖高剂量组小鼠的瘤重与肿瘤对照组的差异极显著P001；多糖中、中高剂量组小鼠与肿瘤对照组的差异显著P005；多糖高、中高、中、低剂量组对S180荷瘤小鼠实体瘤的抑瘤率分别为6438、3587、4438和3983；直接给药途径实验结果由表6见，多糖中、高剂量组小鼠的瘤重与肿瘤对照组的。
31、差异显著P005，多糖高、中、低剂量组对S180荷瘤小鼠实体瘤的抑瘤率分别为373、309和142。0096表5预防给药途径中EPS对S180荷瘤小鼠肿瘤生长的影响00970098与模型对照组相比，P005,P0010099表6直接治疗途径中EPS对S180荷瘤小鼠肿瘤生长的影响010001010102与模型对照组相比，P005,P0010103实施例6黑根霉胞外多糖对S180腹水瘤小鼠生存期延长实验0104通过腹腔注射法建立S180荷瘤小鼠腹水瘤动物模型，观察实施例1制得的黑根霉胞外粗多糖EPS在75MG/KG/D用药剂量及其联合环磷酰胺用药对S180荷瘤小鼠生存期的影响。0105实验方法0。
32、106腹腔注射法建立S180腹水瘤小鼠模型取小鼠腹腔传代S180后第8天的腹水，用无菌生理盐水稀释，至浓度为21076107/ML，每只小鼠腹腔接种02ML。将实验动物随机分为4组，每组7只，即模型对照组生理盐水，多糖处理组75MG/KG，实施例1制得说明书CN104042623A109/9页11的黑根霉胞外粗多糖，环磷酰胺组20MG/KG，环磷酰胺，联合用药组75MG/KGEPS20MG/KGCY，灌胃给药。接种第2天开始固定时间给药，每天一次，共10D。停药后观察至小鼠死亡。观察小鼠精神状态、活动、饮食、毛发等，并记录小鼠生存时间。0107制得的黑根霉胞外多糖体内给药，在接种第4天，各组小。
33、鼠开始明显出现腹水，荷瘤模型对照组小鼠腹水生成速度明显快于多糖处理组75MG/KG/D及联合用药组。实验过程中模型对照组动物活动少，反应迟缓，喜聚堆，饮食少。接种第7天后，各实验组小鼠不同程度的出现毛色欠光泽，蜷缩抱团，觅食减少等。多糖处理组，及联合用药组一般情况好于模型对照组与环磷酰胺组。0108结果见表7，按照计算公式，多糖给药组S180腹水瘤小鼠生存时间为16217天，生命延长率为4336，与模型对照组比较，具有统计学意义P005；EPS联合CY用药组同样延长S180腹水瘤小鼠生存时间，生命延长率为3628，与环磷酰胺组比较，具有统计学意义P001。0109表7EPS对S180荷瘤小鼠生存期的影响01100111与模型对照组相比，P005，与环磷酰胺对照组相比，P001。说明书CN104042623A111/5页12图1图2说明书附图CN104042623A122/5页13图3图4说明书附图CN104042623A133/5页14图5图6说明书附图CN104042623A144/5页15图7图8说明书附图CN104042623A155/5页16图9说明书附图CN104042623A16。