一种吡唑并1,5A嘧啶衍生物及其抗肿瘤用途.pdf

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1、10申请公布号CN104292233A43申请公布日20150121CN104292233A21申请号201410532741422申请日20141009C07D487/04200601A61P35/0020060171申请人武汉大学地址430072湖北省武汉市武昌区珞珈山武汉大学72发明人洪学传王洪波朱曦丁明敏吕光耀张剑桥闻萌瞿春容朱进妹胡先明74专利代理机构武汉科皓知识产权代理事务所特殊普通合伙42222代理人汪俊锋54发明名称一种吡唑并1,5A嘧啶衍生物及其抗肿瘤用途57摘要本发明涉及一种具有通式1的吡唑并1,5A嘧啶衍生物及其药学上可用盐。本发明还涉及式1化合物在制备抗肿瘤药物中的应用。

2、。51INTCL权利要求书1页说明书10页附图2页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书10页附图2页10申请公布号CN104292233ACN104292233A1/1页21一种吡唑并1,5A嘧啶衍生物及其药学上可接受的盐或前药，其特征在于，所述吡唑并1,5A嘧啶衍生物具有通式1所示的结构其中，R1为氢、烷基羰基、烷氧基羰基、烷基硫代羰基；R2为氢、烷基、卤代烷基；R3为氢、卤素、三氟甲基。2根据权利要求1所述的吡唑并1,5A嘧啶衍生物及其药学上可接受的盐，其特征在于所述的卤代烷基为一氯甲基或三氟乙基。3根据权利要求1所述的吡唑并1,5A嘧啶衍生物及其药学上可接。

3、受的盐，其特征在于所述的烷氧羰基为甲氧羰基、乙氧羰基或叔丁氧羰基。4根据权利要求1所述的吡唑并1,5A嘧啶衍生物及其药学上可接受的盐，其特征在于所述的烷基羰基为甲酰基、乙酰基、丙酰基或异丁酰基。5根据权利要求1所述的吡唑并1,5A嘧啶衍生物及其药学上可接受的盐，其特征在于所述的卤素为氟、氯或溴。6权利要求1所述的吡唑并1,5A嘧啶衍生物及其药学上可接受的盐在制备抗肿瘤药物上的应用。权利要求书CN104292233A1/10页3一种吡唑并1,5A嘧啶衍生物及其抗肿瘤用途技术领域0001本发明属于有机合成领域，涉及一种抗肿瘤药物吡唑并1,5A嘧啶衍生物及其用途。背景技术0002随着人类寿命的延长，。

4、癌症跃升为近年的主要死亡原因。2012中国肿瘤登记年报显示，中国每年新发癌症病例约350万，因癌症死亡的人数约250万。全国恶性肿瘤发病第一位的是肺癌，其次为胃癌、结直肠癌、肝癌和食管癌。癌症已成为我国人口死亡的首要原因0003关于癌症的治疗，科学家们展开了大量的研究工作。新的抗癌药品不断发现。目前已有20余种肿瘤的治愈率达到30以上。而药物作用机理的亚细胞水平及分子水平的研究，大大开拓了抗癌药物在应用方面的研究。细胞动力学、药物作用动力学及免疫学方面研究的快速发展，也使得药物的筛选、剂量的调整、给药途径的确定日趋完善。现已联合用药、大剂量间歇用药、辅助化疗以及配合中药的治疗，使恶性肿瘤治疗取。

5、得很好的疗效。当今，对恶性肿瘤治疗以手术、放射治疗、化学药物治疗、中医中药的治疗及免疫治疗等手段为主。对抗癌药物的选择、毒性作用及抗药性等方面起着影响其疗效，因为抗癌药物在杀伤肿瘤细胞的同时，也对正常组织的细胞有杀伤，尤其是增殖旺盛的骨髓造血细胞及胃肠道细胞，这样一来限制抗癌药的剂量，并且使患者免疫功能降低，甚至患者难以忍受胃肠反应，而被迫中断治疗，使治疗失败。抗癌药物能杀伤癌细胞，但由于其细胞毒性，所以要找到一种既能治疗癌症同时又不对人体造成伤害或者伤害较小的药物一直是科学家们奋斗的目标。最近，作为瞬时受体电位通道亚族组成之一的TRPC6蛋白与胞内钙浓度的改变、肿瘤的发生发展、肿瘤细胞周期改。

6、变的相关研究有了新的进展，有望成为肿瘤治疗新的靶点。0004瞬时受体电位TRANSIENTRECEPTORPOTENTIAL，TRP是普遍存在于细胞膜上的一种非选择性的阳离子通道蛋白家族，具有介导感觉传导、参与细胞信号转导及调节发育等重要作用，是目前离子通道领域研究的热点之一。TRP通道蛋白是一个庞大的家族，广泛表达于多种生物、组织及细胞中。仅就哺乳动物TRP通道而言，这个家族就包括7个相互关联的亚家族TRPC、TRPV、TRPM、TRPN、TRPA、TRPP和TRPML，其中每一个亚家族又包括众多家族成员。TRP离子通道以往的研究工作多局限于神经系统，近年研究发现，TRP通道不仅在机体中参与。

7、细胞信号转导、介导伤害性感受等方面发挥着重要的功能，而且在肿瘤的发生、发展中也起着重要的作用。该家族对细胞起着稳定和调控作用，其表达升高有利于恶性肿瘤的生长。0005TRPC即传统型TRP通道，它是第一个被研究分离出的TRP通道蛋白。TRPC共7个亚型，TRPC17，其中TRPC3和TRPC6在结构和功能上非常接近，氨基酸一致程度高达7080，在药理学性质和信号调节功能方面也比较相似，在TRPC亚家族中比较有代表性，也是目前国际研究中很受关注的2个亚型。而TRPC6被认为是选择性最强的通道蛋白。人TRPC6定位于染色体11Q212Q22,共132287个碱基基因库NC000011，含13个外显。

8、子。说明书CN104292233A2/10页4TRPC6的转录产物MRNA含4564个碱基，其中第1427位为5未翻译区，第4283223位为编码区，第32244564位为3未翻译区基因库NM004621。TRPC6可特异性的被磷脂酶CPLC激活，通过G蛋白偶联受体GPCR介导的信号传导通路使配体与膜受体结合，激活磷脂酶C生成1,4,5三磷酸肌醇，后者与受体结合促使内质网释放CA2TRPC6是一种非选择性的阳离子通，钙离子可以通过，在多组织中都有表达。它能直接被第二信使甘油二酯酶激活，通过特定的酪氨酸/丝氨酸磷酸化调节改变胞内钙流。细胞内游离CA2升高，激活一些蛋白磷酸酶，使底物蛋白磷酸化，将。

9、外界信号级联放大，进入核内，影响DNA复制，导致细胞恶变及肿瘤细胞的增殖分化。细胞内CA2直接参与调控肿瘤的生长，侵袭，转移和分化。所以，TRPC6抑制剂有望成为治疗癌症的新药物。但是关于TRPC6抑制剂的报道甚少。0006近年来，关于TRPC6与人类肿瘤的关系，科学家们进行了一系列的研究。结果证明，TRPC6与发病率较高的胃癌，肝癌，食管癌等都有着重要的联系。DAVIDGW在2013年报道了TRPC3和TRPC6的抑制剂，他们合成的化合物对HTRPC3和HTRPC6的IC50值可以达到纳摩尔级别，但是在进行动物实验的时候，发现该系列药物口服利用度低，体内清除率过高，虽然经过一系列的结构改造，。

10、但是仍然无法找到一个平衡点，使活性和口服利用率均处于较好的水平。0007经过大量的筛选，我们发现，化合物1具有优异的TRPC6抑制作用，是潜在的抗肿瘤药物。发明内容0008本发明旨在提供一种吡唑并1,5A嘧啶衍生物。本发明还提供上述化合物的细胞水平及靶点水平的活性筛选结果及其抗肿瘤应用。0009本发明涉及的一种吡唑并1,5A嘧啶衍生物，具有通式1所示的结构00100011其中0012R1为氢、烷基羰基、烷氧基羰基、烷基硫代羰基；0013R2为氢、烷基、卤代烷基；0014R3为氢、卤素、三氟甲基；0015所述的烷基为C1C6直链、支链或环状烷基，如甲基，乙基，正丙基，异丙基、正丁基，环己基等；0。

11、016所述的卤代烷基为15个卤原子取代的卤代烷基，如一氯甲基，三氟乙基等；0017所述的烷氧羰基为C1C6烷氧基羰基，如甲氧羰基，乙氧羰基，叔丁氧羰基等；说明书CN104292233A3/10页50018所述的烷基羰基为C1C6烷基羰基，如甲酰基，乙酰基，丙酰基，异丁酰基等；0019所述的卤素为氟，氯，溴。0020本发明提供式1所示化合物或其药学上可接受的盐。0021本发明中所采用的述语“药学上可接受的盐”是指在可靠的医药评价范围内，化合物的盐类适于与人或较低等动物的组织相接触而无不适当的毒性、刺激及过敏反应等，具有相当合理的收益/风险比例，通常是水或油的或可分散的，并可有效的用于其预期的用途。

12、。包括药学上可接受的酸加成盐和药学上可接受的碱加成盐，在这里是可用的并与式1化合物的化学性质相容的。0022本发明还提供式1所示的吡唑并1,5A嘧啶衍生物的制备方法。00231当R2H时，按如下路线制备002400251向化合物2中滴加5MNAOH，在3060摄氏度条件下搅拌1248小时，然后向溶液中滴加1M3MHCL至PH3，用乙酸乙酯萃取，无水硫酸钠干燥，过滤，旋干，得黄色油状液体4。00262将化合物4,N,N羰基二咪唑溶于四氢呋喃，室温搅拌35小时；将化合物丙二酸单乙酯钾盐，无水氯化镁和4二甲氨基吡啶溶于乙腈和四氢呋喃，室温搅拌48小时；上述两种混合液反应好后，降低到0摄氏度，将上述第。

13、一种溶液与三乙胺同时加到上述第说明书CN104292233A4/10页6二种溶液中，室温搅拌过夜。反应完成后，旋干溶剂，用水稀释，乙酸乙酯萃取，无水硫酸钠干燥，过滤旋干，得黄色油状液体5。00273中间体6的制备将化合物61，62溶于少量二氯甲烷后在100下回流反应824小时，冷却到室温后，再将此反应液加入到溶于50ETOH的盐酸肼溶液中，80回流过夜，反应结束后冷却至室温，用饱和NAHCO3碱化，乙酸乙酯萃取，饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥，过滤旋干，用石油醚和乙酸乙酯重结晶得白色至浅黄色固体6。00284将化合物5与化合物6溶于无水乙醇，再加入三氟乙酸，80摄氏度加热，反应824小时后停止加。

14、热。冷却到室温后旋干溶剂。用水稀释，1MNAOH调PH8，乙酸乙酯萃取，无水硫酸钠干燥，过滤，旋干，过硅胶柱，分离得到化合物7。00295将化合物7溶于二氯甲烷，0摄氏度条件下加入三氟乙酸，在该温度下反应25小时，旋干溶剂，用饱和碳酸氢钠溶液调PH10，过滤，滤渣用水洗，少量乙酸乙酯洗，真空干燥箱干燥，得白色固体8。00306将化合物8与相应的酸或酰氯或者烷基卤代烃，1羟基苯并三唑，苯并三氮唑N,N,N,N四甲基脲六氟磷酸盐溶于DMF，室温搅拌，加入二异丙基乙基胺，反应12小时后，用乙酸乙酯溶解，水洗，饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥，过滤，旋干，过硅胶柱，得白色固体为1。00312当R2H时，按。

15、如下路线制备0032说明书CN104292233A5/10页700331将圆底烧瓶无水无氧，在氮气氛围下加入二异丙基胺，四氢呋喃，0摄氏度搅拌，在该温度下慢慢滴加16M正丁基锂，滴加完毕后，0搅拌1530分钟，然后置于78摄氏度环境下，将溶于四氢呋喃的化合物2慢慢滴加到上述溶液中，搅拌1H后，将溶于四氢呋喃的碘甲烷滴加到上述溶液中，让其缓慢升至室温。反应完毕后，用饱和氯化铵溶液淬灭，旋干溶剂，用水稀释，乙酸乙酯萃取，无水硫酸钠干燥，过滤，旋干，得棕色油状液体3。00342向化合物3中滴加5MNAOH，在3060摄氏度条件下搅拌1248小时，然后向溶液中滴加1M3MHCL至PH3，用乙酸乙酯萃取。

16、，无水硫酸钠干燥，过滤，旋干，得黄色油状液体4。00353将化合物4,N,N羰基二咪唑溶于四氢呋喃，室温搅拌35小时；将化合物丙二酸单乙酯钾盐，无水氯化镁和4二甲氨基吡啶溶于乙腈和四氢呋喃，室温搅拌48小时；上述两种混合液反应好后，降低到0摄氏度，将上述第一种溶液与三乙胺同时加到上述第二种溶液中，室温搅拌过夜。反应完成后，旋干溶剂，用水稀释，乙酸乙酯萃取，无水硫酸钠干燥，过滤旋干，得黄色油状液体5。00364中间体6的制备将化合物61，62溶于少量二氯甲烷后在100下回流反应824小时，冷却到室温后，再将此反应液加入到溶于50ETOH的盐酸肼溶液中，80回流过夜，反应结束后冷却至室温，用饱和N。

17、AHCO3碱化，乙酸乙酯萃取，饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥，过滤旋干，用石油醚和乙酸乙酯重结晶得白色至浅黄色固体6。00375将化合物5与化合物6溶于无水乙醇，再加入三氟乙酸，80摄氏度加热，反应824小时后停止加热。冷却到室温后旋干溶剂。用水稀释，1MNAOH调PH8，乙酸乙酯萃取，无水硫酸钠干燥，过滤，旋干，过硅胶柱，分离得到化合物700386将化合物7溶于二氯甲烷，0摄氏度条件下加入三氟乙酸，在该温度下反应25小时，旋干溶剂，用饱和碳酸氢钠溶液调PH10，过滤，滤渣用水洗，少量乙酸乙酯洗，真空干燥箱干燥，得白色固体8。00397将化合物8与相应的酸或酰氯或者烷基卤代烃，1羟基苯并三唑，苯。

18、并三氮唑N,N,N,N四甲基脲六氟磷酸盐溶于DMF，室温搅拌，加入二异丙基乙基胺，反应12小时后，用乙酸乙酯溶解，水洗，饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥，过滤，旋干，过硅胶柱，得白色固体1。0040本发明中，特别优选的部分化合物对应的结构如下0041说明书CN104292233A6/10页8附图说明0042图1本发明的部分化合物激活TRPC6离子通道的细胞荧光膜电位实验结果。0043图2本发明的部分化合物激活TRPC6离子通道的全细胞膜片钳检测结果。0044图3本发明的部分化合物阻断TRPC6离子通道的细胞试验结果。具体实施方式0045通过下述实施例有助于理解本发明，但是不能限制本发明的内容。00。

19、46实施例1R1COCHPH2，R2H，R3F。00471向化合物22433G，01MOL中滴加5MNAOH60ML，03MOL，在50摄氏度条件下搅拌24小时，然后向溶液中滴加3MHCL到PH3，用乙酸乙酯3200ML萃取，无水硫酸钠干燥，过滤，旋干，得黄色油状液体41972G，9600482将化合物41456G，635MMOL,N,N羰基二咪唑2400G，86MMOL溶于四氢呋喃100ML，室温搅拌4小时；将化合物丙二酸单乙酯钾盐2810G，165MMOL，无水氯化镁1815G，191MMOL和4二甲氨基吡啶800MG，635MMOL溶于乙腈100ML和四氢呋喃200ML，室温搅拌6小时；。

20、上述两种混合液反应好后，均降低到0摄氏度，将上述第一种溶液与三乙胺52ML，254MMOL同时加到上述第二种溶液中，室温搅拌过夜。反应完成后，旋干溶剂，用水200ML稀释，乙酸乙酯3200ML萃取，无水硫酸钠干燥，过滤旋干，得黄色油状液体51806G，95。00493中间体6的制备将化合物61216ML，62219ML溶于二氯甲烷10ML后在100下回流反应24小时，冷却到室温后，再将此反应液加入到溶于50ETOH50ML的盐酸肼溶液中，80回流过夜，反应结束后冷却至室温，用饱和NAHCO3碱化，乙酸乙酯说明书CN104292233A7/10页93100ML萃取，饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥，。

21、过滤旋干，用石油醚和乙酸乙酯重结晶得白色固体6212G,7800504将化合物515G，45MMOL与化合物6945G，495MMOL溶于无水乙醇400ML，再加入三氟乙酸20ML，80摄氏度加热，反应12小时后停止加热。冷却到室温后旋干溶剂。用水100ML稀释，1MNAOH调PH8，乙酸乙酯3200ML萃取，无水硫酸钠干燥，过滤，旋干，用甲醇二氯甲烷120过硅胶柱，分离得到化合物71382G，7200515将化合物7618G，15MMOL溶于二氯甲烷100ML，0摄氏度条件下加入三氟乙酸35ML，在该温度下反应2小时，旋干溶剂，用饱和碳酸氢钠溶液调PH10，过滤，滤渣用水洗，少量乙酸乙酯洗，。

22、真空干燥箱干燥，得到白色固体8450G，9200526将化合物8327G，10MMOL，二苯基乙酸255G，1羟基苯并三唑41G，30MMOL，苯并三氮唑N,N,N,N四甲基脲六氟磷酸盐114G，30MMOL溶于DMF50ML，室温搅拌，加入二异丙基乙基胺156ML，90MMOL，反应12小时后，用乙酸乙酯300ML稀释，水4200ML洗，饱和食盐水100ML洗，无水硫酸钠干燥，过滤，旋干，用二氯甲烷甲醇301过硅胶柱，得白色固体为M114297G，57。1HNMR400MHZ,CD3OD734728Q,4H,725722T,J14,5HZ,5H,718708M,5H,547545D,J76H。

23、Z,1H,472469D,J132HZ,1H,418415D,J132HZ,1H,328327T,J32HZ,1H,300294T,J25HZ,1H,283277T,J24HZ,1H,266260T,J24HZ,1H,195192D,J124HZ,1H,172169D,J124HZ,1H,155147M,1H,115106M,1H13CNMR101MHZ,CD3OD1725,1412,1409,1318,1318,1303,1297,1294,1282,1279,1159,1157,557,477,447,440,327,325,140实施例2R1COOCH2PH，R2CH3，R3CL，步骤同。

24、实施例1，所不同的是R3由F变为CL。所得白色固体为M121收率69。1HNMR400MHZ,CD32SO794790M,2H,739731M,7H,544S,1H,510S,2H,413410D,J130HZ,2H,291S,2H,263256M,1H,247S,3H,185182D,J116HZ,2H,167160M,2H13CNMR101MHZ,CD32SO1655,1584,1545,1492,1475,1371,1344,1284,1282,1278,1278,1277,1275,1015,905,661,439,434,312,1530053实施例3R1COOET，R2CH3，R3。

25、F00541500ML圆底烧瓶，无水无氧，在氮气氛围下加入二异丙基胺168ML，120MMOL，溶于四氢呋喃150ML，0摄氏度搅拌，在该温度下慢慢滴加16M正丁基锂75ML，120MMOL，滴加完毕后，0搅拌15分钟，然后置于78摄氏度环境下，将溶于四氢呋喃60ML的化合物2243G慢慢滴加到上述溶液中，搅拌1H后，将溶于四氢呋喃60ML的碘甲烷938ML，150MMOL滴加到上述溶液中，让其缓慢升至室温。反应完毕后，用饱和氯化铵溶液淬灭，旋干溶剂，用水250ML稀释，乙酸乙酯3250ML萃取，无水硫酸钠干燥，过滤，旋干，得棕色油状液体32418G，94。00552向化合物32058G，80。

26、MOL中滴加5MNAOH80ML，04MOL，在60条件下搅拌24小时后，向溶液中滴加3MHCL到PH3,用乙酸乙酯3200ML萃取，无水硫酸钠干燥，过滤，旋干，得黄色油状液体41791G,92。00563将化合物41265G，52MMOL，N，N羰基二咪唑192G，69MMOL溶于四氢呋喃80ML，室温搅拌4小时；将化合物丙二酸单乙酯钾盐2248G，132MMOL，无水氯化镁说明书CN104292233A8/10页101452G，1528MMOL和4二甲氨基吡啶416MG,052MMOL溶于乙腈80ML和四氢呋喃150ML，室温搅拌6小时；上述两种混合液反应好后，将均降低到0度，将上述第一种。

27、溶液与三乙胺416ML，203MMOL同时加到上述第二种溶液中，室温搅拌过夜。反应完成后，旋干溶剂，用水150ML稀释，乙酸乙酯3150ML萃取，无水硫酸钠干燥，过滤旋干，得黄色油状液体51499G，93。00574中间体6的制备同实施例1300585将化合物51254G，40MMOL与化合物6841G，44MMOL溶于无水乙醇300ML，再加入三氟乙酸15ML，80加热，反应12小时后停止加热。冷却到室温后旋干溶剂。用水100ML稀释，用1MNAOH调PH8，用乙酸乙酯3200ML萃取，无水硫酸钠干燥，过滤，旋干，用甲醇二氯甲烷120过硅胶柱，分离得到化合物71269G，72。00596将化。

28、合物7881G，20MMOL溶于二氯甲烷120ML，0条件下加入三氟乙酸40ML，在该温度下反应2小时，旋干溶剂，用饱和碳酸氢钠溶液调PH10，过滤，滤渣用水洗，少量乙酸乙酯洗，真空干燥箱干燥，得到白色固体8618G，91。00607将化合物8340G，0MMOL，氯甲酸乙酯115ML,1羟基苯并三唑41G，30MMOL，苯并三氮唑N,N,N,N四甲基脲六氟磷酸盐114G，30MMOL溶于DMF50ML，室温搅拌，加入二异丙基乙基胺156ML，90MMOL，反应12小时后，用乙酸乙酯300ML稀释，水4200ML洗，饱和食盐水100ML洗，无水硫酸钠干燥，过滤，旋干，用二氯甲烷甲醇301过硅胶。

29、柱，得白色固体M110214G，521HNMR400MHZ,CDCL3984S,1H,716713T,J124HZ,2H,693688T,J168HZ,2H,570S,1H,410405Q,J212HZ,2H,360358D,J8HZ,2H,347343Q,J168HZ,2H,214S,5H,175174D,J52HZ,2H,145S,3H,125121T,J14HZ13CNMR101MHZ,CDCL31627,1602,1571,1554,1515,1387,1312,1270,1151,1149,1034,941,614,401,377,347,297,252,146,1280061实施例。

30、4本发明的部分化合物M085、M086、M091、M092激活TRPC6离子通道的细胞实验0062吡唑并嘧啶及其衍生物激活TRPC6离子通道图1。在永久性转染TRPC6离子通道的HEK293细胞中，使用M085作为激活剂，并检测荧光膜电位。先用FLIPR膜电位染料FMP对细胞进行染色，在第30S时分别加入01M、04M、11M、33M、10M、30M的M085，在04M30M的M085作用下，永久性转染TRPC6离子通道的HEK293细胞中荧光增强说明膜去极化的增加图1B，而未转染TRPC6离子通道的HEK293细胞对照中未显示出明显的荧光变化图1A。0063应用类似的荧光钙流检测M085对表。

31、达小鼠TRPC6的HEK293细胞内CA2浓度的影响，对细胞使用CA2指示FLUO4染色，在30S时加入01M、04M、11M、33M、10M、30M的M085，细胞内CA2在33M30M的M085作用下有明显升高图1C。荧光钙流检结果表明，吡唑并嘧啶及其衍生物中对TRPC6离子通道存在激活作用的化合物有M085、M086、M091及M092；其浓度响应曲线见图1D。其中，对M086分别进行荧光钙流检测和荧光膜电位检测结果见图1E。0064全细胞膜片钳检测结果显示，吡唑并嘧啶及其衍生物M085、M086、M091及M092对TRPC6通道的激活作用以M085为代表，图2A，HEK293细胞全细。

32、胞记录模式下钳制说明书CN104292233A109/10页11在100100MV，不同浓度下004M、012M、037M、11M、33M及10MM085对TRPC6的激活作用，其电流电压关系见图2B，其浓度响应曲线见图2C，EC5025MN57。0065实施例5本发明部分化合物M107、M110阻断TRPC6离子通道的细胞试验吡唑并嘧啶及其衍生物M107、M110能阻断TRPC6离子通道图3。永久转染M5毒蕈碱受体和TRPC6离子通道的HEK293细胞中，应用激动剂激活通道并检测荧光膜电位。细胞用0M、10M、30M的M107处理3分钟后，加入10M的M085，荧光强度的增强表示膜电位去极化。

33、增加，而M107处理的细胞膜电位去极化被抑制图3A。0066全细胞膜片钳检测结果显示，吡唑并嘧啶及其衍生物M107、M110对TRPC6通道的抑制作用，以M107为代表图3B,C。HEK293细胞全细胞记录模式下钳制在100100MV，用氨甲酰胆碱CCH，30M激活的TRPC6离子通道被M10720M抑制，并给出了20M的M107在100100MV下对CCH的抑制率60与20N5。0067实施例6本发明的化合物细胞水平的细胞毒活性筛选实验0068将对数生长期的细胞，用025胰酶EDTA消化后，配制成一定浓度的单细胞悬液，根据细胞生长速度的差异，按10002000个/孔接种于96孔板，每孔加入细。

34、胞悬液100L。24H后，加入含不同浓度化合物及相应溶剂对照的新鲜培养基，每孔加100LDMSO终浓度01，每种受试化合物设57个剂量组，每组至少设3个平行孔，于37继续培养72H后，弃上清，每孔加入100L新鲜配制的含05MG/MLMTT的无血清培养基，继续培养2H，弃上清后，每孔加入200LDMSO溶解MTT甲簪沉淀，微型振荡器振荡混匀后，酶标仪在参考波长450NM，检测波长570NM条件下测定光密度值OD，以溶剂对照处理的肿瘤细胞为对照组，用以下公式计算化合物对肿瘤细胞的抑制率，并按中效方程计算IC5000690070结果列于表1中0071表1本发明的部分化合物的体外细胞毒活性结果007。

35、2说明书CN104292233A1110/10页120073MCF7为人乳腺癌细胞株；H460为人肺癌细胞株；LNCAP、PC3、DU145为人前列腺癌细胞株；KB为人口腔上皮癌细胞株；RM1为小鼠前列腺癌细胞株。0074实施例7本发明的化合物的动物体内活性实验0075选用雄性C57/BL6小鼠，1822G。实验过程简述如下取生长良好的小鼠前列腺癌RM1的荷瘤小鼠，颈椎脱臼处死，无菌条件下剥取长势良好的瘤块，匀浆，用生理盐水14稀释，给每只小鼠腋下背部接种02ML瘤液约2106细胞，次日将动物随机分组并开始给药。化合物M11050MG/KG于接种24H后腹腔注射给药，给药体积为01ML/10G；同时设多西紫杉醇对照组及溶剂对照组，多西紫杉醇组以10MG/KG剂量给动物腹腔注射，给药体积为01ML/10G。连续给药10天后，颈椎脱臼处死，分别称量体重、瘤重。计算肿瘤生长抑制率，并将结果进行统计学处理。00760077表1本发明化合物对小鼠前列腺癌RM1移植瘤瘤重和动物体重的影响00780079上述实验结果表明，具有本发明通式的化合物M110具有体内抑制小鼠前列腺癌RM1移植瘤生长的药理学活性。说明书CN104292233A121/2页13图1图2说明书附图CN104292233A132/2页14图3说明书附图CN104292233A14。