本发明涉及对制癌作用具有刺激活性的喹啉衍生物的富马酸盐。本发明还涉及刺激制癌剂的制癌作用的含有所述富马酸盐的药剂以及用所述的制癌剂结合刺激制癌作用的方法。 世界上癌症患者的数目每年都在不断增加。在日本，所有引起死亡的疾病中癌症的死亡率最高。癌症治疗，特别是癌症的化疗，已引起普遍的社会关注。但是，到目前为止，虽然进行了广泛的研究努力，但找到的可有效地用于治疗癌症的药物寥寥无几。
化疗法治疗癌症的最大的临床问题之一是癌细胞对各种制癌剂产生抗性。也就是说，例如，抗阿霉素的细胞对许多其他制癌剂也具有抗性，这使得治疗非常困难。这种抗多种药物的现象被认为是由称为糖蛋白P的蛋白质引起的，该蛋白质由癌细胞在细胞的表面表达，并刺激制癌剂细胞外排泄。
因此，强烈希望找到一种具有下列特性的药剂：
（a）该药剂可以妨碍糖蛋白P的作用，通过克服抗药性来治疗所述具有抗药性的癌症，也就是说，该药剂可强烈地刺激制癌剂的制癌作用。
（b）该药剂对于临床应用没有任何毒性或基本上没有毒性。
在上述情况下，通过广泛研究，本发明人发现，一些特殊的化合物及它们的盐具有很强的对抗药性癌症的制癌作用的刺激作用，而具有很低的毒副作用。欧洲专利公开0363212 A2对此有报道。它们中的主化合物是被分类在含有碱性胺和高度可溶于脂肪中的一类化合物中的喹啉衍生物。这些化合物可以以供口服或注射的药物形式实际用于临床;但是，这些化合物的缺点是由于其物理性质的限制而口服吸收性和改进的水中溶解性差。因此，希望找到一种具有改进的水中高溶解性和足够的口服吸收性特性的新化合物，其中，上述物理性质得到了改进。
为了解决上述问题，本发明人进行了广泛研究，发现许多活性化合物具有碱性胺结构。然后，本发明人努力通过与几种酸形成盐来改进这些化合物的物理性质。在这些化合物中，作为代表性活性化合物的喹啉衍生物的富马酸盐特别是其物理性质得到了显著改进，它们具有优良的口服吸收性和改进的水中溶解性。由此完成了本发明。
也就是说，本发明的喹啉衍生物富马酸盐是下式（1）所示的喹啉衍生物和富马酸的盐，
式中，A表示下式（2）或（3）基团：
式（3）中，R1、R2和R3独立地表示氢或苯基。
本发明的喹啉衍生物富马酸盐具有优良的口服吸收性和改进的水中溶解性，正如下文试验实施例中将说明的。因此，本发明是提供这样一些化合物，它们在临床上用作制癌作用刺激剂是极其有益的。期望将它们用于癌症的化学治疗。
在式（1）的喹啉衍生物的富马酸盐中，用富马酸作为酸来形成盐，以便所述盐具有优良的口服吸收性和改进的水中溶解性。
为了产生本发明的喹啉衍生物富马酸盐，可以采用常规的形成有机胺与有机酸的盐的方法。例如，可将游离的喹啉衍生物（例如，它们可以是按欧洲专利公开0363212 A2中所述的方法制备的）和游离的富马酸分别溶于溶剂中或不用溶剂混合在一起，然后分离形成的盐。任何能对起始原料提供足以反应的溶解性的溶剂都可以使用，对它们没有进一步限制。作为溶剂，可以使用水、醇如甲醇或乙醇、普通有机溶剂如丙酮、乙酸乙酯或乙腈或两种或多种溶剂的混合物。反应可以在所用溶剂的熔点至沸点之间的温度下进行，通常为30℃至100℃。混合后，冷却所得混合物，然后通过过滤等方法分离所述盐。此外，起始化合物的混合比没有限制;但是，富马酸对喹啉衍生物的混合摩尔比可以在10∶1～0.5∶1之间。这样制得的盐中的富马酸对喹啉衍生物的摩尔比也是在1∶2～3∶1之间。
此外，这些喹啉衍生物组分含有旋光化合物，因为它们有不对称碳原子。因此，旋光富马酸盐包括在本发明的范围内。此外，为了产生旋光喹啉衍生物，例如，按照一种方法如欧洲专利公开0363212 A2中所述的方法用旋光表氯醇代替外消旋的表氯醇作为起始原料，或者通过已知方法对外消旋喹啉衍生物进行旋光拆分。
可将本发明的一种或多种喹啉衍生物富马酸盐与制癌剂同时或在给予病人制癌剂之后或之前给予病人。它们也可以与制癌剂分开给药。因此，可以将包含本发明的喹啉衍生物富马酸盐但不包含制癌剂的药物组合物制备成适于所希望给药方式的形式，然后与制癌剂同时或分开给药。也可以将包含本发明的喹啉衍生物富马酸盐和制癌剂的药物组合物制备成适于所希望给药方式的形式，然后用于同时给药。
给予病人的本发明喹啉衍生物富马酸盐的剂量随治疗的症状、与富马酸盐一起使用的制癌剂的特性等而变化。它们的日剂量对每一成年人来说一般可为10mg～2000mg。该日剂量可一次给药或分成两次或多次给药。
本发明的喹啉衍生物富马酸盐可以口服制剂如片剂、颗粒剂、粉剂、悬浮液、胶囊、糖浆等形式口服给药。它们也可以非经胃肠道制剂如注射剂、栓剂、供输液用的等渗溶液等形式而非经胃肠道给药。片剂可以例如通过常规方法用吸附剂如结晶纤维素、轻质硅酸酐等和赋形剂如玉米淀粉、乳糖、磷酸钙、硬脂酸镁等形成。本发明的喹啉衍生物的水性悬浮液、乳液和水溶液可用作注射剂。水性悬浮液可通过常规方法用棉籽油、玉米油、花生油、橄榄油等制备。乳液可以通过常规方法用表面活性剂制备。可以按常规的适于每种制癌剂的方法将制癌剂分别给药。
下面将通过实施例详细地说明本发明;但是，并不是企图将本发明限制于这些实施例。
实施例1
（a）将83g 5-羟基喹啉溶于1.5升无水二甲基甲酰胺（DMF）中，加入23.3g氢化钠（含量60%）后，将产生的混合物在50℃加热的同时搅拌30分钟。向反应混合物中加入160g表氯醇，在90℃加热并搅拌3小时后，减压下蒸掉溶剂。向所得残留物中加入水，用氯仿提取。将氯仿提取液用活性炭脱色并纯化，用无水芒硝干燥，然后蒸发。残留物通过硅胶柱层析纯化。通过用氯仿∶甲醇＝100∶1（体积比）的溶剂混合物洗脱层析，得到71g油状目标化合物5-（2，3-环氧丙氧基）喹啉。
（b）将71g上述5-（2，3-环氧丙氧基）喹啉和94gN-（2，2-二苯基乙酰基）哌嗪溶于1.5升乙醇中，然后将所得溶液加热回流3小时，反应后，蒸发乙醇，残留物通过层析纯化。用氯仿∶甲醇＝50∶1（体积比）溶剂混合物进行洗脱，减压下浓缩目标级分，得到101g 5-[3-｛4-（2，2-二苯基乙酰基）哌嗪-1-基｝-2-羟基丙氧基]喹啉（化合物1）。
熔点：162-164℃。
（c）将100g上述化合物1溶解在1升甲醇中，与将74g富马酸溶于500ml甲醇中所得的溶液混合。将混合物加热至40℃，然后在0℃放置过夜。滤出离析出的结晶，干燥，得到91g目标化合物5-[3-｛4-（2，2-二苯基乙酰基）哌嗪-1-基｝-2-羟基丙氧基]喹啉富马酸盐（化合物2）。该化合物就每摩尔喹啉衍生物而言含有1.5摩尔富马酸，具有下列物理性质：
熔点：211-213℃（分解）。
NMR δ ppm（CD3OD）;
2.55（d，2H）;2.75-2.85（m.4H）;3.62-3.68（m，2H）;3.72-3.80（m，4H）;4.14-4.25（m.2H）;4.25-4.35（m.1H）;5.47（s，1H）;6.73（s，1.5×2H）;7.03（d，1H）;7.17-7.35（m，10H）;7.48-7.72（m.3H）;8.76（d.1H）;8.80-8.85（m.1H）.
IR ν cm-1（KBr）：
3385;1644;1592;1277;1179;1110;799.
元素分析（%）：
C H N
计算值 65.94 5.68 6.40
测定值 66.01 5.62 6.04
实施例2
以如实施例1-（c）相同的方法进行反应，只是就一摩尔喹啉衍生物而言分别使用1、1.5、2和3摩尔富马酸。所得富马酸盐的分析结果表明具有实施例1-（c）中所示的同样的物理性质。
实施例3
以如实施例1-（c）相同的方法进行反应，只是用乙醇代替甲醇，得到73g富马酸盐。该化合物的物理性质与实施例1-（c）中所示的相同。
实施例4
在室温下，将用R（-）表氯醇作为表氯醇按照实施例1同样的反应得到的4.0g S（-）5-[3-｛4-（2，2-二苯基乙酰基）哌嗪-1-基｝-2-羟基丙氧基]喹啉溶于44ml乙酸乙酯中，向其中滴加由1.86g富马酸溶于32ml甲醇中得到的溶液。将该溶液在室温下放置过夜，然后滤出离析出的结晶物，用10ml溶剂混合物（乙酸乙酯∶甲醇＝1∶1体积比）洗涤。干燥结晶物，得到4.27g目标化合物S（-）-5-[3-{4-（2，2-二苯基乙酰基）哌嗪-1-基｝-2-羟基丙氧基]喹啉富马酸盐。
溶点：187-189℃。
元素分析（%）：
C H N
计算值 65.94 5.69 6.41
测定值 65.77 5.63 6.06
实施例5
在室温下，将用S（+）表氯醇作为表氯醇按照实施例1同样的反应得到的3.4g R（+）5-[3-{4-（2，2-二苯基乙酰基）哌嗪-1-基｝-2-羟基丙氧基]喹啉溶于37ml乙酸乙酯中，向其中滴加由1.58g富马酸溶于27ml甲醇中得到的溶液。将该溶液在室温下放置过夜，然后滤出离析出的结晶物，用10ml溶剂混合物（乙酸乙酯∶甲醇＝1∶1体积比）洗涤。干燥结晶物，得到3.56g目标化合物R（+）-5-[3-{4-（2，2-二苯基乙酰基）哌嗪-1-基｝-2-羟基丙氧基]喹啉富马酸盐。
溶点：187-189℃。
元素分析（%）：
C H N
计算值 65.94 5.69 6.41
测定值 65.88 5.42 6.10
实施例6
（a）将113g无水哌嗪与800ml二噁烷混合，加入50g 5-氯苯并环庚烷。然后将所得混合物加热回流7小时。冷却后，滤出不溶物，减压下蒸发溶剂。向蒸发所得残留物中加入少量石油醚，然后滤出离析出的结晶物，干燥，得到51g目标化合物N-（二苯并环庚烷-5-基）哌嗪。
熔点：110-111℃。
（b）将8.8g实施例1-（a）中所得的5-（2，3-环氧丙氧基）喹啉和12g N-（二苯并环庚烷-5-基）哌嗪溶于200ml乙醇中，然后将所得溶液加热回流3小时。反应后，蒸发溶剂，残留物通过硅胶柱层纯化。用氯仿∶甲醇＝50∶1（体积比）的溶剂混合物进行洗脱，得到14g目标化合物5-[3-｛4-（二苯并环庚烷-5-基）哌嗪-1-基｝-2-羟基丙氧基]喹啉（化合物3）。
熔点：131-133℃。
（c）将5g上述喹啉衍生物（化合物3）溶于200ml乙酸乙酯中，滴加由1.42g富马酸溶于50ml甲醇中得到的溶液，再向其中加入50ml乙酸乙酯，将混合物在室温下放置过夜。滤出离析出的结晶物，用乙醚洗涤，然后干燥，得到6.5g目标化合物5-[3-｛4-（二苯并环庚烷-5-基）哌嗪-1-基｝-2-羟基丙氧基]喹啉富马酸盐。该化合物就每摩尔喹啉衍生物含有1.5摩尔富马酸，具有下列物理性质：
熔点：139-141℃（分解）
元素分析（%）：
C H N
计算值 67.97 6.01 6.42
测定值 67.63 6.01 6.27
对比实施例1
将2g 5-[3-｛4-（2，2-二苯基乙酰基）哌嗪-1-基｝-2-羟基丙氧基]喹啉溶于50ml甲醇中，将所得溶液与由1.44g马来酸溶于10ml甲醇中所得的溶液混合。将由此得到的混合溶液减压下浓缩至大约一半体积，然后放置过夜。滤出离析出的结晶物，干燥，得到2.3g目标化合物4，即5-[3-｛4-（2，2-二苯基乙酰基）哌嗪-1-基）-2-羟基丙氧基]喹啉马来酸盐。该化合物就每摩尔喹啉衍生物含有2摩尔马来酸，具有下列物理性质：
熔点：140-142℃
元素分析（%）：
C H N
计算值 63.95 5.51 5.89
测定值 63.51 5.64 5.67
实验实施例1
按照日本药典，测定水中溶解性。
实施例1-（c） 化合物2∶1.4mg/ml
实施例1-（b） 化合物1∶小于1mg/ml
试验实施例2
口服吸收性
在给予试验药物之前将实验用雄性比哥猎狗禁食一夜。将所述药物悬浮在0.1%吐温80-0.1M NaCl-50mM磷酸盐缓冲液中，供给药用。将所有药物用狗用口服探针按50mg/kg的量强制给药。每一试验组用三只动物。在给药后0.25、0.5、1、1.5、2、4、6、9和24小时时采集血样（9次）。在每次采样时用用肝素处理过的一次性注射器采集5ml血样。每一血样在3000rpm下离心15分钟，得到血浆。用HPLC测定，然后从标准样品的校准曲线计算血浆中药物浓度。结果示于下列表中。
表1
实施例1-（b）化合物1在血浆中的浓度
采样(小时) 平均(μg/ml) 标准误差
0.25 2.46 3.99
0.5 3.37 5.33
1 4.53 5.39
1.5 4.35 5.05
2 4.18 4.91
4 2.43 2.79
6 1.62 1.80
9 0.44 0.58
表2
实施例1-（c）化合物2在血浆中的浓度
采样(小时) 平均(μg/ml) 标准误差
0.25 - -
0.5 14.68 4.42
1 13.21 5.50
1.5 12.72 4.12
2 10.51 2.55
4 6.76 0.45
6 3.70 0.32
9 1.21 0.16
24 0.03 0.05
试验实施例3
口服吸收性试验
在给予试验药物前，将7周龄的雌性CDF1小鼠禁食一夜。将所述药物悬浮在0.1%吐温80水溶液中，供给药用，并按100mg/kg（对于实施例1-（c）的化合物2）和109mg/kg（对于对比实施例1化合物4）的量用口服给药探针给药，以便得到等体积克分子浓度。每一试验组使用三只动物。在给药后0.5、1.0、2.0和4.0小时采集血样4次。在用氯仿麻醉下通过心穿刺术用肝素处理过的一次性注射器采集血样。每一血样在4℃和6000rpm下离心10分钟，得到血浆。用HPLC测定，然后从标准样品的校准曲线计算血浆中的药物浓度。结果示于下列表中。
表3
实施例1-（c）化合物2在血浆中的浓度
采样(小时) 3只小鼠平均值 标准误差
(μg/ml)
0.5 17.98 3.47
1.0 21.82 0.11
2.0 16.05 1.90
4.0 13.68 1.78
表4
对比实施例1化合物4在血浆中的浓度
采样(小时) 3只小鼠平均值 标准误差
(μg/ml)
0.5 14.30 2.68
1.0 11.36 2.62
2.0 11.93 0.96
4.0 5.99 3.67
试验实施例4
制癌作用刺激活性
将抗长春新碱的小鼠白血病细胞p388/VCR以2×104个细胞/ml的浓度悬浮在含85%胎牛血清的RPMI-1640培养液中。按每管（12×75mm）2ml癌细胞悬浮液接种，并在5% CO2气氛下于37℃培养。6小时后，以0.3、1或3μg/ml的浓度加入长春新碱和实施例1-（c）的化合物2，并在5%CO2气氛下于37℃继续培养72小时。将细胞培养物加到9.5mlISOTONⅡ中，用细胞计数器对细胞数目计数，然后计算长春新碱的50%生长抑制浓度IC50（ng/ml）。结果示于表5中。
表5
化合物 长春新碱的IC50(ng/ml)
化合物浓度(μg/ml)
0 0.3 1 3
实施例1-(c)化合物2 142 56.9 22.0 4.12