一种鹿茸骨膜组织的转基因方法.pdf

本发明公开了一种鹿茸骨膜组织的转基因方法，属于基因工程技术领域。本发明所提供的方法是利用脂质体包裹携带标记基因的病毒质粒，再将包裹后的病毒质粒转染到包装细胞中生成病毒颗粒，收集含病毒颗粒的细胞培养液上清液，浓缩后保存备用，采集鹿茸的骨膜组织，切割后利用包装好的病毒颗粒进行感染，最后将经过病毒感染的鹿茸骨膜组织移植到动物体内，鹿茸萌发后获得转基因鹿茸组织。

1.  一种鹿茸骨膜组织的转基因方法，其特征在于，利用脂质体包裹携带外源基因的病毒质粒，再将包裹后的病毒质粒转染到包装细胞中生成病毒颗粒，收集含病毒颗粒的细胞培养液上清液，浓缩后保存备用，采集鹿茸的骨膜组织，切割后利用包装好的病毒颗粒进行感染，最后将经过病毒感染的鹿茸骨膜组织移植到动物体内，鹿茸萌发后获得转基因鹿茸组织。

2.  权利要求1所述方法，其特征在于，步骤如下：
1)利用脂质体包裹携带有外源基因的病毒质粒，再将包裹好的病毒质粒与包装细胞293t一同孵育，孵育结束后获得含病毒颗粒的转染细胞液；
2)收取步骤1)所得的转染细胞液，离心除去破碎细胞后，收集上清液超滤浓缩获得病毒液，保存备用；
3)采集鹿茸骨膜组织，切割鹿茸骨膜组织后置于含有培养基的培养板中备用；
4)将步骤2)所得的病毒液制成病毒感染液并感染到步骤3)所得的鹿茸骨膜组织，感染后培养，获得感染组织；
5)将步骤4)所得的感染组织移植到动物体内，鹿茸萌发后获得转基因鹿茸组织。

3.  权利要求2所述方法，其特征在于，步骤1)所述病毒质粒，是慢病毒质粒，分别是质粒Pll3.7、衣壳质粒pMDG、包装质粒pMDLg/pRRE、pRSV_rev；所述脂质体，是脂质体Lipofectamine2000。

4.  权利要求3所述方法，其特征在于，所述质粒Pll3.7、衣壳质粒pMDG、包装质粒pMDLg/pRRE、pRSV_rev，按照1:1:1:1的质量比进行包裹，添加量为3μg。

5.  权利要求2所述方法，其特征在于，步骤1)所述孵育，是在37℃，5％CO₂的条件下孵育5h，孵育使用的培养基是含有10％FBS的DMEM，孵育结束后更换含有10％FBS、1％谷氨酰胺、双抗100U/ml的DMEM完全培养基。

6.  权利要求2所述方法，其特征在于，步骤2)所述超滤浓缩，使用0.45μm滤器过滤上清液，在利用离心超滤管，在4℃、5000g的条件下离心30min。

7.  权利要求2所述方法，其特征在于，步骤3)所述鹿茸骨膜组织，是鹿生茸区鹿茸骨膜组织；所述切割鹿茸骨膜组织，鹿茸骨膜组织的切割厚度为0.18-0.22mm；所述含有培养基的培养板，是每孔含有200-400μLDMEM的6孔培养板；培养基含有10％FBS和100U/mL双抗。

8.  权利要求2所述方法，其特征在于，步骤4)所述将病毒液制成病毒感染液，是吸干病毒液中培养基后，将病毒与助染剂Polybrene及DMEM培养基混合，使得最终每1mLDMEM培养基中含有10％FBS，100U双抗，10μg助染剂Polybrene，病毒的滴度为3.32×10⁷TU/mL；所述感染是在每个培养孔中加入2mL病毒感染液，每隔3天更换病毒感染液1次，连续感染3周。

9.  权利要求2所述方法，其特征在于，具体步骤如下：
1)利用脂质体Lipofectamine 2000包裹携带有外源基因的病毒质粒Pll3.7、衣壳质粒pMDG、包装质粒pMDLg/pRRE，pRSV_rev，再将上述包裹好的病毒质粒与包装细胞293t在37℃，5％CO₂的条件下孵育5h孵育使用的培养基是含有10％FBS的DMEM，孵育结束后更换含有10％FBS、1％谷氨酰胺、双抗100U/ml的DMEM完全培养基，孵育结束后获得转染细胞液；
2)转染24h后收取步骤1)所得的转染细胞液，离心去除破碎细胞，再使用0.45μm滤器过滤上清液，在利用离心超滤管，在4℃、5000g的条件下离心30min获得病毒液，保存备用；
3)采集鹿生茸区骨膜组织，并将骨膜组织切割成0.2mm厚的薄片，置于每孔含有200-400μLDMEM的6孔培养板中，培养基含有10％FBS和100U/mL双抗；
4)吸干步骤2)所得的病毒液中培养基后，将病毒与助染剂Polybrene及DMEM培养基混合，使得最终每1mLDMEM培养基中含有10％FBS，100U双抗，10μg助染剂Polybrene，病毒的滴度为3.32×10⁷TU/mL，再在每个培养孔中加入2mL病毒感染液，每隔3天更换病毒感染液1次，连续感染3周，获得感染组织；
5)将步骤4)所得的感染组织移植到动物体内，鹿茸萌发后获得转基因鹿茸组织。

10.  权利要求1-9所述任一方法，其特征在于，用于获得组织转基因动物。

一种鹿茸骨膜组织的转基因方法
技术领域
本发明涉及一种鹿茸骨膜组织的转基因方法，属于基因工程技术领域。
背景技术
动物组织转基因技术已经发展多年，常见的技术有通过向生殖细胞，胚胎注射外源基因及病毒载体等构建全身转基因的动物，或者通过构建含组织特异性启动子的病毒载体，获得组织特异性转基因动物。但是上述方法有如下弊端，首先是转基因的不确定性，通过生殖细胞/胚胎导入外源基因获得全身转基因动物，外源基因是随机整合的这就导致转基因的不确定性，随之整合的基因可能会影响动物内源基因的正常功能而影响动物的健康；另一方面随机整合也不便于在特定组织中分析某一或某些基因的功能或者获得组织特异性的目的基因的表达，例如哺乳动物器官生物反应器的获得。其次，组织特异性转基因动物建立的条件太苛刻，该方法获得转基因的先决条件是存在某种组织特异性启动子，并对其加以改造从而获得组织特异性转基因的效果。但是绝大数的基因的表达在空间序列上不具备组织特异性，甚至可能是全身表达的。另外在时间序列上这种限制也非常明显，某些基因只在动物某个组织的发育的特定阶段表达，在此时间节点之前、之后绝不表达。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供了一种鹿茸骨膜组织的转基因方法，所采取的技术方案如下：
本发明的目的在于提供一种鹿茸骨膜组织的转基因方法，该方法是利用脂质体包裹携带外源基因的病毒质粒，再将包裹后的病毒质粒转染到包装细胞中生成病毒颗粒，收集含病毒颗粒的细胞培养液上清液，浓缩后保存备用，采集鹿茸的骨膜组织，切割后利用包装好的病毒颗粒进行感染，最后将经过病毒感染的鹿茸骨膜组织移植到动物体内，鹿茸萌发后获得转基因鹿茸组织。
所述方法的步骤如下：
1)利用脂质体包裹携带有外源基因的病毒质粒，再将包裹好的病毒质粒与包装细胞293t一同孵育，孵育结束后获得含病毒颗粒的转染细胞液；
2)收取步骤1)所得的转染细胞液，离心除去破碎细胞后，收集上清液超滤浓缩获得病毒液，保存备用；
3)采集鹿茸骨膜组织，切割鹿茸骨膜组织后置于含有培养基的培养板中备用；
4)将步骤2)所得的病毒液制成病毒感染液并感染到步骤3)所得的鹿茸骨膜组织，感染 后培养，获得感染组织；
5)将步骤4)所得的感染组织移植到动物体内，鹿茸萌发后获得转基因鹿茸组织。
优选地，步骤1)所述病毒质粒，是慢病毒质粒，分别是质粒Pll3.7、衣壳质粒pMDG、包装质粒pMDLg/pRRE、pRSV_rev；所述脂质体，是脂质体Lipofectamine 2000。
更优选地，所述质粒Pll3.7、衣壳质粒pMDG、包装质粒pMDLg/pRRE、pRSV_rev，按照1:1:1:1的质量比进行包裹，添加量为3μg。
优选地，步骤1)所述孵育，是在37℃，5％CO₂的条件下孵育5h，孵育使用的培养基是含有10％FBS的DMEM，孵育结束后更换含有10％FBS、1％谷氨酰胺、双抗100U/ml的DMEM完全培养基。
优选地，步骤2)所述超滤浓缩，使用0.45μm滤器过滤上清液，在利用离心超滤管，在4℃、5000g的条件下离心30min。
优选地，步骤3)所述鹿茸骨膜组织，是鹿生茸区鹿茸骨膜组织；所述切割鹿茸骨膜组织，鹿茸骨膜组织的切割厚度为0.18-0.22mm；所述含有培养基的培养板，是每孔含有200-400μLDMEM的6孔培养板；培养基含有10％FBS和100U/mL双抗。
优选地，步骤4)所述将病毒液制成病毒感染液，是吸干病毒液中培养基后，将病毒与助染剂Polybrene及DMEM培养基混合，使得最终每1mLDMEM培养基中含有10％FBS，100U双抗，10μg助染剂Polybrene，病毒的滴度为3.32×10⁷TU/mL；所述感染是在每个培养孔中加入2mL病毒感染液，每隔3天更换病毒感染液1次，连续感染3周。
所述方法的具体步骤如下：
1)利用脂质体Lipofectamine 2000包裹携带有外源基因的病毒质粒Pll3.7、衣壳质粒pMDG、包装质粒pMDLg/pRRE，pRSV_rev，再将上述包裹好的病毒质粒与包装细胞293t在37℃，5％CO₂的条件下孵育5h孵育使用的培养基是含有10％FBS的DMEM，孵育结束后更换含有10％FBS、1％谷氨酰胺、双抗100U/ml的DMEM完全培养基，孵育结束后获得转染细胞液；
2)转染24h后收取步骤1)所得的转染细胞液，离心去除破碎细胞，再使用0.45μm滤器过滤上清液，在利用离心超滤管，在4℃、5000g的条件下离心30min获得病毒液，保存备用；
3)采集鹿生茸区骨膜组织，并将骨膜组织切割成0.2mm厚的薄片，置于每孔含有200-400μL DMEM的6孔培养板中，培养基含有10％FBS和100U/mL双抗；
4)吸干步骤2)所得的病毒液中培养基后，将病毒与助染剂Polybrene及DMEM培养基混合，使得最终每1mLDMEM培养基中含有10％FBS，100U双抗，10μg助染剂Polybrene，病毒 的滴度为3.32×10⁷TU/mL，再在每个培养孔中加入2mL病毒感染液，每隔3天更换病毒感染液1次，连续感染3周，获得感染组织；
5)将步骤4)所得的感染组织移植到动物体内，鹿茸萌发后获得转基因鹿茸组织。
所述任一方法用于获得组织转基因动物。
本发明获得的有益效果如下：
本发明所提供的方法将标记基因导入鹿茸骨膜组织，成功的构建出转基因鹿茸组织，对鹿茸特异性蛋白的表达以及药物开发具有重要意义。
附图说明
图1为感染后待移植的鹿茸组织；
(A，荧光镜下的组织块；B，光镜下的组织块)。
图2为转基因鹿茸的生成；
(A，移植三周后鹿茸萌发；B，携带报告基因的鹿茸组织)。
图3为转基因鹿茸荧光检测；
(A，鹿茸切片荧光观察；B，鹿茸切片可见光观察)。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明不受实施例的限制。
以下实施例所用材料、试剂、仪器和方法，未经特殊说明，均为本领域常规材料、试剂、仪器和方法，均可通过商业渠道获得。
实施例1重组慢病毒的包装
1.取出一定数目的10cm细胞培养皿，每板中加入4ml 0.01％的多聚赖氨酸，左右颠倒，使液体平铺于板底，室温下孵育10min后，吸取上清液。
2. 0.25％胰酶消化293t细胞并计数，接种细胞于上述10cm细胞培养皿中，每板加10mlDMEM中，含10％FBS不含抗生素，使细胞在转染日的融合度达到90％。
3.对于每板细胞，使用1.5ml无血清DMEM稀释24μg DNA(质粒Pll3.7：衣壳质粒pMDG：包装质粒pMDLg/pRRE：pRSV_rev质量比为1:1:1:1，每个质粒的添加量为3μg)，使用1.5ml无血清DMEM稀释51μl Lipofectamine 2000，室温下孵育5min。
4.将稀释的DNA和稀释的Lipofectamine 2000混合于一体，混合液在室温孵育30min。
5.吸去10cm细胞培养皿中的培养液将复合物加入到细胞培养皿中，摇动培养板，轻轻混匀。
6.将细胞培养皿在37℃，5％CO₂，孵箱孵育5h，5h后更换DMEM完全培养基(10％FBS、 1％谷氨酰胺、双抗100U/ml)。
7.24h后，倒置荧光显微镜下检测GFP表达情况以确定转染效率。
实施例2病毒的浓缩及保存
1.第一次收毒：转染后24h时，小心吸取10cm细胞培养皿中培养液于一干净无菌的50ml离心管中，1000rpm/min离心5min弃去细胞碎片沉淀。同时在培养皿中添加12ml新的完全培养基。
2.使用0.45μm滤器过滤上清液，将滤液置于Millipore Amicon Ultra-15离心超滤管，4℃、5000g离心30min。
3.弃去离心液，超滤后浓缩病毒液置于一干净无菌的1.5ml EP管贴上标签于-80℃或液氮保存。
实施例3生茸区骨膜组织的采集
1.选取健康1岁龄雄性梅花鹿，注射麻醉剂后送入手术台。
2.用电推去除鹿头顶部长毛后，用手术刀轻轻刮去细小茸毛。
3.用75％酒精喷洒清除杂质和碎毛，静置5min。
4.用棉球蘸取碘酒擦拭鹿头，保证各处均浸润有碘酒，室温下放置5-10min。
5.用干净灭菌后手术刀片切开皮肤，去除皮下结缔组织暴露骨膜。
6.更换手术刀片后，以工型分割骨膜，用无菌中号鼠牙镊子钝性剥离骨膜，立即放置到盛有25ml EMEM(含双抗)培养液的50ml离心管中旋紧管盖，上下颠倒离心管4-5次洗去血污。
7.其后的步骤均在生物安全柜中进行。用无菌镊子将骨膜从DMEM液中取出，置于一次性无菌平皿中，用手术刀再次清除骨膜组织表面的血污和粘连的结缔组织。
8.将组织转移到干净无菌的50ml离心管中，加入45ml无菌PBS，拧紧管盖震荡洗涤2～3min。
9.如此重复20～30次，直至显微镜视野无血细胞为止。
实施例4骨膜组织切割
1.将洗涤后组织取出平铺于切割台上；
2.用切割刀具将组织彻底切割为0.2mm厚左右的薄片；
3.用镊子将刀片间隙中薄片取出平铺于6孔培养板中；
4.每孔添加200～400ul DMEM(FBS％，双抗100U/ml)培养基后送入培养箱。
实施例5病毒感染
1.将先前获得的病毒从液氮中取出并放置于冰上融化；
2.取出组织培养板吸干其中的培养基；
3.将病毒与助染剂Polybrene及DMEM培养基混合，使得每1ml DMEM(FBS 10％，双抗100U/ml)培养基含助染剂Polybrene 10μg/ml，病毒滴度为3.32×10⁷TU/mL；
4.每个组织培养孔加入上述病毒感染液2ml；
5.每隔3天更换病毒感染液1次；
6.连续感染3周；
7.荧光镜下观察外源基因导入情况如图1所示。
实施例6组织移植
利用自行设计并制作的切割器制作皮内移植用“口袋”。口袋宽约1cm，深2.5cm。用镊子将组织递送进皮肤“口袋”并缝合伤口。培养数周后，转基因鹿茸由移植的小口袋处长出(图2)。采集鹿茸组织后，进行冰冻切片，调整切片厚度为0.4um，将将切片置于荧光显微镜下观察可以发现表达荧光的细胞呈带状分布与鹿茸软骨组织类似，说明本发明成功将GFP基因导入生茸区骨膜并生成含GFP的转基因鹿茸(图3)。
虽然本发明已以较佳的实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可以做各种改动和修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。