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本发明涉及利用小球藻表达了改造的兔防御素NP-1(mNP-1)，在小球藻中表达的防御素mNP-1和表达mNP-1的小球藻对鸡有很显著的促生长功能。本发明的结果可应用于制备鸡饲料添加剂。

1.  氨基酸序列为SEQ ID NO：16所示的短肽mNP-1或表达短肽mNP-1的小球藻在促进鸡体重增长中的应用。

2.  权利要求1所述的应用，其中所述短肽mNP-1的编码核酸序列为SEQ ID NO：15所示的序列。

3.  权利要求1所述的应用，其中所述短肽mNP-1为小球藻的提取液形式，所述mNP-1的浓度为1mg/ml。

4.  权利要求3所述的应用，其中短肽mNP-1的小球藻提取液与鸡饮用水的比例至少为1∶2000。

5.  权利要求4所述的应用，其中其中短肽mNP-1的小球藻提取液与鸡饮用水的比例为1∶2000-1∶200。

6.  权利要求1所述的应用，其中表达短肽mNP-1的小球藻为小球藻粉的形式，所述mNP-1的浓度为1mg/g。

7.  权利要求6所述的应用，其中表达短肽mNP-1的小球藻粉与鸡饲料的比例至少为1∶1000。

8.  权利要求7所述的应用，其中表达短肽mNP-1的小球藻粉与鸡饲料的比例为1∶1000-1∶100。

9.  权利要求1所述的应用，其中所述的鸡为肉鸡。

10.  鸡饲料添加剂，其包含氨基酸序列为SEQ ID NO：16所示的短肽mNP-1或表达短肽mNP-1的小球藻。

11.  权利要求10的鸡饲料添加剂，其为水剂、粉剂、颗粒剂、微颗粒剂、微丸剂、微囊剂的形式。

防御素mNP-1在促进鸡体重增加中的应用
技术领域
本发明涉及防御素及其在制备饲料添加剂中的应用。具体地，涉及利用小球藻生产的防御素mNP-1及表达mNP-1的小球藻及其在制备饲料添加剂中的应用。
背景技术
防御素的结构特点及分类
防御素是一类广泛存在于动物、植物和人类体内具有微生物抗性的阳离子小肽。防御素一般由29-54个氨基酸组成，分子量为3-6KD。在结构上具有以下共同特点：(1)带正电荷，(2)富含精氨酸，(3)具有一定数目的保守的半胱氨酸，(4)通过半胱氨酸分子形成分子内二硫键，使肽环合形成反向平行的β片层结构。自1985年美国加利福尼亚大学Lehrer教授对其命名以来(Selsted et al.，1985a)，受到国内外科学家的广泛关注。根据分子大小、结构与功能的差异，可将防御素大致分为四类：α防御素、β防御素、昆虫防御素与植物防御素。基于半胱氨酸残基的间距和二硫键的形式，哺乳动物的防御素可分为三类：α防御素、β防御素和θ防御素。哺乳动物的防御素由18-42个氨基酸组成，其中6个保守的半胱氨酸形成了3对二硫键，使肽链折叠成β片层结构。α防御素由29-36个氨基酸组成，二硫键的连接方式为1-6、2-4、3-5；β防御素由38-42个氨基酸组成，二硫键的连接方式为1-5、2-4、3-6，β防御素中还有一个脯氨酸和甘氨酸；1999年从非人灵长类恒河猴中发现了新的一类防御素——由18个氨基酸残基组成的环状θ防御素，它们是由两个不同的截短的α防御素类肽连接而成。
防御素在人体中广泛分布，人体中α防御素有6种，其中4种即HNP1-4主要产生于粒细胞，2种(HD5-6)主要产生于潘氏细胞；人类基因组有 28个β-防御素基因，在人类和鼠类已经鉴定出超过35个β-防御素基因。防御素的表达与病源微生物的入侵是紧密相关的，例如在透析病人的腹腔中同时发现有α防御素与β防御素，又如细菌性脑膜炎患儿的脑脊髓液中防御素的浓度比非细菌性脑膜炎高150倍。眼内防御素的表达研究表明，防御素在泪液中的含量与感染时的表达不同。研究表明防御素在人体防病抗病中起着非常重要的作用。
到目前为止，分离到的兔防御素有9个，其中7个为α防御素：NP-1，NP-2，NP-3a，NP-3b，NP-4，NP-5和Corticostatin VI，产生于粒细胞。另外2个来自于兔肾细胞的防御素：RK-1和RK-2。α-防御素NP-1比人防御素HNP-1的抗菌活性强5～10倍，两者间的这一明显差异被归结为它们的分子净电荷性质：在NP-1分子中含有9个净正电荷，而在HNP-1分子中仅含有3个净正电荷。目前，从生物体中分离到的防御素已达30多种，其中兔防御素(Netrophile Peptide-1，NP-1)的抗性谱最广。兔防御素NP-1由33个氨基酸组成，属于α-防御素，有6个半胱氨酸，它们形成3个二硫键，连接位置分别为1-6，2-4，3-5(Ganz，1989)。它对梅毒螺旋体、很多革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、真菌和病毒有显著的抑制或毒杀效应。
防御素抗微生物机理
在动植物及人体内，防御素含量极其少，却执行着机体重要的防御功能。与传统抗生素相比，防御素有其独特的抑制机理。
防御素的抗菌作用机理为：它依靠静电作用，通过本身所带的正电荷与带负电荷的微生物细胞膜相互吸附，即防御素与革兰氏阴性菌的脂多糖(LPS)、革兰氏阳性菌的脂磷壁酸等阴离子分子作用而附着在靶细胞表面，二聚或多聚的防御素穿膜形成瞬时的或稳定的跨膜离子通道(兔防御素NP-1形成瞬时的，人防御素HNP-1形成稳定的跨膜离子通道)，导致细胞内溶液外渗，从而扰乱了细胞膜的通透性及细胞能量状态，导致细胞膜去极化，呼吸作用受到抑制以及细胞内ATP含量下降，最终导致靶细胞死亡。
防御素的抗病毒作用则是通过与病毒外壳蛋白结合而导致病毒失去生物活性。
哺乳动物的细胞膜含有丰富的固醇和中性磷脂，其中中性磷脂包括磷脂酰乙醇胺(phosphatidyl-ethanolamine，PE)，磷脂酰胆碱(phosphatidyl-choline，PC)，鞘磷脂(sphingo-myelin，SM)。哺乳动物细胞膜中的胆固醇可通过影响磷脂流动性和偶极化来降低抗菌肽的作用，此外胆固醇还具有稳定脂质双分子层和延缓抗菌肽结合到膜上的作用。因此，哺乳动物的细胞膜甾醇可用来区分哺乳动物细胞和真菌细胞(Nozdrachev et al.，2006)。然而，在细胞膜上的胆固醇不是影响特异性的唯一分子，因为真菌也含有胆固醇，但真菌中的麦角甾醇对抗菌肽敏感。正是微生物细胞膜和细胞成分与哺乳动物细胞膜成分的差异，影响着抗菌肽作用的选择性和特异性。
正是由于这些特殊的作用机理，使得目的微生物难以产生抗防御素的抗性变异，因此防御素被认为是一种新型低耐药性甚至无耐药性的抗感染肽类药物。
不同防御素的抗微生物活性
由于不同来源的防御素在结构上有一定的差异，因此它们的抑菌谱亦有很大差别。各种α-防御素对革兰氏阴性菌、阳性菌，分枝杆菌、真菌、被膜病毒、HIV病毒在不同程度上都有抑制作用，其作用剂量大部分在1-100μg/ml之间(Patterson-Delafied et al.，1980，1981；Lehrer et al.，1983，1985a，1985b，1986，1989；Selsted et al.，1984，1985b，1987，1992；Ganz，1985；Segal et al.，1985；Daher et al.，1986；Levitz et al.，1986；Shafer et al.，1988；Eisenhauer et al.，1989；Yamashita and Saito，1989；Cullor et al.，1990，1991；Miyasaki et al.，1990a，1990b，1990c；Borenstein et al.，1991a，1991b；Kohashi et al.，1992；Ogata et al.，1992；Nakashima，1993)。与其它抗微生物肽相比，防御素具有更广的抗性谱，尤其是兔防御素NP-1，NP-2，不但抗性谱广，抑菌活性也较强。
1984年，Selsted等发现从兔中性粒细胞分离获得的NP-1在浓度为50μg/ml时对3个家系的金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)，表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)，肺炎链球菌(Staphylococcus pneumoniae)，无乳链球菌(Staphylococcus agalactiae)，李斯特菌(Listeria  monocytogenes)，铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)，大肠杆菌(Escherichia coli)，肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)，粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)，流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)和支气管炎博德氏杆菌(bordetella bronchiseptica)抑制生长或者杀灭作用(Selsted et al.1984)。
1985年，Lehrer等首次发现兔MCP-1和MCP-2(现名分别为，兔防御素NP-1和NP-2)在体外对1型单纯疱疹病毒(herpes simplex virus type1，HSV-1)具有中和活性作用，而4个结构同源的肽NP-3a，NP-3b，NP-4和NP-5对HSV-1无效。兔防御素NP-1和NP-2对单纯疱疹病毒的灭活作用依赖于肽浓度以及肽与HSV-1孵育的时间，温度和pH。2型单纯疱疹病毒(herpes simplex virus type 2，HSV-2)，水泡性口炎病毒(vesicular stomatitis virus)，流感病毒A/WSN(influenza virus A/WSN)也易被MCP-1和MCP-2直接中和，但MCP-1和MCP-2对巨细胞病毒(cytomegalovirus)，埃可病毒II型(echovirus type11)，和呼肠孤病毒3型(reovirus type 3)无效。
1986年，Lehrer等也首次报道HNP1对包膜病毒单纯疱疹病毒1和2(HSV-1和HSV-2)、水泡性口炎病毒，人流感病毒有直接灭活作用，但对非被膜病毒埃可病毒和呼肠孤病毒没有作用。在包膜病毒的研究中，HNP1对HSV-1和HVS-2有很强的直接抑制作用，对水泡性口炎病毒和流感病毒(IAV)有温和的直接抑制作用，对巨细胞病毒，仅在高浓度时，才有轻微的作用。
防御素对真菌的作用受到温度、盐离子和浓度的影响(Selsted et al.，1985，Lehrer et al.，1985a)，抗真菌能力与真菌的种属有关，与真菌的是菌丝状态还是孢子的状态有关(De Lucca et al.，1997)。
防御素NP-1对白色念珠菌有显著的抑杀作用，其与白色念珠菌的结合具有两期动力学特点。结合的初期呈现温度不依赖性，甚至在0℃时也可发生结合。初期的结合是相对特异的，可逆的，可饱和的，以及高容量的。它可被培养基中的高浓度盐抑制，但不受高浓度的钙离子影响，不会随着温度降低，甚至低到0℃而受影响。第二相的结合受到毫摩尔浓度的钙离子影响，但不受镁离子影响。第二相的结合在0℃时不可发生甚至用浓度高到亚毒性浓度的NP-1来检测时也不会发生(Lehrer et al.，1985)。
目前认为防御素通过破坏细胞膜而起作用，对白色念珠菌的抑杀作用还伴随着细胞内钾离子渗漏(Salvatore et al.，2007)
抗生素耐药菌的出现，甚至多重耐药菌的发现，以及耐药菌感染的急剧上升，急需不会带来病原菌耐药性的新药物。由于防御素具有强大的抗菌和免疫调节作用，防御素对抗生素耐药菌及多重耐药菌也均具有抑杀作用。与传统的抗生素相比，细菌从防御素中获得耐药性极为困难。因此，广泛地认为防御素是最具有潜力的新一代抗感染生物肽。
防御素的杀伤效果可被血清抵消，可能是由于防御素结合到各种血浆蛋白如特异性补体成分，丝氨酸蛋白酶抑制剂和激活的a2-巨球蛋白(Lichtenstein et al.，1986，1988a and1988b；Okrent et al.，1990；Panyutich et al.，1991，1994and 1995)。当1％胎牛血清存在时，人防御素(HNPs)介导的肿瘤细胞裂解降低了30％，而当5％胎牛血清存在时，人防御素(HNPs)介导的肿瘤细胞裂解降低了75％(Lichtenstein et al.，1986)。
饲料添加剂
饲料添加剂是指在饲料生产加工、使用过程中添加的少量或微量物质，在饲料中用量很少但作用显著。饲料添加剂是现代饲料工业必然使用的原料，对强化基础饲料营养价值，提高动物生产性能，保证动物健康，节省饲料成本，改善畜产品品质等方面有明显的效果。
饲料添加剂的种类繁多，美国批准的添加剂有300多种，欧共体有250种，中国批准的有173种。随着饲料工业的发展，饲料添加剂的品种不断增加，为了科学的研究、生产与管理，根据动物营养学原理，一般将饲料分为营养型和非营养型两大类。生长促进剂的主要功能是刺激动物生长，增进动物健康，改善饲料利用率，提高动物生产能力，节省饲料费用的开支，主要包括有抗生素、酶制剂、砷制剂和生长激素。生长促进剂就包含在非营养型饲料添加剂中。具体见下表：

抗菌肽作为饲料添加剂的研究进展
抗菌肽作为饲料添加剂的研究报道较少，仅国内有少量报道认为抗菌肽作为饲料添加剂应用于畜牧生产中。何丹林等(2004)在饲料中添加蚕抗菌肽AD-酵母制剂后发现，抗菌肽的添加能有效地抑制饲料中细菌的繁殖，且对粤黄鸡小肠中淀粉酶和蛋白酶活性和饲料营养价值没有不良影响。温刘发等(2001)对粤黄鸡的饲养试验表明，通过饮水方式给小鸡添加抗菌肽后，可在促进小鸡生长的同时减少其排泄物中的氮含量。肖小平等(2011)研究哺乳动物防御素作为饲料添加剂对母猪生产性能和仔猪健康水平的影响，研究结果表明，在母猪日粮中添加防御素，可以明显提高初生仔猪成活率，降低弱仔率、木乃伊胎率、弱仔率；明显增加小猪的初生重、断奶均重、日增重；能够明显提高仔猪的健康水平。与抗生素相比，使用抗菌肽可以较大程度地降低生产成本，提高经济效益(胡烨等，2013)。
兔防御素及其生产
兔防御素(Netrophile Peptide-1，NP-1)最初是从兔嗜中性白细胞分离得到的，由33个氨基酸组成，属于α防御素，由非常保守的6个半胱氨酸形成三对二硫键。二硫键的正确配对直接影响到防御素的活性。其抗菌活性比同属于α防御素的人防御素HNP-1的强5-10倍，两者间的这一明显差异被归结为它们的分子净电荷性质：在兔NP-1分子中含有9个净正电荷，而在HNP-1分子中仅含有3个净正电荷。作为最早发现的防御素之一，人们对其功能也研究得较多，NP-1是目前从生物界分离到的防御素中抗性谱最广的一个，其抗性谱列表如下(表1)。
表1.兔防御素NP-1的抗性谱

NP-1的抗菌活性已有较多报道(Patterson-Delafield et al.，1980，1981；Selsted et al.，1984，1985c；Lehrer et al，1983，1985a，1985b，1986；Levitz et al.，1986；Miyasaki et al.，1990b，Borenstein et al.，1991a，1991b；Kohashi et al.， 1992)，但其在抗病毒方面的报道较少(Nakashima et al.，1993；Lehrer et al，1985b；Sinha et al.，2003)。
兔防御素作为饲料添加剂的研究还未见报道。
目前文献报道获取兔防御素的途径大部分是从兔子中获得的(Selsted et al.，1983，1984，1985；Lehrer et al.，1981，1983，1985；Sinha et al.，2003)。
中国科学院遗传与发育生物学研究所以椭圆小球藻硝酸还原酶基因缺失突变体为受体，以NPTII和硝酸还原酶基因为筛选标记，以Ubiquitin启动子控制NP-1，获得了能够在硝酸盐培养基上培养而且具有较强NP-1活性的转基因小球藻(安洋等，2008)。经过载体优化和转基因藻株纯化后，转基因小球藻可在无抗生素培养基上连续继代培养15代，并能够高效表达具有生物学活性的NP-1(Bai et al.，2013)，更令人兴奋地是，转基因藻可规模化培养，规模可达到10吨级，仍能够能够高效表达具有生物学活性的NP-1。
发明内容
本发明提供了一种改造的NP-1(即mNP-1)和表达mNP-1的小球藻及其在饲料添加剂方面的应用。所述的改造的NP-1(即mNP-1)具有34个氨基酸，第一个氨基酸为甲硫氨酸，是新加上的，其余的33个氨基酸来自兔防御素NP-1的序列，改造后的NP-1的核苷酸序列为SEQ ID NO：15所示，其氨基酸序列为SEQ ID NO：16(简称mNP-1)。我们的研究发现，mNP-1具有较强促进肉鸡生长的能力。白羽肉鸡的动物实验证明mNP-1的小球藻提取液(含1mg/ml mNP-1)与白羽肉鸡饮用水的比例1∶2000，转基因小球藻粉(含1mg/g mNP-1)与饲料的添加比例为1∶1000时有明显的促生长作用。白羽肉鸡日常饮水量是进食饲料2倍，上述两种饲喂方式每只鸡的mNP-1的摄入量相等。如果转基因小球藻粉(含1mg/g mNP-1)与饲料的添加比例为1∶1000-1∶100，则mNP-1的小球藻提取液(含1mg/ml mNP-1)与白羽肉鸡饮用水的比例1∶2000-1∶200。利用提取的mNP-1提取液和表达mNP-1的小球藻粉分别制成饮用水和饲料来饲喂白羽肉鸡，从1日龄饲喂到出栏(42日龄)，体重与阴性对照组1(无添加促生长类饲料添加剂)相比均有显著差异，分别增重6.6％和8.5％；与阴性对照组 2(野生小球藻组，与饲料混合比例为1∶1000)相比也有显著差异，分别增重5.5％和7.4％；与阳性对照组(维吉尼亚霉素组，每公斤饲料添加维吉尼亚霉素15毫克)相比也有显著差异，分别增重1.7％和3.6％。
具体地，在本发明的一个方面，提供了一种短肽mNP-1，其氨基酸序列为SEQ ID NO：16所示的序列。
在本发明的另一个方面，提供了编码所述短肽mNP-1的核酸。优选地，所述核酸的序列为SEQ ID NO：15所示的序列。
在本发明的另一个方面，提供了一种表达载体，其包含上述之一的核酸。
在一个具体的实施方案中，所述表达载体是通过将Nos终止子(SEQ ID NO：6)，Ubiquitin基因启动子(SEQ ID NO：1)，含有编码上述mNP-1(SEQ ID NO：13)的基因以及NR基因表达框(SEQ ID NO：5)依次连接到载体的多克隆位点中，获得表达载体pGreen-NR-U-mNP1。
在本发明的另一个方面，提供了宿主细胞，其包含上述的核酸或上述的表达载体。
在本发明的又一个方面，提供了饲料添加剂，其包含上述的短肽mNP-1或上述的编码所述短肽mNP-1的核酸和任选地载体。优选地，所述的饲料添加剂为水剂、粉剂、颗粒剂、微颗粒剂、微丸剂、微囊剂的形式。
在本发明的又一个方面，提供了上述的短肽mNP-1和表达短肽mNP-1的小球藻在促进鸡体重增加中的应用。在优选的实施方案中，白羽肉鸡的动物实验证明mNP-1的提取液与白羽肉鸡饮用水的比例1∶2000，转基因小球藻粉与饲料的添加比例为1∶1000时有明显的促生长作用：利用提取的mNP-1提取液和表达mNP-1的小球藻粉分别制成饮用水和饲料来饲喂白羽肉鸡，从1日龄饲喂到出栏(42日龄)，体重与阴性对照组1(无添加促生长类饲料添加剂)相比均有显著差异，分别增重6.6％和8.5％；与阴性对照组2(野生小球藻组，野生小球藻与饲料混合比例为1∶1000)相比也有显著差异，分别增重5.5％和7.4；与阳性对照组(维吉尼亚霉素组，每公斤饲料添加维吉尼亚霉素15毫克)相比也有显著差异，比阳性对照组分别增重1.7％和3.6％。
具体地，本发明涉及氨基酸序列为SEQ ID NO：16所示的短肽mNP-1 或表达短肽mNP-1的小球藻在促进鸡体重增长中的应用。
在具体实施方案中，所述短肽mNP-1的编码核酸序列为SEQ ID NO：15所示的序列。
在具体实施方案中，所述短肽mNP-1为小球藻的提取液形式，所述mNP-1的浓度为1mg/ml。
在具体实施方案中，短肽mNP-1的小球藻提取液与鸡饮用水的比例至少为1∶2000。
在具体实施方案中，短肽mNP-1的小球藻提取液与鸡饮用水的比例为1∶2000-1∶200。
在具体实施方案中，表达短肽mNP-1的小球藻为小球藻粉的形式，所述mNP-1的浓度为1mg/g。
在具体实施方案中，表达短肽mNP-1的小球藻粉与鸡饲料的比例至少为1∶1000。
在具体实施方案中，表达短肽mNP-1的小球藻粉与鸡饲料的比例为1∶1000-1∶100。
在具体实施方案中，所述的鸡为肉鸡。
在另一方面，本发明涉及鸡饲料，其包含氨基酸序列为SEQ ID NO：16所示的短肽mNP-1或表达短肽mNP-1的小球藻。
在具体的实施方案中，所述鸡饲料为水剂、粉剂、颗粒剂、微颗粒剂、微丸剂、微囊剂的形式。
附图说明
图1.PBI221质粒结构图。
图2.pbinUGUS质粒结构图。
图3.pGreen0029质粒结构图。
图4.pGreen0029nos质粒结构图。
图5.pGreen0029-U-nos质粒的结构图。
图6.pGreen0029-U-mNP1-nos质粒结构图。
图7.pGreen-NR-U-mNP1质粒结构图。
图8.电击方法转化椭圆小球藻硝酸还原酶功能缺失突变体得到的抗 G418的藻落。
图9.NPTII基因PCR检测结果。1泳道为阳性质粒，2泳道为未转化藻株nrm-4；3-11泳道为转化藻株1-9；
图10.Ubi-mNP-1-Nos基因PCR检测结果。1泳道为未转化藻株nrm-4；2泳道为阳性质粒；3-11泳道为转化藻株1-9。
图11.Sephadex G-50的紫外吸收峰图。
图12.Sephadex C-25的紫外吸收峰图。
图13.从转基因小球藻中纯化mNP-1的电泳图。1，4：蛋白质分子量标准；2，3：纯化的mNP-1(箭头所指)。
图14.mNP-1胰蛋白酶解肽段LC-MS分析结果。
图15.42日龄各组白羽肉鸡十二指肠绒毛组织病理学观察。
A第一组(1mg/ml，mNP-1提取液)；B第二组(1‰mNP-1小球藻粉)；C第三组(阴性对照无饲料添加剂)；D第四组(野生藻粉，1‰)
图16.42日龄各组白羽肉鸡脾组织病理学。
A第一组(mNP-1提取液)脾小体；B第二组(1‰mNP-1小球藻粉)脾小体；C第三组(阴性对照无饲料添加剂)；D第四组(野生藻粉，1‰)；E第五组(维吉尼亚霉素)。
图17.42日龄各组白羽肉鸡心、肝、肺、肾、胰腺和胸腺组织病理学。A和B，心脏；C和D，肾脏；E和F，肺；G和H，肝脏；I和J，胰腺；K和L，胸腺；M和N，肌胃。
图18.mNP-1的HPLC标准曲线。注：横坐标是mNP-1所在时间位置的峰面积。
具体实施方式
下面参考实施例和附图详细描述本发明。本领域的普通技术人员可以理解的是，下述实施例是举例说明的目的，其不应以任何方式解释为对本发明的限制。本发明的保护范围由后附的权利要求所限定。
各种限制性内切酶，DNA上样缓冲液(6×Loading Buffer)购自TaKaRa公司；普通Taq酶，plus 2000Maker，DNA纯化回收试剂盒，购自北京全式金生物技术有限公司；T4DNA连接酶购自NEB公司；葡萄糖及其他无 机试剂均购自北京经科宏达生物技术有限公司；鲑鱼精DNA购自Invitrogen公司；丙烯酰胺，甲叉丙烯酰胺，购自鼎国公司；Sephadex G-50，Sephadex C-25购自pharmacia公司。
关于mNP-1的克隆，表达载体构建，小球藻转化，mNP-1的提取以及纯化参见中国专利申请号201110445061.5的申请。具体如下
实施例1.椭圆小球藻硝酸还原酶突变体的表达载体构建方法
根据Ubiquitin启动子序列(SEQ ID NO：1)设计引物，上游引物：5’CCGGAAGCTTGTGCAGCGTGACCCG3’(SEQ ID NO：2)；下游引物：5’GCCCGGATCCCTGCAGAAGT3’(SEQ ID NO：3)，其中在上游引物中加入Hind III酶切位点(下划线标出部分)，下游引物中加入BamH I酶切位点(下划线标出部分)，用PCR方法从玉米基因组中得到Ubiquitin启动子，测序结果显示为Ubiquitin启动子序列(SEQ ID NO：4，其在SEQ ID NO：1的5’端及3’端分别添加了Hind III酶切位点和BamH I酶切位点)。PCR反应条件为：94℃预变性3min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸2min，30个循环结束后，72℃延伸10min。将PCR产物2007bp大小的片段，用Hind III和BamH I内切酶双酶切，质粒pBI221(Clontech)(图1)也经Hind III和BamH I内切酶双酶切，然后将两双酶切产物16℃连接过夜，连接产物转化大肠杆菌DH5α，在含有50mg/L氨苄霉素的LB培养基上37℃倒置培养过夜，对长出的抗性菌落提取质粒进行Hind III和BamH I内切酶双酶切鉴定，能够得到1987bp大小片段(即Ubiquitin启动子)的质粒即命名为pbinUGUS(图2)。
实施例2.利用pGreen0029框架来构建表达载体。
根据Nos终止子序列(SEQ ID NO：6)设计引物，上游引物：5’ATAAGAATGCGGCCGCTCGAATTTCCCCGATCGTTCAAAC3’(SEQ ID NO：7)下游引物：5’CGAGCTCGCCCGATCTAGTAACATAGATGA3’(SEQ ID NO：8)其中在上游引物中加入Not I酶切位点(下划线标出部分)，在下游引物中加入Sac I酶切位点(下划线标出部分)，用PCR的方法从 pBI221(Clontech)中获得了Nos终止子，PCR反应条件为：94℃预变性3min，94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环结束后，72℃延伸10min。将PCR产物268bp大小的片段，用Not I和Sac I内切酶双酶切，质粒pGreen0029(图3，来自BBSRC)也经Not I和Sac I内切酶双酶切，然后将两双酶切产物16℃连接过夜，连接产物转化大肠杆菌DH5a，在含有50mg/L卡那霉素的LB培养基上37℃倒置培养过夜，对长出的抗性菌落提取质粒进行Not I和Sac I内切酶双酶切鉴定，能够得到270bp左右大小片段(即Nos终止子)的质粒即命名为pGreen0029nos(图4)。
实施例3.椭圆小球藻硝酸还原酶突变体的表达载体pGreen-NR-U-mNP1的构建.
按照常规技术，将Ubiquitin启动子(SEQ ID NO：1)从载体pbinUGUS(图2)中通过HindIII和BamHI双酶切回收后，连接到同样经过HindIII和BamHI双酶切的pGreen0029nos载体上(图4)获得pGreen0029-U-nos初级中间载体(图5)。通过化学合成方法合成带有目的基因mNP-1的序列(其序列如SEQ ID NO：13)，为提高NP-1的抗病毒活性，在合成的过程中，在NP-1的N端添加了一个甲硫氨酸，将NP-1改造成了mNP-1，因mNP-1基因太小，为方便构建载体，在该基因的C端添加了75bp辅助序列，同时在基因的5’和3’端分别添上两个酶切位点BamH I和NotI，最终得到合成的带有mNP-1基因的201bp序列(SEQ ID NO：13)，将合成的序列(SEQ ID NO：13)通过BamH I和NotI双酶酶切回收189bp的带有mNP-1基因的片段，然后与经同样经过BamH I和NotI双酶酶切的载体pGreen0029-U-NOS连接(图5)，获得载体pGreen0029-U-mNP1-nos(图6)。最后通过HindIII酶切pSK-NR质粒(含有硝酸还原酶表达框NR序列，小球藻NR基因序列已提交到GenBank，接收号为AY275834，NR表达框序列如SEQ ID NO：5所示，涉及pSK-NR质粒及NR表达框的专利公开号：CN1676597)，回收4518bp NR表达框片段，单酶切NR表达框和载体pGreen0029-U-mNP1-NOS，然后将它们相连，则构建成椭圆小球藻硝酸还原酶突变体的mNP-1植物表达载体pGreen-NR-U-mNP1(见图7)。
实施例4.小球藻电击转化
小球藻E₄液体培养基见表4。
小球藻固体培养基：液体培养基+7％琼脂pH 5.4～7.0。
小球藻筛选培养基：小球藻固体培养基的Na₂NO₂0.69g/L替换为10mmol/L NO₃^-，并添加抗生素G418至终浓度为15mg/L。
取50ml对数生长期的硝酸还原酶突变体小球藻nrm-4(公开号：CN 1676597A)，50×g，离心10min离心收集藻细胞(Refrigerated Centrifuge CR 20B2，HIACHI)；用高渗液(山梨醇0.2M，甘露醇0.2M)冰上处理1-3h；50g离心10min，去上清，沉淀用5ml电击缓冲液(山梨醇0.2M，甘露醇0.2M，KCL 0.08M，CaCL₂0.005M，HEPES 0.01M)悬浮，并用电击缓冲液调细胞密度到1×10⁶个/mL；加入终浓度为10μg/mL的质粒pGreen-NR-Ubi-mNP1和25μg/mL的鲑精DNA，混匀，冰上放置5-10min后电击，取400μl混合好的小球藻细胞放入电击杯中，电击。脉冲电压为6-10.5KV，脉冲持续时间分别为0.001-0.2s，脉冲次数为2¹⁰，脉冲距离为2mm，循环周期为100。电击后将小球藻转入筛选培养基中培养(图8)。
实施例5.转基因小球藻的分子检测
a.转基因小球藻总DNA的提取
挑取平板上的单藻落细胞接种于15mg/L G418液体培养基中培养，(25℃，光照2500lux，120rpm)。2周后(浓度达到约为1×10⁸个/mL)，1600g离心10min收集藻细胞，在液氮中将细胞磨碎，参照文献Chen et al.，(2001)的方法提取小球藻总DNA，提取的DNA存于-20℃备用。
b.转基因小球藻的PCR检测
以转基因藻基因组DNA为模板，分别进行NPTII基因(载体质粒pGreen0029中的卡那抗性基因，序列为SEQ ID NO：14)和Ubiquitin启动子mNP-1-Nos终止子的PCR扩增。检测NPTII基因的PCR引物为：正向引物NPTII-f，5’GTCCTGATAGCGGTCCGCCAC3’(SEQ ID NO：9)；反向引物NPTII-r，5′TCCGGTGCCCTGAATGAACT3’(SEQ ID NO：10)。PCR反应条件为：94℃预变性3min，94℃变性30s，57℃退火40s，72℃延伸 1min 30s，30个循环结束后，72℃延伸10min。可以扩增出约501bp的片段。Ubiquitin-mNP1-Nos的基因序列的PCR扩增，扩增的引物分别为：Ubi-852-L：5’-GCTCCTTCGCTTTCCCTTCC-3’(SEQ ID NO：11)；Nos-2429-R：5’-GCGCTATATTTTGTTTTCTATCGCG-3’(SEQ ID NO：12)。PCR反应条件为：94℃预变性3min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸2min，30个循环结束后，72℃延伸10min。可以扩增出约1578bp的DNA片段，即Ubiquitin-mNP1-Nos片段。
共对9个藻株进行了检测，检测结果见图9，10。转化藻株1-9，能够扩增出外源NPTII基因，在转化藻株1-4和6-9中能够扩增出外源Ubiquitin-mNP1-Nos片段，在转化藻株1-4和6-9中NPTII和Ubiquitin-mNP1-Nos片段都能够扩增出来。证明NPTII和Ubiquitin-mNP1-Nos片段PCR均为阳性的藻株为转基因藻株，选取这些藻株进行液体扩繁培养，用以进一步检测转基因藻株的mNP1活性。
实施例6.转基因小球藻可溶性蛋白的提取
用E4培养基(培养基成分见表4)培养转基因藻，离心收集对数生长期(浓度约为1×10⁸个/mL)的细胞，约3g湿藻重，然后按湿藻重∶无菌水：＝1∶1进行混合。超声破碎9s，间隔4s，破碎次数90次(JY92-II超声细胞粉碎机，宁波)，沸水煮10min使大分子量蛋白质变性沉淀。4℃过夜后7500g离心10min，取上清液。
表4 培养基组成