复方甘草酸单铵粉针制剂及其制备方法 技术领域：本发明涉及一种复方甘草酸单铵粉针制剂及其制备方法，属于药品的技术领域。
技术背景：甘草酸单铵通过作用于激素受体，影响离子通道，激活或抑制酶活性，调节物质代谢，调节胆碱能神经的兴奋性，具有肾上腺皮质激素样作用而无其副作用，抗炎抗变态反应明显，并有抗病毒、免疫调节、保护膜结构、抗溃疡和解痉作用；针对病毒性肝炎，甘草酸单铵有皮质激素样作用，能提高肝炎病人血清氢化可的松的浓度，降低慢性肝炎患者血清及外周单个核细胞中白介素-6和肿瘤坏死因子，减轻免疫病理反应，促进肝功能恢复，清除症状，缩小肝脾肿大，降酶快，退黄疸显著，且有抗肝纤维化作用，是治疗病毒性肝炎疗效好的药物。对其他疾病亦有良好的治疗作用，例如流行性乙型脑炎、肾病综合征出血热急性肾功能衰竭、银屑病、溶血性贫血、预防吗啡硬膜外术后镇痛并发症、肺结核、溃疡性结肠炎、带状疱疹、过敏性紫癜、再生障碍性贫血等，。目前市场上有水针制剂销售，但是我们发现这种水针制剂在制备过程中需加热灭菌，特别容易造成药物分解破坏，长期贮存易分解变质，影响用药的安全性；而且由于封针抽取注入大输液的中间环节，容易交叉污染。
发明内容：本发明目的在于提供一种疗效显著且质量稳定的复方甘草酸单铵粉针制剂及其制备方法，将其制成无菌分装粉针、冻干粉针可以提高药物的稳定性，避免中间环节，使污染的机率下降，使其更加安全有效并能方便运输；以解决现有技术存在的问题。本发明的技术方案是这样实现的：它用甘草酸单铵，加适量无菌注射用水和适量辅料制备成粉针制剂或者是冻干粉针制剂。准确的说：按照重量配比计算：它由1～3g甘草酸单铵、15～25g甘氨酸、1～2g L-半胱氨酸盐酸盐、1～3g无水亚硫酸钠、0.85％氯化钠溶液适量、1.0mol/L的氢氧化钠溶液适量，加无菌注射用水至1000ml制备成粉针制剂或者是冻干粉针制剂。优选处方为：它用2g甘草酸单铵、20g甘氨酸、1.5g L-半胱氨酸盐酸盐、2g无水亚硫酸钠、0.85％氯化钠溶液适量、1.0mol/L的氢氧化钠溶液适量，加无菌注射用水至1000ml制备成粉针制剂或者是冻干粉针制剂。本发明的制备方法是：取甘草酸单铵，加入为600ml的注射用水，搅拌至完全溶解；加入甘氨酸、L-半胱氨酸盐酸盐、无水亚硫酸钠，搅拌使溶解，加水至1000ml，用1.0mol/L的氢氧化钠溶液调节pH至6.0～7.0；另加入处方量活性炭0.02％(w/v)(经115-120℃活化2h)，置于不锈钢容器中，在80℃保温搅拌吸附30分钟，粗滤，脱炭；用0.45μm和0.22μm组成的复合滤膜过滤至澄明，无菌分装，预冻6小时、干燥30小时，即得。本发明的制备方法还可以是：取甘草酸单铵，加入为600ml的注射用水，搅拌至完全溶解；加入甘氨酸、L-半胱氨酸盐酸盐、无水亚硫酸钠，搅拌使溶解，加水至1000ml，用1.0mol/L的氢氧化钠溶液调节pH至6.0～7.0；另加入处方量活性炭0.02％(w/v)(经115-120℃活化2h)，置于不锈钢容器中，在80℃保温搅拌吸附30分钟，粗滤，脱炭；用0.45μm和0.22μm组成的复合滤膜过滤至澄明，喷雾干燥或在有机溶媒中重结晶，分装，密封即得。。
与现有技术相比：本发明选用无菌分装粉针剂、冻干粉针剂，避免了由于封针抽取注入大输液的中间环节，杜绝了这一用药过程中的交叉污染，使污染地机率下降；而且粉针剂更有利于复方甘草酸单铵的稳定，在制备过程中不加热灭菌，不会造成药物分解破坏，长期贮存不易分解变质，提高了用药的安全性。冷冻干燥工艺的关键是必须确保干燥后的固体物结晶均匀，色泽一致，固体支架基本上保持原来的体积，并有足够的强度，本申请人在研制过程中发现：冷冻时间的选择、冻干前溶液pH值范围、活性炭用量均直接影响本产品的质量；例如活性炭的用量：用量少不能除热原，用量大则主药的损失严重；而常规预冻时间为2～5小时，但是本申请人通过实验发现本产品不能预冻5小时以下；冻干前溶液如果不调pH值所得的产品pH值偏低，刺激性强。本申请人通过大量实验研究发现：预冻6小时，干燥30小时，冻干前溶液pH值为6.0～7.0、活性炭的用量0.02％时所得产品质地疏松，加水后才能迅速溶解恢复到药液原有的特性；含水量低，不易氧化，有利于产品长期贮存；剂量准确，外观优良；稳定性好，安全性高，疗效显著。
本申请人进行了一系列实验，可以证明本发明制剂疗效可靠，制备方法可行：
实验例1抗CCL4肝损伤的实验研究
动物：昆明种小白鼠40只，雌雄兼用，体重(25±10)g，将实验用小鼠分为4组，每组10只。肝损伤小鼠模型的制备：小鼠30只，用0.2％CCL4油溶液腹腔注射，每10g体重用量为0.1mL，每3天1次，连续2次。所有小鼠随机分为3组，每组10只，肝损伤同时分别给予①空白对照组：生理盐水0.02ml(g·d)，灌胃，连续6天。②用药组：用本发明制剂0.02ml(g·d)灌胃，连续6天。③阳性对照组：用联苯双酯0.2mg(g·d)灌胃，连续6天。另取10只小鼠作为正常组，以色拉油0.01ml(g·d)腹腔注射，每3天1次，连续2次，并用生理盐水0.02ml(g·d)灌胃，连续6天。测定方法：给药后第7天，将小白鼠断头取血，采用贝克曼CX9全自动生化分析仪测定血清ALT及AST，同时立即取肝脏称湿重，求出肝指数。，肝脏病理检查：将肝组织用甲醛固定，染色，光镜(400倍放大率)下肉眼观察肝细胞病理学改变。肝损伤程度判断标准用“+”表示轻度肝损伤，肝损伤面积在13以内；用“++”表示中度肝损伤，肝损伤面积在13～23之间；用“+++”表示重度肝损伤，肝损伤面积大于2/3。为便于进行量化分析将“-”计为0分，“+”计为1分，“++”计为2分，“+++”计为3分。
对肝损伤小鼠生化指标的影响
组别 动物数 ALT(IUL) AST(IUL) 肝指数
正常组 10 45.15±10.61 140.05±12.34 45.16±3.23
空白对照组 10 225.34±8.12 326.72±31.47 57.42±5.10
用药组 10 122.14±10.24 233.17±26.28 47.05±6.31
阳性对照组 10 124.56±8.25 220.28±44.61 47.50±5.52
各组小鼠肝组织的病理改变
组别 n 肝细胞变性 肝细胞坏死 汇管区炎症 中央静脉淤血
- + ++ +++ - + ++ +++ - + ++ +++ - + ++ +++
正常组 10 3 5 0 0 6 2 0 0 4 5 0 0 2 5 2 0
空白对照组 10 0 0 2 7 0 0 0 9 0 0 2 8 0 0 3 7
用药组 10 0 3 2 2 2 2 2 3 0 4 6 0 1 3 3 1
阳性对照组 10 1 4 3 1 3 2 3 2 0 4 5 0 2 4 4 0
各组小鼠肝组织的病理改变程度分析
组别 n 肝细胞变性 肝细胞坏死 汇管区炎症 中央静脉淤血
正常组 10 0.6±0.5 0.2±0.4 0.6±0.7 1.0±0.2
空白对照组 10 2.7±0.2 3.1±0.2 2.9±0.4 2.7±0.3
用药组 10 1.5±0.2 1.4±0.8 1.5±0.2 1.3±1.3
阳性对照组 10 1.6±1.2 1.4±1.4 1.6±0.7 1.2±2.4
实验表明，本发明粉针剂制剂疗效好。
实验例2：对流行性乙型脑炎病毒感染小鼠的影响
40只2～3周龄小白鼠15～21g，试验共分4组，每组10只，感染病毒为JEV P3株，病毒感染对照组、正常小鼠对照组、复方甘草酸单铵水针剂对照组、本发明治疗组。实验当日小鼠脑内接种20μL含105JEV的RPMI1640液，正常小鼠不作任何处理。接种病毒后2h，复方甘草酸单铵水针剂对照组、治疗组用药组腹腔内注射10μg，连续治疗3d。对小鼠发病时间的影响：将病毒接种至小鼠开始抽搐之间的时间定为发病时间，腹腔注射不同的药，对发病时间有明显的影响。
组别 鼠数 每日剂量 发病时间(h)
(只) (μg) 最短 最长 平均时间
病毒感染对照组 10 - 65 104 85.4±20.1
正常小鼠对照组 10 - - - -
水针剂对照组 10 5 95 280 158.4±57.6
本发明治疗组 10 5 98 295 160.4±43.2
实验表明，本发明制剂疗效好，不低于复方甘草酸单铵水针剂。
实验例3：对再生障碍性贫血小鼠造血细胞的影响
实验动物：昆明种小鼠40只，雌性，12周龄，体重25～30g；模型制备：参照相关文献给予马利兰腹腔注射复制慢性再障模型，每周一次，共10周；动物分组及给药：随机选取10只小鼠为正常对照组(简称正常组)；其余30只待造模成功后再随机分为3组：再障模型组(简称模型组)、复方甘草酸单铵水针剂对照组(简称对照组)、本发明治疗组。对照组灌服复方甘草酸单铵水针，每日用药剂量为4mg/kg，本发明治疗组灌服本发明制剂，每日用药剂量为4mg/kg，模型组及正常组以等体积蒸馏水灌胃。每日一次，连续20天。对再障模型小鼠骨髓有核细胞(MNC)计数的影响：末次给药后，禁食不禁水12小时，每只小鼠取一侧股骨(右侧)，用0.4mol/L冰醋酸液冲出骨髓细胞并计数，即为一根股骨中的有核细胞数。对再障模型小鼠外周血的影响：给药结束后，禁食不禁水12小时后，尾静脉取血，计数红细胞(RBC)、白细胞(WBC)、血小板(PLT)，测量血红蛋白(Hb)含量，同时涂片经瑞氏染色后，油镜下计数网织红细胞(RET)。
对再障小鼠骨髓有核细胞数的影响
组别 药物 MNC(×107股骨)
正常组 - 2.20±0.45
模型组 - 1.45±0.20
对照组 4mg/kg 1.90±0.75
治疗组 4mg/kg 1.85±0.36
对再障小鼠外周血的影响
组别 WBC(×109L) RBC(×109L) Hb(g/L) PLT(×109L) RET(％)
正常组 14.45±5.60 8.85±0.16 148±13 162.3±21.5 4.08±1.35
模型组 6.13±2.23 6.86±0.71 124±12 92.4±20.6 3.11±1.37
对照组 14.02±3.67 7.56±1.15 135±11 143.0±23.5 3.72±1.08
治疗组 14.13±5.72 7.60±2.34 137±15 144.4±27.0 3.90±1.12
实验表明，本发明制剂疗效好，不低于复方甘草酸单铵水针剂。
实验例4：预冻时间的选择
预冻时间(h) 澄明度 成型性
2 差 欠佳
3 差 欠佳
4 差 欠佳
5 澄明 欠佳
6 澄明 成型
实验表明，预冻时间6小时所得的产品质量好。
实验例5：干燥时间的选择
按照冷冻干燥工艺，先将样品溶液进行预冻处理，时间为3～5小时，在低于共熔点温度下进行干燥，干燥时间约为30小时，为了既能保证干燥质量，又能节约时间，我们对干燥时间分别为25小时、30小时和35小时进行试验，结果如下：
干燥时间(h) 水分％
25 3.10
30 2.55
35 2.60
实验表明，干燥25小时水分含量较高，30小时干燥结果和35小时干燥结果差不多，在生产上为节约时间，我们选择干燥30小时。
实验例6：冻干前溶液pH值范围的筛选
①PH值 4.5 5.0 5.5 6.0 7.0 7.5
外观性状 深黄色 淡黄色 淡黄色 类白色 类白色 类白色
溶解性 澄清 澄清 澄清 澄清 澄清 浑浊
有关物质％ 0.215 0.250 0.260 0.265 0.280 1.02
②冻干原液PH值 粉针PH值
不调 3.5
6.0 6.1
7.0 7.0
实验表明，在pH值在6.0以下是外观性状明显改变而7.0以上有关物质明显增多，冻干前后PH值基本不变，通过上面的试验，确定pH值为6.0～7.0。
实验例7：活性炭用量的选择
①含量测定
不同浓度活性炭对复方甘草酸单铵的吸附
活性炭用量％(W/V) 吸收度 平均 复方甘草酸单铵
含量(％)
第一次 第二次 第三次
0.01 0.391 0.390 0.392 0.391 100.5
0.02 0.365 0.366 0.364 0.365 99.0
0.03 0.330 0.332 0.333 0.332 88.5
实验表明，在配制注射用复方甘草酸单铵过程中，活性炭对甘草酸单铵有较强的吸附作用，并且随着活性炭用量的增加，甘草酸单铵含量逐渐降低。
②澄明度检查：
取各样品各5瓶，分别加入水溶解成0.1g/ml的溶液。
照《卫生部澄明度检查细则和判断标准》依法检查，结果见下表。
不同用量的活性炭对澄明度的影响
活性炭的用量(w/v) 0.01％ 0.02％ 0.03％
不合格瓶数 3 0 0
实验表明，本处方中加入活性炭的用量是0.03％，在澄明度检查时合格，从中可见加入的活性炭用量越小，甘草酸单铵的含量就越高。经试验：确定本处方中所用的活性炭的用量是0.02％(w/v，经115℃-120℃活化2h)，可起到吸附杂质和热原的作用，又可减少对主药的吸附量，从而降低生产成本。
实验例8：影响因素试验
①高温试验：取样品50瓶，于60℃温度下放置10天，于第5天和第10天取样，按稳定性重点考察项目外观色泽、甘草酸单铵含量、有关物质等进行检测，结果见表。
粉针 水针
0天 5天 10天 0天 5天 10天
外观色泽 类白色疏 类白色疏 类白色疏 无色 无色 无色
松块状固体 松块状固体 松块状固体 澄清溶液 澄清溶液 澄清溶液
含量(％) 99.9 99.8 99.5 99.6 99.4 98.7
有关物质％ 0.197 0.330 0.325 0.195 0.354 0.365
②强光照射试验：取样品50瓶，于照度为4500lx±500lx的条件下放置10天，于第5天和第10天取样，按稳定性重点考察项目外观色泽、甘草酸单铵含量、有关物质等进行检测，结果见表。
粉针 水针
0天 5天 10天 0天 5天 10天
外观色泽 类白色疏 类白色疏 类白色疏 无色 无色 无色
松块状固体 松块状固体 松块状固体 澄清溶液 澄清溶液 澄清溶液
含量(％) 100.5 99.8 99.6 99.4 99.0 98.5
有关物质％ 0.190 0.201 0.221 0.196 0.234 0.250
③高湿试验：取样品50瓶，开口置于相对湿度90％+5％的环境下放置10天，于第5天和第10天取样，按稳定性重点考察项目外观色泽、甘草酸单铵含量、有关物质等进行检测，结果见表。
粉针 水针
0天 5天 10天 0天 5天 10天
外观色泽 类白色疏 类白色疏 类白色疏 无色 无色 无色
松块状固体 松块状固体 松块状固体 澄清溶液 澄清溶液 澄清溶液
含量(％) 100.6 99.8 99.6 99.8 99.4 98.7
有关物质％ 0.190 0.321 0.343 0.196 0.356 0.378
实验表明，本发明制剂较水针剂稳定性好，质量稳定。
具体的实施方式：
本发明的实施例1：取甘草酸单铵1g，加入为600ml的注射用水，搅拌至完全溶解；加入甘氨酸15g、L-半胱氨酸盐酸盐1g、无水亚硫酸钠1g，搅拌使溶解，加水至1000ml，用1.0mol/L的氢氧化钠溶液调节pH至6.0～7.0；另加入处方量活性炭0.02％(w/v)(经115-120℃活化2h)，置于不锈钢容器中，在80℃保温搅拌吸附30分钟，粗滤，脱炭；用0.45μm和0.22μm组成的复合滤膜过滤至澄明，无菌分装，预冻6小时、干燥30小时，即得。使用方法：一日二次，每次10ml，肌注。
本发明的实施例2：取甘草酸单铵3g，加入为600ml的注射用水，搅拌至完全溶解；加入甘氨酸25g、L-半胱氨酸盐酸盐2g、无水亚硫酸钠3g，搅拌使溶解，加水至1000ml，用1.0mol/L的氢氧化钠溶液调节pH至6.0～7.0；另加入处方量活性炭0.02％(w/v)(经115-120℃活化2h)，置于不锈钢容器中，在80℃保温搅拌吸附30分钟，粗滤，脱炭；用0.45μm和0.22μm组成的复合滤膜过滤至澄明，无菌分装，预冻6小时、干燥30小时，即得。
本发明的实施例3：取甘草酸单铵2g，加入为600ml的注射用水，搅拌至完全溶解；加入甘氨酸20g、L-半胱氨酸盐酸盐1.5g、无水亚硫酸钠2g，搅拌使溶解，加水至1000ml，用1.0mol/L的氢氧化钠溶液调节pH至6.0～7.0；另加入处方量活性炭0.02％(w/v)(经115-120℃活化2h)，置于不锈钢容器中，在80℃保温搅拌吸附30分钟，粗滤，脱炭；用0.45μm和0.22μm组成的复合滤膜过滤至澄明，喷雾干燥，分装，密封即得。
本发明的实施例4：取甘草酸单铵2g，加入为600ml的注射用水，搅拌至完全溶解；加入甘氨酸20g、L-半胱氨酸盐酸盐1.5g、无水亚硫酸钠2g，搅拌使溶解，加水至1000ml，用1.0mol/L的氢氧化钠溶液调节pH至6.0～7.0；另加入处方量活性炭0.02％(w/v)(经115-120℃活化2h)，置于不锈钢容器中，在80℃保温搅拌吸附30分钟，粗滤，脱炭；用0.45μm和0.22μm组成的复合滤膜过滤至澄明，在有机溶媒中重结晶，分装，密封即得。