用于测量减重过程中脂肪损耗的方法和测试条.pdf

监测处于减重过程中患者脂肪损耗进展的方法，其包括用固体测试条接触所述患者的体液样品，获得所述体液中存在的β－羟丁酸的颜色指示，可选择地，还包括乙酰乙酸和/或丙酮。

1.  检测处于减重过程中患者脂肪损耗进展的方法，其包括用固体测试条接触所述患者的体液样品，获得所述体液中存在的β-羟丁酸的颜色指示，可任选包括乙酰乙酸和/或丙酮。

2.  根据权利要求1的方法，其中所述的体液为选自由尿液、血液、血清和唾液构成的组中的一种。

3.  根据权利要求1或2的方法，其中所述的固体测试条包括：
(a)支撑层；和
(b)位于所述支撑层上的试剂层，所述试剂层包括：
i)β-羟丁酸脱氢酶(β-HBD)，
ii)烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)，
iii)四唑鎓染料前体，和
iv)能转运电子到所述染色前体以引起颜色改变的电子介质。

4.  根据权利要求3的方法，其中所述的β-HBD为不受氯离子抑制的酶。

5.  根据权利要求4的方法，其中所述的β-HBD来源于假单胞菌属或产碱杆菌属。

6.  根据权利要求3的方法，其中所述的电子介质是选自由黄递酶、二甲基吩嗪鎓甲基硫酸盐(PMS)和1-甲氧基-5-甲基二甲基吩嗪鎓甲基硫酸盐(1-甲氧基PMS)构成的组中的一种。

7.  根据权利要求1的方法，其中所述的四唑鎓染料前体是选自包括2-(2’苯并噻唑基)-5-苯乙烯基-3-(4’-邻苯二甲酰肼基)四唑鎓(BSPT)、2’苯并噻唑基-(2)-3，5-二苯基四唑(BTDP)、2，3-二(4-硝基苯)四唑鎓(DNP)、2，5-二苯基-3-(4-苯乙烯基苯基)四唑鎓(DPSP)、二苯乙烯基氮蓝四唑鎓(DS-NBT)、3，3’-[3，3’-二甲氧基-(1，1’-二苯基)-4，4′-二基]-二[2-(4-硝基苯)-5-苯基(2H四唑鎓)(NBT)、3-(4，5-二甲基-2-噻唑基)-2，5-二苯基-2H-四唑鎓(MTT)、2-苯基-3-(4-羧苯基)-5-甲基-四唑鎓(PCPM)、四唑鎓蓝(TB)、硫代氨基甲酰氮蓝四唑鎓(TCNBT)、四氮蓝四唑鎓(TNBT)、四唑鎓紫(TV)、2-苯并噻唑基-3-(4-羧基-2-甲氧基苯基)-5-[4-(2-硫代-乙基氨基甲酰基)苯基]2H-四唑鎓(WST-4)和2，2’-二苯并噻唑基5，5’-二[4，二(2-硫代乙基)氨基甲酰基苯基]-3，3’-(3，3’-二甲氧基-4，4’)-二亚苯基]二四唑鎓及其二钠盐(WST-5)的组中的一种。

8.  根据权利要求6的方法，其中所述的黄递酶为硫辛酸脱氢酶、铁氧化还原蛋白-NADP还原酶或硫辛酰胺脱氢酶。

9.  检测样品中β-羟丁酸和乙酰乙酸的方法，其包括：
b)用含有β-羟丁酸脱氢酶(β-HBD)和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)的组合物在PH低于8.5的条件下接触样品，其中
(iv)β-羟丁酸(β-HB)与NAD反应生成乙酰乙酸和还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)，
(v)在β-HBD存在下，(i)中生成的部分NADH与乙酰乙酸反应生成β-HB，和
(vi)(i)中生成的部分NADH转变成有色物质；并且
c)检测所述有色物质的存在。

10.  根据权利要求9的方法，其中所述样品是患者的体液。

11.  根据权利要求10的方法，其中所述体液选自由尿、血液、血清和唾液构成的组中的一种。

12.  根据权利要求9的方法，其中所述的β-HBD为不受氯离子抑制的酶。

13.  根据权利要求9的方法，其中所述的β-HBD来源于假单胞菌属或产碱杆菌属。

14.  根据权利要求10的方法，其中所述的组合物进一步包括四唑鎓染料前体，以及选自由黄递酶、二甲基吩嗪鎓甲基硫酸盐(PMS)和1-甲氧基-5-甲基二甲基吩嗪鎓甲基硫酸盐(1-甲氧基PMS)构成的组中的电子介质，其中在所述电子介质存在下，所述NADH与四唑鎓染料前体反应生产还原的四唑鎓染料，并转化成有色物质，所述被检测的有色物质就是所述的还原四唑鎓染料。

15.  根据权利要求14的方法，其中所述的四唑鎓染料前体是选自包括2-(2’苯并噻唑基)-5-苯乙烯基-3-(4’-邻苯二甲酰肼基)四唑鎓(BSPT)、2’苯并噻唑基-(2)-3，5-二苯基四唑鎓(BTDP)、2，3-二(4-硝基苯)四唑鎓(DNP)、2，5-二苯基-3-(4-苯乙烯基苯基)四唑鎓(DPSP)、二苯乙烯基氮蓝四唑鎓(DS-NBT)、3，3’-[3，3’-二甲氧基-(1，1’-二苯基)-4，4′-二基]-二[2-(4-硝基苯)-5-苯基(2H四唑鎓)(NBT)、3-(4，5-二甲基-2-噻唑基)-2，5-二苯基-2H-四唑鎓(MTT)、2-苯基-3-(4-羧苯基)-5-甲基-四唑鎓(PCPM)、四唑鎓蓝(TB)、硫代氨基甲酰氮蓝四唑鎓(TCNBT)、四氮蓝四唑鎓(TNBT)、四唑鎓紫(TV)、2-苯并噻唑基-3-(4-羧基-2-甲氧基苯基)-5-[4-(2-硫代-乙基氨基甲酰基)苯基]2H-四唑鎓(WST-4)和2，2’-二苯并噻唑基-5，5’-二[4，二(2-硫代乙基)氨基甲酰基苯基]-3，3’-(3，3’-二甲氧基-4，4’)-二亚苯基]二四唑鎓及其二钠盐(WST-5)的组中的一种。

16.  根据权利要求14的方法，其中所述的黄递酶为硫辛酸脱氢酶、铁氧化还原蛋白-NADP还原酶或硫辛酰胺脱氢酶。

17.  根据权利要求9的方法，其中所述的检测用于监测处于减重过程中患者的脂肪损耗。

18.  根据权利要求9的方法，其中所述的检测用于治疗包括由糖尿病、心血管疾病和癫痫构成的组中的一种疾病。

19.  检测样品中β-羟丁酸和任选的乙酰乙酸的测试条，所述测试条包括：
(c)支撑层；和
(d)位于所述支撑层上的试剂层，所述试剂层包括：
iv)β-羟丁酸脱氢酶(β-HBD)，
v)烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)，
vi)四唑鎓染料前体，和
vii)电子介质。

20.  根据权利要求19的测试条，其中所述的β-HBD为不受氯离子抑制的酶。

21.  根据权利要求19的测试条，其中所述的β-HBD来源于假单胞菌属或产碱杆菌属。

22.  根据权利要求19的方法，其中所述的电子介质是选自包括黄递酶、二甲基吩嗪鎓甲基硫酸盐(PMS)和1-甲氧基-5-甲基二甲基吩嗪鎓甲基硫酸盐(1-甲氧基PMS)的组中的一种。

23.  根据权利要求19的方法，其中所述的四唑鎓染料前体是选自包括2-(2’苯并噻唑基)-5-苯乙烯基-3-(4’-邻苯二甲酰肼基)四唑鎓(BSPT)、2’苯并噻唑基-(2)-3，5-二苯基四唑鎓(BTDP)、2，3-二(4-硝基苯)四唑鎓(DNP)、2，5-二苯基-3-(4-苯乙烯基苯基)四唑鎓(DPSP)、二苯乙烯基氮蓝四唑鎓(DS-NBT)、3，3’-[3，3’-二甲氧基-(1，1’-二苯基)-4，4′-二基]-二[2-(4-硝基苯)-5-苯基(2H四唑鎓)(NBT)、3-(4，5-二甲基-2-噻唑基)-2，5-二苯基-2H-四唑鎓(MTT)、2-苯基-3-(4-羧苯基)-5-甲基-四唑鎓(PCPM)、四唑鎓蓝(TB)、硫代氨基甲酰氮蓝四唑鎓(TCNBT)、四氮蓝四唑鎓(TNBT)、四唑鎓紫(TV)、2-苯并噻唑基-3-(4-羧基-2-甲氧基苯基)-5-[4-(2-硫代-乙基氨基甲酰基)苯基]2H-四唑鎓(WST-4)和2，2’-二苯并噻唑基-5，5’-二[4，二(2-硫代乙基)氨基甲酰基苯基]-3，3’-(3，3’-二甲氧基-4，4’)-二亚苯基]二四唑鎓及其二钠盐(WST-5)的组中的一种。

24.  根据权利要求22的测试条，其中所述的黄递酶为硫辛酸脱氢酶、铁氧化还原蛋白-NADP还原酶或硫辛酰胺脱氢酶。

25.  根据权利要求19的测试条，其中所述试剂层中含有的β-HBD的量为每测试条1单位和更多，其中1单位所述的酶等同于在30℃下以及PH为8.5时氧化1μmol基质所需的量。

26.  根据权利要求19的测试条，其中所述试剂层进一步含有缓冲剂，所述缓冲剂的量能使所述试剂层的pH为8.5或更低。

27.  检测样品中包括β-羟丁酸、乙酰乙酸和丙酮的总酮体的测试条的方法，其包括：
a)用固体测试条接触样品，所述固体测试条包括
i)支撑层；和
ii)位于所述支撑层上的试剂层，所述试剂层包括β-羟丁酸脱氢酶(β-HBD)、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)、和选自黄递酶和重氮盐的检测物，从而β-HB与NAD反应生成乙酰乙酸，所述乙酰乙酸与所述的检测物反应，发生颜色改变；以及
b)检测所述颜色改变的存在。

28.  根据权利要求27的方法，其中所述重氮盐是4-硝基苯重氮四氟硼酸盐。

29.  根据权利要求27的方法，其中所述的样品为患者的体液。

30.  权利要求29的方法，其中所述的体液为选自包括尿液、血液、血清和唾液的组中的一种。

31.  根据权利要求27的方法，其中所述检测用于监测处于减重过程中的患者的脂肪损耗。

32.  根据权利要求27的方法，其中所述检测用于治疗选自由糖尿病、心血管疾病和癫痫构成组中的一种疾病。

33.  检测样品中包括β-羟丁酸、乙酰乙酸和丙酮的总酮体的测试条，其包括：
(a)支撑层；和
(b)位于所述支撑层上的试剂层，所述试剂层包括：
i)β-羟丁酸脱氢酶(β-HBD)，
ii)烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)，
iii)硝普盐或重氮盐。

34.  根据权利要求33的测试条，其中所述β-HBD为不受氯离子抑制的酶。

35.  根据权利要求33的测试条，其中所述β-HBD来源于假单胞菌属或产碱杆菌属。

用于测量减重过程中脂肪损耗的方法和测试条
发明背景
无论是在因为肥胖而以节食和/或大量的锻炼(exercise regiment)开始的减重过程中，还是在为了治疗某些疾病如糖尿病、心血管疾病或癫痫开始的减重过程中，体内的过量脂肪代谢成小的化学单元，称之为酮体，其包含三种组分：β-羟丁酸、乙酰乙酸和丙酮。
本发明涉及用于检测生化标记物即酮体的方法，所述酮体即(a)由三种组分也就是β-羟丁酸、乙酰乙酸和丙酮组成的总酮体；(b)β-羟丁酸与乙酰乙酸或(c)单独的β-羟丁酸。本发明尤其涉及便于家庭使用的检测减重过程中的脂防损耗。本发明包括用于固相或干式化学测试的一次性的、方便的测试条结构，用于测试总酮体，所有三种组分即β-羟丁酸、乙酰乙酸和丙酮。另外，本发明涉及一步就可测试β-羟丁酸和乙酰乙酸的一次性测试条，和可单独测试β-羟丁酸的测试条，当将其浸入尿液中时，产生阳性信号，比如指示减重过程中脂肪损耗的颜色。测试条上的颜色强度用于指示样品中存在的分析物的相对浓度，从而与脂肪的相对损耗有关。上述非侵入性工具对于需要减重的人来说，其用作心理激励是非常有用的。
目前有数以百万计的肥胖者，他们采取了多种类型的节食方法，例如Weight-watcher_，Jenny-Craig，Nutri System，Atkins diet，The New Beverly Hill Diet，Liquid diet，the Pritikin principle diet。然而，大多数节食的人在很短的时期内又会恢复其所有减少的体重。仅仅在美国，估计有超过60％的人属于肥胖。肥胖是导致多种严重疾病如糖尿病、高胆固醇血症地主要病因，最终导致肾衰和肝脏衰竭。
增强正在减重的人们所作的努力，同时保持其理想体重。
众所周知，当体内脂肪也就是作为体内脂肪主要组分的脂肪酸被降解时，它最终降解成以酮体形式存在的小分子。酮体由三种化学物质组成：β-羟丁酸、乙酰乙酸和丙酮。β-羟丁酸是主要的酮体，其构成大约75-80％的总酮体，乙酰乙酸构成大约20-25％的总酮体，而丙酮仅仅以微量(不足2％)存在。由于丙酮的低浓度和其不稳定性，很少检测其本身。相反，在碱性条件下通过硝普盐反应来检测乙酰乙酸和丙酮。一些专利公开了采用硝普盐反应来检测乙酰乙酸的方法和装置，比如Mast的美国专利3,212,855；Magers和Tabb的美国专利4,147,514；Tabb和Burrows的美国专利4,440,724。市场销售乙酰乙酸测试条已经有很多年，(Bayers diagnostics，Roche diagnostics)，其用于检测尿液中的乙酰乙酸和丙酮。它们产生紫色，颜色的深度接近尿液中或血清中的乙酰乙酸的浓度。通常患有糖尿病的患者使用这些测试条(尤其是I型糖尿病患者)。这些测试条被错误地称为“酮或酮体的测试”，但是，所述测试条仅仅测量酮体的少量组分，即占总酮体不足20-25％的乙酰乙酸和丙酮，所述测试条并不测量酮体的主要组分，也就是β-羟丁酸。尽管这些测试条对β-羟丁酸不灵敏，上述测试条还是被成功的用于一些饮食方案中，如含有高脂肪和低碳水化合物的Atkins’饮食。
类似地，Fritz的美国专利#5,260,219中教导了测试条在节食计划中检测乙酰乙酸的应用。令人惊奇的是，本发明发现当浸入那些摄入1000-1500热卡/天“平衡”饮食而不是含有高脂肪和低碳水化合物含量的Atkins’饮食的个体的尿中时，这些测量乙酰乙酸/丙酮测试条在大多数情况下是不灵敏的，因此，在减重过程中的通常或常规应用中上述测试条作为生化标记物是无效的。相反地，本发明是基于这样一个发现，即测量(a)单独的β-羟丁酸(其是乙酰乙酸浓度的3-4倍左右)或(b)β-羟丁酸和乙酰乙酸或(c)总酮体即所有三种组分的测试条是非常灵敏的，其能够检测尿中和其它生物液体中甚至很少量的上述化学物质。这样灵敏的测试条在任何减重过程中都可成功地应用，产生的颜色能够反映出液体中存在的这些化学物质。
本发明的简要描述
因此，本发明的一个目的是提供一种方便、灵敏的固相方法，通过非侵入性样品如尿，检测生物样品中的(a)总酮体，也就是所有的三种组分：β-羟丁酸、乙酰乙酸和丙酮；(b)一步检测β-羟丁酸与乙酰乙酸；(c)单独的β-羟丁酸，其产生的颜色可被用于检测减重过程中人体内脂肪(或脂肪酸)的降解。
本发明的另一个目的是提供一种方便、灵敏的固相或干式化学装置，通过非侵入性样品如尿，检测生物样品中(a)总酮体，也就是所有的三种组分：β-羟丁酸、乙酰乙酸和丙酮；(b)在一个步骤中的β-羟丁酸与乙酰乙酸；(c)单独的β-羟丁酸，其产生的颜色可用于检测减重过程中人体内脂肪(或脂肪酸)的降解。
本发明的另一个目的是提供测试条，用于检测减重过程中以及每天摄入1000-1500热卡或更少的低卡路里饮食的人体内的脂肪(或脂肪酸)降解。当将这些测试条浸入晨尿中显示阳性颜色，而市售的用于检测酮的测试条仅仅能检测乙酰乙酸和丙酮，是不灵敏的。因而，本发明首次提供一种可作为处于减重过程中的人的心理激励的生化标记物。
检测处于减重过程中的患者脂肪损耗进展的方法包括，用固体测试条接触所述患者的体液样品，获得所述体液中存在的β-羟丁酸的颜色指示，可选择地，还有乙酰乙酸和/或丙酮。
检测样品中β-羟丁酸和乙酰乙酸的方法，包括：
a)用PH低于8.5的含有β-羟丁酸脱氢酶(β-HBD)和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)的组合物接触样品，其中
(i)β-羟丁酸(β-HB)与NAD反应，生成乙酰乙酸和还原的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)，
(ii)在β-HBD存在下，部分(i)中生成的NADH与乙酰乙酸反应生成β-HB，和
(iii)部分(i)中生成的NADH转变成有色物质；并且
检测存在的所述有色物质。
检测样品中的β-羟丁酸、乙酰乙酸和丙酮的测试条，其包括：
a)支撑层；和
b)位于所述支撑层上的试剂层，所述试剂层包括：
i)β-羟丁酸脱氢酶(β-HBD)，
ii)烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)，
iii)四唑鎓染料前体，和
电子介质(electron mediator)。
本发明的详细描述
为了用于减重过程，本文阐述了灵敏、方便的方法，具体地，一种方法是(a)同时检测总酮体，即全部三种组分：β-羟丁酸、乙酰乙酸和丙酮；(b)同时检测β-羟丁酸和乙酰乙酸；和(c)仅仅检测主要酮体，即β-羟丁酸，这些酮体存在于生物液体包括尿液、血液/血清、唾液中。另外，本发明描述了用于测量以下的固相装置，例如测试条，(a)同时险测总酮体，即所有三种组分：β-羟丁酸、乙酰乙酸和丙酮；(b)同时检测β-羟丁酸和乙酰乙酸；(c)仅仅检测β-羟丁酸。这些测试条可经常作为非侵入性器具和生化标记物，用于确定在各种减重过程中脂肪被真正地代谢。这些测试条的每一个都是非常灵敏的，也就是说，当经常或每天早晨浸入尿中时，如果当天有一定量的脂肪被代谢，测试条将会显示阳性颜色，从而对于进行任意减重过程的人来说，上述测试条可作为一种心理激励和工具。
目前没有一种干式化学方法或固相装置用于检测总酮体(TKB)。本发明首次提供了一种新的、方便的方法，以及一种固相或干式化学形式的浸渍测试条，所述测试条可供患者现场使用，尤其是在减重过程中。该方法和装置利用β-羟丁酸脱氢酶将β-羟丁酸转化成乙酰乙酸，同时采用已知的比色法检测上述反应生成的乙酰乙酸、内源性乙酰乙酸和丙酮。
Smith等的美国专利5,801,059中公开了在自动化分析仪器中测量TKB的过程，其中没有采用浸渍测试条。然而，由于这种方法需要昂贵的自动化分析仪器和专业的人员来执行该测试，它不适于并且也不能由患者在家中使用。
Kojima等的美国专利5,618,686中公开了一种检测被错误的称为总酮体(TKB)的β-羟丁酸和乙酰乙酸的方法。该方法分为两个步骤。在第一步骤中，借助β-羟丁酸脱氢酶(HBD)和NADH(还原的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)，样品中的乙酰乙酸转化为β-羟丁酸，在第二步骤中检测两个来源的β-羟丁酸，即最初存在于样品中的β-羟丁酸和在第一步骤中借助β-羟丁酸脱氢酶和NAD由乙酰乙酸转化得到的β-羟丁酸。然而，该方法存在以下问题，(a)它仅能与自动化分析仪一起使用，并且由于两个步骤所需要的pH值不同，因此两个步骤不能合并，从而该方法不能用作简便的一步法来操作，和(b)该方法在340nm波长处检测NADH，不能产生颜色。
类似地，Ueda等的美国专利5,633,143中公开了另一种检测β-羟丁酸和乙酰乙酸的方法，其也包括两个步骤。在这种情况下，第一步骤中乙酰乙酸首先被转化成β-羟丁酸，然后采用β-羟丁酸脱氢酶和一种NAD的硫衍生物(硫代烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)检测β-羟丁酸，其能在400nm波长处检测。尽管该方法是灵敏的，可是它具有以下缺点，(a)NADH和硫代NAD是不相容(Compitible)的，在一步法或装置中不能混合在一起作为一个试剂，(b)由于硫代NAD不是天然的辅酶，且具有很高的Km，其很难作为β-羟丁酸脱氢酶的辅酶，因此需要非常高浓度的β-羟丁酸脱氢酶，从而很不经济，而且(c)在400nm出现的黄色很难凭视力辨别，容易受到溶血和存在的胆红素的干扰。
上述的两步法尽管需要两个独立的步骤，但是可用于液体检测，并且适合于大的临床分析仪器，然而它不能发展成方便的只需要一步工序的固相装置或干式化学方法或装置。
在本发明中，我们惊奇地发现，如果下述的反应1A可在pH低于8.5下进行，例如pH8.0，或7.75或7.5，反应1B比反应1A慢，其中反应1A是在NAD(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)存在下将β-羟丁酸转化成乙酰乙酸和NADH(还原的NAD)，反应1B是在黄递酶的存在下用四唑鎓盐转化NADH。结果，部分并没有被黄递酶和四唑鎓盐转化显色的NADH可用于下述反应(2)中，用于检测同样存在于样品中的乙酰乙酸，如下所示。
反应1：


反应2：

用这种方法，该测试不仅可以检测样品中的β-羟丁酸，也可以在一步工序中同时检测样品中的乙酰乙酸(即内源性的)。此外，在本反应图表中，它是反应1和2之间的循环反应，这样可长时间的持续产生颜色，从而灵敏度成倍地增加。

此处的“循环”工艺由于持续长时间的显色，其出人意料地得到一种非常灵敏的检测样品中β-羟丁酸和乙酰乙酸的方法。此外，该方法产生紫色和不同色度的紫色，其反映出样品中β-羟丁酸和乙酰乙酸的相对浓度，并且很容易用视力辨别。也可以采用起其它已知的方法检测NADH，比如电化学传感器，但是产生可见颜色的方法易于供患者家庭使用。
尽管很长时间以来，人们就知道采用酶β-羟丁酸脱氢酶(HBD)在NAD存在的条件下检测生物液体中β-羟丁酸的方法，上述NAD产生可在340nm波长的UV区域测量的NADH，从而测定β-羟丁酸(参见：Williamson等，1962，“Enzymatic Determination of D(-)-beta-Hydroxybutyric Acid and acetoacetate acidin Blood”，Biochem.j.，82：90-96)，但是，目前还没有一种简易的比色法来检测β-羟丁酸(参见Harano等，1984，“Development of Paper-Strip Test for3-hydroxybutyrate and its Clinical Application”，Diabetic Care，7，P.481-485；Harano等，1990，“Development of Stable Film Test for Rapid Estimation of Blood or Plasma3-hydroxybutyrate”，Diabetic care，13：522-524；和Ketosite_测试，购自GDSTechnology，Inc，Elkhart，IN46514，日期12/19/93，产品内插件(product insert)(参见Tietz Text book of Clinical Chemistry，第3版，Burtis和Ashwood编，1999，p786-787)。在这些方法中，β-羟丁酸脱氢酶和NAD与β-羟丁酸反应，反应生成NADH，在过量黄递酶存在下，NADH与四唑鎓盐(比如NBT，即氮蓝四唑鎓)反应，检测NADH，产生的颜色与其在血液中的浓度成比例。在这些系统中，必须使反应的PH高于8.5，从而使反应从左到右进行，并使反应的PH为7.0或更低，使反应从右到左进行，如下图所示：
反应1：


这些测试用于糖尿病患者由于严重的胰岛素缺乏所引起的严重酮酸中毒，这些患者的血液中产生β-羟丁酸。令人惊奇的是，本发明人发现β-羟丁酸测试条或测试卡也可供摄入低卡路里饮食的人体使用，其中将血液作为样品。所产生的颜色的强度反映了血液中β-羟丁酸的水平。然而，作为一种侵入性方法，血液的使用对摄入低卡路里饮食的普通人来说是不可行的。如果β-羟丁酸测试条能够用于尿液的检测，相对于血液检测而言，显然它将更加有用，这是因为尿样是非侵入性的，而且可以很方便地供任何人在任何时间使用。同时还可以使用其它非侵入性的液体，如唾液或汗，例如乙醇的检测。然而，本发明人令人惊奇的发现，上述购自GDS技术有限公司(GDS Technology inc)的用于检测β-羟丁酸的测试卡不能用于尿液，其有两个原因，(a)反应是在PH高于8.5的条件下进行的，从而存在于尿中(也可以是血液)的其本身可以还原四唑鎓盐的其它组分例如sulfahydryl药物产生假阳性结果，以及(b)通常应用于测试条的β-羟丁酸脱氢酶(HBD)可被大量存在于尿中的盐酸盐抑制，因而该测试条不能用于检测尿中的β-羟丁酸，从而存在选择样品的问题。本发明中，令人惊奇的发现，有可能克服这些困难并研究出一种采用大量β-羟丁酸脱氢酶(如超过常规需要剂量的10到20倍)或β-羟丁酸脱氢酶来检测尿中的β-羟丁酸的测试条，该测试条并不受氯离子抑制。在8.5或较小的PH下进行反应可克服尿液中存在的其它物质如sulfahydryl药物的干扰。
因此，本发明研究的用于检测通常比乙酰乙酸高3-4倍的β-羟丁酸的测试条能成功地对摄入低卡路里饮食的人体或患有糖尿病的患者的尿进行检测。所以，本发明的用于β-羟丁酸的测试条比市售的用于酮测量的测试条要灵敏的多，所述市售测试条仅仅测量少量组分，即乙酰乙酸和丙酮。
其它的用于检测β-羟丁酸的比色法采用混合于载体基质中的ELLman’s试剂、β-羟丁酸脱氢酶、硫辛酰胺脱氢酶，D，L-硫辛酰胺脱氢酶和NAD检测β-羟丁酸(Magers的美国专利5,190,863，，Magers的美国专利5,326,697，Magers的美国专利5,510,245)。这些方法需要一些复杂的系统，对于通常应用来说不具备成本效益，并且对于减重过程没有显示出潜在的应用。这些方法中产生的信号通常是一种颜色。以电流的改变检测NADH的电化学传感器可购自Aboott(Medisense)，Abbott Park，Chicago，III，其用于糖尿病患者的酮症酸中毒的检测。近来，人们尝试将这种装置采用全血用于减重过程中(Byrne等，2000，Diabetes care，23，500-503)。然而，这样的装置不能显色，也不能基于仪器，因此，不便于家庭使用，尤其不能用于减重过程。另外，如前所述，非侵入性样品将是优选的样品，当尿液作为样品时，上面的电化学装置是不起作用的。
因而，除了本发明之外，目前没有一种灵敏的、易于使用的检测颜色的固相装置用于测量减重过程中的脂肪损耗。令人惊奇的是，经发现，依照本发明的测试条——即检测TKB的测试条，检测β-羟丁酸和乙酰乙酸的测试条和仅仅检测β-羟丁酸的测试条是非常灵敏的，显示阳性颜色。当人们摄入1000-1500热卡平衡饮食时，将上述测试条浸入每天的尿中，它们能检测微量或少量的脂肪代谢中的酮体，而市场上供应的检测乙酰乙酸的测试条是阴性的。
实施例1：用于一步检测总酮体也就是所有三种组分(β-羟丁酸、乙酰乙酸和丙酮)的方法和测试装置。
作为例子，该制剂含有β-羟丁酸脱氢酶(HBD)和NAD，在pH8.0下将β-羟丁酸转化成乙酰乙酸，并且“转化的乙酰乙酸“和内源性乙酰乙酸及丙酮采用硝普盐反应来检测：


(转化的+内源性的)
该制剂包括
Tris-缓冲液，pH8.0             1M
β-羟丁酸脱氢酶                100U/ml
NAD                            3％
硝普钠                         5％
七水合硫酸镁                   30％
将滤纸如Whatman-54浸入到上述制剂中，然后在烘箱中于45℃干燥20分钟。用双面胶将”的上述纸粘合至12”长且3”高的聚苯乙烯卡的底部从而得到所述测试条。所述卡被纵向切成48条”×3”高的测试条。用于检测总酮体的测试条检测生物液体。这些测试条被称之为“TKB”。实施例6中显示了在减重过程中TKB的应用。
代替硝普盐，乙酰乙酸也能采用公知的重氮盐检测，其在645nm波长处产生颜色。
实施例2：以循环形式同时检测β-羟丁酸和乙酰乙酸的方法和装置制剂中含有pH为8.0的β-羟丁酸脱氢酶、NAD、NBT和黄递酶。
Tris-盐酸，pH8.0          0.1M
β-羟丁酸脱氢酶           200U/ml
NAD                       3％
NBT                       0.2％
黄递酶                    10U/ml
盐酸镁                    0.1％
surfonyl                  0.06％
将滤纸如Whatman-54浸入到上述制剂中，然后在烘箱中于45℃干燥20分钟。用双面胶将”的上述纸粘合至12”长且3”高的聚苯乙烯卡的底部从而得到所述测试条。所述卡被纵向切成48条”×3”高的测试条。测试条用于检测生物液体。这些同时检测β-羟丁酸和乙酰乙酸的测试条被称之为“HB&AA”，它在减重过程中的应用参见实施例6。
实施例3：单独检测从减重过程获得的样品的血清(血液)中的β-羟丁酸的方法和装置，其采用正常浓度的HBD，与市售的GDSTechnology Inc.公司的Ketosite_似。
该制剂含有pH为8.6的正常水平的β-羟丁酸脱氢酶(2-5U/ml)、NAD、NBT和黄递酶。
β-羟丁酸脱氢酶        15U/ml-2U每测试条
(假单胞菌属)
NAD                    3％
NBT                    0.2％
黄递酶                 30U/ml
盐酸镁                 0.1％
surfonyl                0.05％
Tris-盐酸，pH8.6        0.1M
将滤纸如Whatman-54浸入到上述制剂中，然后在烘箱中于45℃干燥20分钟。用双面胶将”的上述纸粘合至12”长且3”高的聚苯乙烯卡的底部从而得到所述测试条。所述卡被纵向切成48条”×3”高的测试条。测试条用于检测生物液体。这些用正常浓度的β-羟丁酸脱氢酶来只检测的β-羟丁酸的测试条被称之为“HB-L”。
如表1所示，我们惊奇地发现HB-L测试条和Ketosite均可以对来自进行减重过程的人体的样品进行一分钟测试，检测血清(血液)中的β-羟丁酸。紫色的相对亮度以“+”号表示，没有颜色以“-”号表示。
表1