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1、10申请公布号CN104152463A43申请公布日20141119CN104152463A21申请号201410374611222申请日20140731C12N15/29200601C07K14/415200601C12N15/84200601A01H5/0020060171申请人上海交通大学地址200240上海市闵行区东川路800号72发明人唐克轩张芳源74专利代理机构上海汉声知识产权代理有限公司31236代理人牛山陈少凌54发明名称青蒿AAMYBL1蛋白编码序列及其应用57摘要本发明涉及一种基因工程技术领域的青蒿AAMYBL1蛋白编码序列及其应用。所述青蒿MYBLIKE类转录因子编码序列。
2、AAMYBL1，所述编码序列编码的氨基酸序列如SEQIDNO4所示。本发明的编码R3MYB类转录因子AAMYBL1，参与调控青蒿腺毛的密度；利用转基因技术将青蒿AAMYBL1转录因子干扰载体转化青蒿可以有效调控青蒿表皮的腺毛密度，从而提高青蒿素的含量。在非转基因普通青蒿的叶片表皮腺毛密度为24个每平方毫米，抑制AAMYBL1基因表达的转基因青蒿的叶片腺毛密度提高到34个每平方毫米。而每片叶片总腺毛数量从61947个提高到93683个。与之对应的青蒿素含量从非转基因青蒿的8MG/GDW提高到12MG/GDW，该发明对于为青蒿素的规模化生产提供高产、稳定新药源具有重要意义。51INTCL权利要求书。
3、1页说明书6页序列表2页附图2页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书6页序列表2页附图2页10申请公布号CN104152463ACN104152463A1/1页21一种青蒿MYBLIKE类转录因子编码序列AAMYBL1，其特征是，所述编码序列编码的氨基酸序列如SEQIDNO4所示。2如权利要求1所述的青蒿MYBLIKE类转录因子编码序列AAMYBL1，其特征是，所述编码序列的核苷酸序列如SEQIDNO3所示。3一种多肽，其特征在于，所述多肽的氨基酸序列如SEQIDNO4所示。4一种如权利要求1所述的青蒿MYBLIKE类转录因子编码序列AAMYBL1在提高青蒿素含。
4、量中的应用，所述编码序列通过提高青蒿腺毛密度而提高青蒿素含量。5如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述应用包括如下步骤步骤一，将青蒿MYBLIKE类转录因子编码序列AAMYBL1连于植物表达调控序列上，构建含青蒿MYBLIKE类转录因子编码序列的植物表达载体；步骤二，将步骤一中的表达载体转入农杆菌，将农杆菌转入青蒿；步骤三，通过抗生素筛选，获得含有青蒿青蒿MYBLIKE类转录因子编码序列AAMYBL1的转化细胞，再生转基因植株，所述转基因植株的青蒿素含量得到提高。6根据权利要求5所述的应用，其特征是，步骤二中，所述转入具体为采用冻融法进行转入。7一种提高青蒿中青蒿素含量的方法，其特征在于，包。
5、括如下步骤1对两个青蒿栽培种MYB类转录因子分析，从青蒿CDNA文库中克隆到青蒿R3MYB类转录因子AAMYBL1；2把AAMYBL1基因可操作性地连接于表达调控序列，形成含AAMYBL1基因的植物RNA干扰载体；3将含AAMYBL1基因的植物干扰表达载体转化根癌农杆菌EH105，获得具有该干扰表达载体的根癌农杆菌菌株；4利用所构建的根癌农杆菌菌株转化青蒿，经卡那霉素筛选得到抗性苗，再经PCR检测为阳性的植株即为转基因青蒿苗；5对获得的转基因青蒿进行腺毛密度通过，获得腺毛密度显著提高的转基因青蒿，进而获得青蒿素含量提高的青蒿植株。8如权利要求7所述的提高青蒿中青蒿素含量的方法，其特征在于，步骤。
6、4中，所述的经PCR检测的转基因青蒿植株是指，分别设计合成AAMYBL1基因的检测引物，进行DNA扩增，紫外线下观察到目的条带的阳性株系即为转基因青蒿植株，所述的腺毛密度检测是指在荧光显微镜下，青蒿分泌型腺毛在特定波长下显示明亮荧光，经拍照后再统计其数量和密度。权利要求书CN104152463A1/6页3青蒿AAMYBL1蛋白编码序列及其应用技术领域0001本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种青蒿AAMYBL1蛋白编码序列及其应用。背景技术0002植物新陈代谢分为初生代谢和次生代谢，初生代谢产物如糖类、脂类和核酸存在于所有植物中，是维持细胞生命活动所必需的，而植物次生代谢产物是指植物中一大。
7、类并非植物生长发育所必需的小分子有机化合物，其产生和分布具有种属、组织器官和生长发育特异性。大多数植物叶片表面并不是光滑的，而是具有许多类型的毛状结构。根据其功能和形态分为两大类一类是不具有分泌功能的纤毛；另一类是具有分泌功能的腺毛。前一类的主要代表是棉花的棉纤维，它是棉花种子表皮特化的单细胞纤毛。而分泌型腺毛是植物表皮细胞特化出的一种多细胞结构，近年来对腺毛的研究发现，许多有价值的次生代谢产物都是在这一结构中特异性合成和储存。比如以薄荷精油，玫瑰精油为代表的一大类天然香精香料；以青蒿素为代表的中草药有效成分；以啤酒花为代表的天然植物添加剂。0003在天然植株中产生的次生代谢产物含量极低，而使。
8、用化学合成的方法，工艺流程复杂、成本高，并且很多次生代谢产物添加到食品化妆品行业，使用天然的植物材料更加安全。因此，研究人员开始探索其他的提高植物次生代谢产物含量的方法，在诸多方法之中，提高腺毛密度被认为是一种直接有效的方法。在腺毛中特异性合成的次生代谢产物有个共同的特点，即参与这些次生代谢产物合成的关键酶基因只在腺毛中特异表达。因此，利用基因工程的方法调控腺毛密度是颇具应用价值的植物遗传操作手段。0004近年来，在非分泌型的单细胞腺毛发育调控中，研究人员已经取得了很多成果。比如，在模式植物拟南芥中，单细胞纤毛的发育调控机制已经基本清楚。在有重要经济价值的棉花中，单细胞纤毛棉纤维的发育调控机制。
9、也取得了很多的研究成果。而在次生代谢领域，关于分泌型腺毛的报道还比较少。特别是在传统中草药青蒿的研究中，研究主要集中在对合成关键酶基因的转录调控方面，还没有调控腺毛密度的报道。0005如果通过对青蒿栽培种的品种分析，转录因子的表达分析等技术，从青蒿中克隆出可以调控青蒿腺毛密度的基因，那么就可以使用基因工程手段提高青蒿叶片表皮腺毛密度，从而提高重要次生代谢产物青蒿素的含量。通过对两个地区青蒿栽培种的品种分析，从青蒿中克隆了一个R3MYB类转录因子，采用基因工程手段，将该转录因子干扰载体转化青蒿，可以显著提高青蒿腺毛密度，从而提高青蒿中的次生代谢物质青蒿素的含量。为提高青蒿素含量提供了一种新的策略。
10、和靶标基因。为进一步研究青蒿腺毛发育提供了理论基础。发明内容0006本发明的目的在于克服现有技术中的不足,提供一种青蒿AAMYBL1蛋白编码序列，该基因编码R3MYB类转录因子AAMYBL1，它参与调控青蒿腺毛的密度；利用转基因技术将青蒿AAMYBL1转录因子干扰载体转化青蒿可以有效调控青蒿表皮的腺毛密度，从而说明书CN104152463A2/6页4提高青蒿素的含量。在非转基因普通青蒿的叶片表皮腺毛密度为24个每平方毫米，抑制AAMYBL1基因表达的转基因青蒿的叶片腺毛密度提高到34个每平方毫米。而每片叶片总腺毛数量从61947个提高到93683个图1。与之对应的青蒿素含量从非转基因青蒿的8M。
11、G/GDW提高到12MG/GDW图2，该发明对于为青蒿素的规模化生产提供高产、稳定新药源具有重要意义。0007本发明是通过以下的技术方案实现的，0008第一方面，本发明涉及一种青蒿MYBLIKE类转录因子编码序列AAMYBL1，所述编码序列编码的氨基酸序列如SEQIDNO4所示。0009优选地，所述编码序列的核苷酸序列如SEQIDNO3所示。0010第二方面，本发明涉及一种多肽，所述多肽的氨基酸序列如SEQIDNO4所示。0011第三方面，本发明涉及一种前述的青蒿MYBLIKE类转录因子编码序列AAMYBL1在提高青蒿素含量中的应用，所述编码序列通过提高青蒿腺毛密度而提高青蒿素含量。0012优。
12、选地，所述应用包括如下步骤0013步骤一，将青蒿MYBLIKE类转录因子编码序列AAMYBL1连于植物表达调控序列上，构建含青蒿MYBLIKE类转录因子编码序列的植物表达载体；0014步骤二，将步骤一中的表达载体转入农杆菌，将农杆菌转入青蒿；0015步骤三，通过抗生素筛选，获得含有青蒿青蒿MYBLIKE类转录因子编码序列AAMYBL1的转化细胞，再生转基因植株，所述转基因植株的青蒿素含量得到提高。0016优选地，步骤二中，所述转入具体为采用冻融法进行转入。0017第四方面，本发明涉及一种提高青蒿中青蒿素含量的方法，包括如下步骤00181对两个青蒿栽培种MYB类转录因子分析，从青蒿CDNA文库中。
13、克隆到青蒿R3MYB类转录因子AAMYBL1；00192把AAMYBL1基因可操作性地连接于表达调控序列，形成含AAMYBL1基因的植物RNA干扰载体；00203将含AAMYBL1基因的植物干扰表达载体转化根癌农杆菌EH105，获得具有该干扰表达载体的根癌农杆菌菌株；00214利用所构建的根癌农杆菌菌株转化青蒿，经卡那霉素筛选得到抗性苗，再经PCR检测为阳性的植株即为转基因青蒿苗；00225对获得的转基因青蒿进行腺毛密度通过，获得腺毛密度显著提高的转基因青蒿，进而获得青蒿素含量提高的青蒿植株。0023优选地，步骤4中，所述的经PCR检测的转基因青蒿植株是指，分别设计合成AAMYBL1基因的检测。
14、引物，进行DNA扩增，紫外线下观察到目的条带的阳性株系即为转基因青蒿植株，所述的腺毛密度检测是指在荧光显微镜下，青蒿分泌型腺毛在特定波长下显示明亮荧光，经拍照后再统计其数量和密度。0024其中，对获得的转基因青蒿中青蒿素含量进行HPLCELSD测定。0025本发明通过对两个青蒿品种分析，从青蒿中克隆AAMYBL1基因，构建含AAMYBL1基因的植物干扰表达载体，用根癌农杆菌EH105介导，采用叶盘法将AAMYBL1基因干扰表达载体转化青蒿；PCR检测外源目的基因AAMYBL1的整合情况，通过荧光显微镜观察和统计腺毛密度，获得了腺毛密度显著提高的转基因青蒿；高效液相色谱蒸发光散射检测器说明书CN。
15、104152463A3/6页5HPLCELSD测定青蒿中青蒿素含量，表明获得的青蒿表皮腺毛密度显著提高的转基因青蒿中的青蒿素含量也显著提高。0026在本发明中，可选用本领域已知的各种载体，如市售的载体，包括质粒，粘粒等。在生产本发明的青蒿AAMYBL1蛋白多肽时，可以将青蒿AAMYBL1蛋白编码序列可操作地连于表达调控序列，从而形成青蒿AAMYBL1蛋白表达载体。0027如本文所用，“可操作地连于”指这样一种状况，即线性DNA序列的某些部分能够影响同一线性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信号肽DNA作为前体表达并参与多肽的分泌，那么信号肽分泌前导序列DNA就是可操作地连于多肽DNA；如果启。
16、动子控制序列的转录，那么它是可操作地连于编码序列；如果核糖体结合位点被置于能使其翻译的位置时，那么它是可操作地连于编码序列。一般，“可操作地连于”意味着相邻，而对于分泌前导序列则意味着在阅读框中相邻。0028本发明中所涉及的农杆菌为根癌农杆菌AGROBACTERIUMTUMEFACIENS菌株EH105，该菌株可以从市场上公开购买来源于澳大利亚CAMBIA公司，菌株编号为GAMBAR1。附图说明0029通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显0030图1在青蒿中抑制AAMYBL1的表达提高了腺毛密度。0031图2在青蒿中抑制AAMYBL1的。
17、表达提高了青蒿素和二氢青蒿酸含量。具体实施方式0032下面对本发明的实施例作详细说明本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如SAMBROOK等分子克隆实验室手册NEWYORKCOLDSPRINGHARBORLABORATORYPRESS,1989中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。0033实施例1、青蒿AAMYBL1基因的克隆00341青蒿基因组总RNA的提取0035取青蒿叶片组织，置于液氮中研碎，加入盛有裂解液的15MLEPPENDORFEP离心管。
18、中，充分振荡后，按照TIANGEN试剂盒的说明书抽提总RNA。用甲醛变性胶电泳鉴定总RNA质量，然后在分光光度计上测定RNA含量。00362青蒿AAMYBL1基因的克隆0037以所提取的总RNA为模板，在POWERSCRIPT反转录酶的作用下合成CDNA；根据AAMYBL1基因的序列设计基因特异性引物SEQIDNO1和SEQIDNO2，通过PCR从总CDNA中扩增AAMYBL1基因，并测序。0038通过上述步骤，获得了青蒿中该转录因子的全长编码序列SEQIDNO3并推导出其蛋白编码序列SEQIDNO4，其中，起始密码子为ATG，终止密码子为TGA。0039实施例2、含AAMYBL1基因的植物双。
19、元干扰表达载体的构建说明书CN104152463A4/6页600401中间载体PENTYAAMYBL1的构建0041在AAMYBL1基因的非保守区域设计上游引物和下游引物，用以构建干扰载体。在上游引物ATG碱基前添加CACC四个碱基以构建GATEWAY入门载体。按照INVITROGEN公司PENTRTM/DCLONINGKIT的操作步骤，先用平端酶扩增得到AAMYBL1的片段，回收纯化后通过GATEWAY克隆技术连接到PENTR/DTOPO载体。00422植物表达干扰载体PHELLSGATEAAMYBL1I的构建0043按照INVITROGEN公司的LRIIENZYME试剂盒的操作，将PENT。
20、RAAMYBL1载体中的AAMYBL1的干扰片段重组到RNA干扰载体PHELLSGATE的两个可以形成发夹结构的重组位点中，得到AAMYBL1的RNA干扰载体PHELLSGATEAAMYBL1I。0044本实施例将青蒿AAMYBL1基因可操作性地连接于表达调控序列，形成含AAMYBL1发卡结构的植物表达干扰载体，该载体可用于通过代谢工程策略来调控青蒿中青蒿素的含量。0045实施例3、根癌农杆菌介导的AAMYBL1干扰载体遗传转化青蒿获得转基因青蒿植株00461含AAMYBL1干扰表达载体的根癌农杆菌工程菌的获得0047将实施例2中含AAMYBL1的植物双元干扰表达载体采用冻融法转入根癌农杆菌如。
21、EHA105，为市场有公开出售的生物材料，可以从澳大利亚CAMBIA公司购得，菌株编号为GAMBAR1，并进行PCR验证。结果表明，含AAMYBL1的植物双元干扰表达载体已成功构建到根癌农杆菌菌株中。00482根癌农杆菌介导AAMYBL1基因转化青蒿004921外植体的预培养0050青蒿种子用75乙醇浸泡1MIN，再用20NACLO浸泡20MIN，无菌水冲洗34次，用无菌吸水纸吸干表面水分，接种于无激素的MSMURASHIGEANDSKOOG,1962固体培养基中，25、16H/8HLIGHT/DARK光照培养，即可获得青蒿无菌苗。待苗长至5CM左右后,剪取无菌苗叶片外植体用于转化。00512。
22、2农杆菌与外植体的共培养0052将所述的叶片外植体，转到共培养培养基1/2MSAS100MOL/L中，滴加含活化好的所述含AAMYBL1植物双元干扰表达载体的根癌农杆菌工程菌的1/2MS悬液，使外植体与菌液充分接触，28暗培养3D。以滴加在不带有目的基因的根癌农杆菌的1/2MS液体培养基悬液的叶片外植体为对照。005323抗性再生植株的筛选0054将所述的共培养3D的青蒿外植体转入到发芽筛选培养基MS6BA05MG/LNAA005MG/LKAN50MG/LCB500MG/L上于25、16H/8H光照培养，每两周继代培养一次，经过23次继代后即可获得KAN抗性丛生芽。将生长良好的抗性丛生芽剪下转。
23、入生根培养基1/2MSCB125MG/L上培养至生根，从而获得KAN抗性再生青蒿植株。00553转基因青蒿植株的PCR检测0056根据目的基因所在表达盒上游的35S启动子区域和AAMYBL1分别设计正向引物设计和反向引物对目的基因进行检测。结果表明，利用所设计的PCR特异引物，能扩增出特异DNA片段。而以非转化青蒿基因组DNA为模板时，没有扩增出任何片段。说明书CN104152463A5/6页70057本实施例将所述的植物表达载体转化根癌农杆菌，获得用于转化青蒿的含AAMYBL1植物双元干扰表达载体的根癌农杆菌菌株，利用所构建的根癌农杆菌菌株转化青蒿，获得经PCR检测的转基因青蒿植株。转基因青。
24、蒿植株的获得为筛选获得较高青蒿素含量的青蒿株系提供了直接素材。0058实施例4、转基因青蒿表皮腺毛密度和总腺毛数量的统计0059使用奥林巴斯公司的BX51型号显微镜，在波长为450NM480NM的激发光下观察非转基因青蒿和转AAMYBL1I干扰载体青蒿的叶片。取同等大小的青蒿叶片，在不同的5个位置随机取样，统计腺毛密度。测量青蒿叶片总面积，计算得到每个叶片总腺毛数量。0060在本发明中转AAMYBL1I干扰载体青蒿的腺毛密度显著提高。在非转基因青蒿的腺毛密度为24个每平方毫米时，抑制AAMYBL1基因表达的转基因青蒿的叶片腺毛密度提高到34个每平方毫米。而每片叶片总腺毛数量从61947个提高到。
25、93683个图1。图1在青蒿中抑制AAMYBL1的表达提高了腺毛密度。A，半定量检测AAMYBL1RNAI青蒿中AAMYBL1表达量。B，定量PCR检测AAMYBL1RNAI青蒿中AAMYBL1表达量。C，荧光显微镜观察野生型青蒿叶片腺毛。D，荧光显微镜观察AAMYBL1RNAI青蒿叶片腺毛。E，每个叶片总腺毛数量统计。，P001T检验。F，腺毛密度统计。，P001T检验。0061实施例5、利用HPLCELSD测定转基因青蒿中青蒿素含量00621HPLCELSD条件及系统适用性以及标准溶液的配制0063HPLC采用WATERALLIANCE2695系统，色谱柱为C18反相硅胶柱SYMMETRY。
26、SHIELDTMC18，5M，25046MM，WATERS，流动相为甲醇水，甲醇水的体积比为7030，柱温30，流速10ML/MIN，进样量10L，灵敏度AUFS10，理论塔板数按青蒿素峰计算不低于2000。0064ELSD采用WATERALLIANCE2420系统,蒸发光散射检测器漂移管温度40,放大系数GAIN为7，载气压力5BAR；0065精密称取青蒿素标准品SIGMA公司20MG用1ML甲醇完全溶解，得到2MG/ML青蒿素标准品溶液，保存于20备用。0066本发明中流动相为甲醇METHANOL水，比例为7030时，青蒿素的保留时间为51MIN,峰型良好。理论塔板数按青蒿素计算不低于20。
27、00。00672标准曲线的制作0068将所述对照品溶液在相应色谱条件下分别进样2L，4L，6L，8L，10L记录图谱及色谱参数，分别以峰面积Y对标准品含量X,G进行回归分析。通过研究，本发明中青蒿素在420G范围内呈现良好的LOGLOG线性关系。青蒿素对照品的LOGLOG线性回归方程为Y128E000X471E000，R0979546。00693样品的制备和青蒿素含量的测定0070在青蒿植株的上，中和下部共取2G新鲜的青蒿叶片，于45烘箱中烘至恒重。然后从烘干的枝条上敲下叶和花蕾，磨成粉末。称取约01G干粉于2MLEPPENDORF管中，加入2ML乙醇，用40W超声波处理30MIN，5000R。
28、PM离心10MIN，取上清用022M滤膜过滤，即可用于HPLCELSD测定青蒿素的含量。0071采用HPLCELSD测定青蒿素含量，样品进样体积为20L,根据峰面积代入线形回归方程计算出样品中的青蒿素含量MG，再除以样品的青蒿叶干重G，从而计算出青蒿说明书CN104152463A6/6页8植株中青蒿素的含量。0072在本发明中转AAMYBL1I干扰载体的转基因植株可显著提高了青蒿中青蒿素含量。在非转化普通青蒿含量为8MG/GDW时，同时期转AAMYBL1I干扰载体青蒿中青蒿素的含量平均达到12MG/GDW，其含量是非转化青蒿含量的15倍图2。图2在青蒿中抑制AAMYBL1的表达提高了青蒿素和二。
29、氢青蒿酸含量。A,转AAMYBL1RNAI青蒿中，使用HPLC检测青蒿素。B,转AAMYBL1RNAI青蒿中，使用HPLC检测二氢青蒿酸含量。结果为三次重复的平均值，误差线表示标准差。统计分析用TTEST检验，P001。0073本实施例采用HPLCELSD法测定了转基因青蒿中青蒿素含量，采用转化AAMYBL1I干扰载体代谢工程策略发现AAMYBL1基因的表达与青蒿素的含量具有明显的关联关系，为利用该基因进行过表达研究进而提高青蒿中青蒿素的含量提供了有力的实验证据。0074本发明的青蒿MYBLIKE类转录因子编码序列AAMYBL1能够实现提高植物中青蒿素含量，将所述编码序列连于植物表达调控载体上。
30、，构建含所述编码序列的植物表达载体；将表达载体转入农杆菌，将农杆菌转入青蒿；通过抗生素筛选，获得含有所述编码序列的转化细胞，再生转基因植株；本发明获得的转基因青蒿中青蒿素的含量受到显著调控，在非转化普通青蒿含量为8MG/GDW时，同时期转AAMYBL1I干扰载体青蒿中青蒿素的含量平均为12MG/GDW，其含量是非转化青蒿含量的15倍。本发明提供了一个调控青蒿中青蒿素含量的转录因子编码序列，为利用该编码序列大规模生产青蒿素打下了坚实的基础。0075以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。说明书CN104152463A1/2页900010002序列表CN104152463A2/2页10序列表CN104152463A101/2页11图1说明书附图CN104152463A112/2页12图2说明书附图CN104152463A12。