碱性磷酸酶检测试剂 技术领域：
本发明涉及诊断试剂，特别是一种以磷酸对硝基苯酚为反应底物的碱性磷酸酶检测试剂。
背景技术：
我国是肝炎大国，据国家疾病防预中心统计数据目前我国乙肝病毒感染和携带者已占总人口的10～14％，小儿佝偻病是我国重点防治的“小儿四病”之一，胆道、骨科等疾病发病率也比较高。碱性磷酸酶作为胆道、骨、肝等疾病的基本诊断手段，因该诊断方法简便、快速、特异、微量而被广泛应用于临床。
碱性磷酸酶检测的一些常用方法如下：
1、以磷酸对硝基苯酚为反应底物，在碱性条件下，它会被碱性磷酸酶作用生成黄色的对硝基苯酚，用405nm波长检测，根据吸光度增加的速率可以算出碱性磷酸酶的活性。缓冲液使用2-氨基-2-甲基-1-丙醇作为反应产物磷酸基的受体，最适反应温度30℃，亦可转换为37℃。此法目前为国际临床化学委员会(IFCC)的推荐方法。我国目前对于碱性磷酸酶的检测基本都使用该方法。
2、以磷酸对硝基苯酚为反应底物，在碱性条件下，它会被碱性磷酸酶作用生成黄色的对硝基苯酚，用405nm波长检测，根据吸光度增加的速率可以算出碱性磷酸酶的活性。缓冲液使用二乙醇胺作为反应产物磷酸基的受体，最适反应温度25℃。此法目前为德国临床化学委员会(DGKC)在25℃下的推荐方法。
3、以磷酸对硝基苯酚为反应底物，在碱性条件下，它会被碱性磷酸酶作用生成黄色的对硝基苯酚，用405nm波长检测，根据吸光度增加的速率可以算出碱性磷酸酶的活性。缓冲液使用N-甲基-D-葡萄糖胺作为反应产物磷酸基的受体，最适反应温度37℃。此法目前为德国临床化学委员会(DGKC)在37℃下的推荐方法。
4、金氏磷酸苯二钠比色法，此法目前应用已很少，此处不在赘述。
以下就我国临床化学诊断试剂的大体状况做一简单阐述。目前国内不少生产厂商仍以生产干粉试剂为主，总体处在国外廿十世纪七八十年代的水平。干粉试剂的最大问题是需要在使用前进行复溶，而复溶过程中所用水的要求比较高，各用户之间差异较大，造成各客户结果间存在明显差异，且干粉试剂复溶后保存期普遍较短。因此，国外诊断试剂行业自廿十世纪九十年代开始开发研究与销售液体诊断试剂，进入廿十一世纪后，液体诊断试剂已占据世界诊断试剂市场地主导地位。目前国内高性能的液体诊断试剂基本靠国外进口，虽也有一些生产厂商开始生产此类试剂，但普遍存在试剂批间差异大、检测样品所含干扰物质对检测干扰比较大等问题。在临床使用中这些问题的存在给医生诊断病情带来很多不确定性，容易造成误诊、漏诊。另外这些试剂还普遍存在保存期短的问题，开瓶后试剂短时间内失效造成不必要的资源浪费。
碱性磷酸酶液体试剂盒开发的主要难点在于如何提高试剂的保存期与开瓶有效期，进而减小试剂的批间差异。首先我们了解到引起试剂不稳定的因素主要在于反应底物磷酸对硝基苯酚的自身不稳定，它会随时间而发生自身水解，生成磷酸基与对硝基苯酚(反应检测物)，致使试剂本底(起始吸光度)增高，所含反应底物量减少，进而导致试剂检测结果的不稳定，试剂失效。
发明内容：
本发明要解决目前碱性磷酸酶检测试剂普遍存在试剂批间差异大、检测样品所含干扰物质对检测干扰比较大，特别是在临床使用中这些问题的存在给医生诊断病情带来很多不确定性，容易造成误诊、漏诊的技术问题。
为解决上述技术问题，本发明是这样实现的：
一种碱性磷酸酶检测试剂，以磷酸对硝基苯酚为反应底物，其特征在于：反应底物中加入稳定剂甘氨酸和十二烷基硫酸钠，并以Good’s缓冲液调节pH；甘氨酸与十二烷基硫酸钠的加入浓度分别为0.1mmol/L～1mmol/L与3mmol/L～17mmol/L，pH范围为7.5～11.0。
加入浓度分别为0.1mmol/L与3mmol/L的甘氨酸与十二烷基硫酸钠作为稳定剂，并以Good’s缓冲液调节pH至7.5。
加入浓度分别为1mmol/L与17mmol/L的甘氨酸与十二烷基硫酸钠作为稳定剂，并以Good’s缓冲液调节pH至11.0。
加入浓度分别为0.5mmol/L与10mmol/L的甘氨酸与十二烷基硫酸钠作为稳定剂，并以Good’s缓冲液调节pH至9.0。
本试剂盒为全液体双试剂，并达到以下性能指标：①当血清/血浆中抗坏血酸浓度小于300mg/L、胆红素浓度小于680mmol/L、血红蛋白浓度小于2g/L、甘油三酯浓度小于22.6mmol/L时不影响测试。②试剂批间差异小，在检测结果均值在120U/L左右时，试剂批间CV小于5％。③病人结果可报告范围(线性范围)为2～1000U/L。④保存期长，2～8℃保存有效期可达15个月。⑤试剂开瓶后有效期长，2～8℃保存有效期可达28天。与以往的干粉和液体试剂相比它具有的主要优势是：①保存期长；②开瓶有效期长。
现就本发明与国内产品进行对比：
1、本发明的碱性磷酸酶液体试剂盒(以下简称A试剂盒)说明书声明工作试剂在2～8℃可稳定28天，试剂要求以水为空白在405nm处的吸光度应小于0.7。
2、某市售国产碱性磷酸酶液体试剂盒(以下简称B试剂盒)说明书声明工作试剂在2～8℃可稳定14天，试剂要求以水为空白在405nm处的吸光度应小于0.7。
3、某市售碱性磷酸酶干粉试剂盒(以下简称C试剂盒)说明书声明按试剂说明书要求进行复溶，复溶后的工作试剂在2～8℃可稳定14天，试剂要求以水为空白在405nm处的吸光度应小于0.8。操作步骤：
将上述3种试剂在日立全自动生化分析仪上进行测试，仪器试剂仓有冷藏功能(温度控制在4～8℃)，3种试剂的试剂空白吸光度结果和试剂检测控制品结果如下：
表1试剂空白吸光度结果(14天)
表2试剂空白吸光度结果(28天)
表3试剂检测控制品结果(14天)
表4试剂检测控制品结果(28天)
附图说明：
图1是本发明试剂1的工艺流程图。
图2是本发明试剂2(反应底物)的工艺流程图。
具体实施方式：
碱性磷酸酶液体试剂开发的主要难点在于如何提高试剂的保存期与开瓶有效期，进而减小试剂的批间差异。首先我们了解到引起试剂不稳定的因素主要在于反应底物磷酸对硝基苯酚的自身不稳定，它会随时间而发生自身水解，生成磷酸基与对硝基苯酚(反应检测物)，致使试剂本底(起始吸光度)增高，所含反应底物量减少，进而导致试剂检测结果的不稳定，试剂失效。那么寻找何种稳定剂来防止磷酸对硝基苯酚的水解成为了我们科研开发的重点，我们先后寻找了多种稳定剂，效果都不理想，最后选择甘氨酸和十二烷基硫酸钠，并以Good’s缓冲液调节pH，效果比较显著。然后经过我们多次实验，调整了甘氨酸与十二烷基硫酸钠的加入量，浓度分别为0.1mmol/L～1mmol/L与3mmol/L～17mmol/L，成品试剂2(反应底物)的pH范围为7.5～11.0，并在此基础上形成了一个完整的生产工艺流程。
工艺流程见图1、2。
实施例1：
反应底物加入浓度分别为0.1mmol/L与3mmol/L的甘氨酸与十二烷基硫酸钠作为稳定剂的成品试剂2，并以Good’s缓冲液调节pH至7.5。(以下简称D试剂)
实施例2：
反应底物加入浓度分别为1mmol/L与17mmol/L的甘氨酸与十二烷基硫酸钠作为稳定剂的成品试剂2，并以Good’s缓冲液调节pH至11.0。(以下简称E试剂)
实施例3：
反应底物加入浓度分别为0.5mmol/L与10mmol/L的甘氨酸与十二烷基硫酸钠作为稳定剂的成品试剂2，并以Good’s缓冲液调节pH至9.0。(以下简称F试剂)
将上述D、E、F三种试剂分别进行实验，结果显示如下：
表5试剂空白吸光度结果(28天)
表6试剂检测控制品结果(28天)