一种保持根结线虫卵孵化活性的表面消毒方法.pdf

本发明属于植物病理学领域，具体涉及一种保持根结线虫卵孵化活性的表面消毒方法，包括以下步骤：制备根结线虫卵悬浮液、表面消毒、接种和检测。本方法具有操作简单，消毒效果好，经消毒后根结线虫卵孵化率高的优点。本方法对植物病理学、植物线虫学的研究以及根结线虫无外源培养等方面有极为重要的利用价值。

权利要求书
1.  一种保持根结线虫卵孵化活性的表面消毒方法，其特征在于，包括以 下步骤：
(1)制备根结线虫卵悬浮液：获得感病植株根系并制备根结线虫卵悬浮 液；
(2)表面消毒：将卵悬液倒入自制筛子，然后将盛有线虫卵的筛子浸入 70％乙醇溶液，表面灭菌，将筛子移出，用无菌水多次重复冲洗线虫卵去除残 余的乙醇溶液；
(3)污染检测：将一部分表面消毒的线虫卵均匀涂布到PDA平板中， 每处理组3次重复，置于25℃恒温箱中，观察污染情况，检测其是否灭菌彻 底；
(4)孵化率检测：另一部分表面消毒的线虫卵置于96孔细胞培养板， 每孔50±10个卵，4次重复，显微镜下记录卵的初始数量，每3天记录孵化 出二龄幼虫的数量，计算孵化率。

2.  如权利要求1所述的保持根结线虫卵孵化活性的表面消毒方法，其特 征在于，步骤(1)中获得根结线虫卵悬浮液的浓度为20-50粒卵/μL。

3.  如权利要求1所述的保持根结线虫卵孵化活性的表面消毒方法，其特 征在于，步骤(2)中灭菌时间为30-60S。

4.  如权利要求1所述的保持根结线虫卵孵化活性的表面消毒方法，其特 征在于，步骤(2)中自制筛子为可拆装可灭菌的消毒筛，其尺寸为内径2cm， 筛网网孔直径30μm。

说明书一种保持根结线虫卵孵化活性的表面消毒方法
技术领域
本发明属于植物病理学领域，具体涉及一种保持根结线虫卵孵化活性的 表面消毒方法。
背景技术
根结线虫(Meloidogyne spp.)是一种高度专化型的植物病原线虫。已知 为害蔬菜的根结线虫主要有南方根结线虫、北方根结线虫、花生根结线虫和 爪哇根结线虫等。其寄主范围广泛，可为害蔬菜、果树、观赏植物、粮食作 物、以及中草药等2000多种植物，尤其以番茄、黄瓜等经济作物受害严重， 为害同时还造成一些真菌和细菌性病害的复合侵染。根结线虫以为害各种植 物的根部为主，表现为侧根和须根比正常的增多，并在幼根或须根上形成球 形或不规则形大小不等的瘿瘤，有的呈念珠状。被害植株地上部生长矮小、 缓慢、叶色异常，结果少，产量低，甚至造成植株提早死亡。
根结线虫是植物的重要病原之一。在根结线虫的研究过程中，如果深入 研究该病原的致病机制或其与寄主植物的分子互作等，常常涉及到根结线虫 的无外源培养，根结线虫卵的表面消毒和孵化率是试验成败的关键。因此， 获得保持根结线虫卵孵化活性的简单易行的方法对该病害的深入研究有重要 意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种保持根结线虫卵孵化活性的表面消毒方法，以 克服现有接种根结线虫技术常常受到污染或造成卵孵化率低的不足。本发明 提供的技术方案是：
一种保持根结线虫卵孵化活性的表面消毒方法，其特征在于，包括以下 步骤：
(1)制备根结线虫卵悬浮液：获得感病植株根系并制备根结线虫卵悬浮 液；
(2)表面消毒：将卵悬液倒入自制筛子，然后将盛有线虫卵的筛子浸入 70％乙醇溶液，表面灭菌，将筛子移出，用无菌水多次重复冲洗线虫卵去除残 余的乙醇溶液；
(3)污染检测：将一部分表面消毒的线虫卵均匀涂布到PDA平板中， 每处理组3次重复，置于25℃恒温箱中，观察污染情况，检测其是否灭菌彻 底；
(4)孵化率检测：另一部分表面消毒的线虫卵置于96孔细胞培养板， 每孔50±10个卵，4次重复，显微镜下记录卵的初始数量，每3天记录卵孵 化出二龄幼虫的数量，计算孵化率。
本技术方案中，步骤(1)中获得根结线虫卵悬浮液的浓度为20-50粒卵 /μL。
本技术方案中，步骤(2)中灭菌时间为30-60S。
本技术方案中，步骤(2)中自制筛子为可拆装可灭菌的消毒筛，其尺寸 为内径2cm，筛网网孔直径30μm。
与现有技术相比，本发明具有的有益效果：
1、本发明采用乙醇溶液作为消毒液，无毒，经济，容易获得以及对环境 无污染。
2、本发明操作简单，操作过程不损失卵粒。
3、本发明节约时间，与其它线虫卵消毒液(如硫酸链霉素)相比可节省 时间3-5h。
附图说明
图1为根结线虫卵经70％乙醇溶液灭菌后利用PDA平板培养基检测灭菌 效果；
主要附图标记说明：
A、B、C是经70％乙醇溶液消毒处理；D、E、F为对照试验(只经无菌 水冲洗)。
具体实施方式
下面结合具体例对本发明作进一步详细的说明。
实施例1：根结线虫卵悬浮液的获取及消毒，按如下步骤进行操作：
(1)利用次氯酸钠法收集接种后25-35天的感病番茄植株根系上根结线 虫卵囊中的卵；
(2)根据需要配制成相应浓度的卵悬液，本试验的卵粒浓度为20-50粒 卵/微升；
(3)试验前准备高压灭菌过的蒸馏水、100mL烧杯、消毒筛等用具；
(4)配制70％的乙醇溶液40mL，置于烧杯中，将卵悬液缓慢倒入消毒 筛，然后将消毒筛放入盛有70％的乙醇溶液烧杯中，浸没筛子高度的一半；
(5)消毒时间为30-60S，然后取出消毒筛，迅速用无菌水冲洗卵以去除 残余的乙醇溶液；
(6)用无菌水将处理好的卵移入另一灭菌小烧杯中，即获得表面消毒的 并保持卵孵化活力的根结线虫卵，可以用于根结线虫的无外源培养等。
实施例2：PDA平板污染检测和孵化率检测试验
试验方案：线虫卵的获取及其消毒方法同实施例1，为了证明上述消毒方 法对卵的孵化率的影响，进行了如下试验：
(1)污染检测：将一部分表面消毒的线虫卵均匀涂布到PDA平板中， 每处理组3次重复，置于25℃恒温箱中，观察污染情况，检测其是否灭菌彻 底；
(2)孵化率检测：另一部分表面消毒的线虫卵置于96-孔细胞培养板， 每孔50±10个卵，4次重复，显微镜下记录卵的初始数量，每3天记录孵化 出二龄幼虫的数量，计算孵化率。
试验结果：
(1)PDA平板污染检测表明，经70％乙醇溶液表面消毒的卵没有任何污 染，而未经消毒的对照卵在接种PDA平板上呈现了细菌和真菌污染(详见图 1)。
(2)70％乙醇溶液表面消毒的卵和未经消毒的卵相比较(详见表1)，二 者的累积孵化率在孵化期间的各个时间均无显著差异(P＞0.05)，在第15天 时，表面消毒处理组累积孵化率为93.3％，对照组为93.9％。结果表明，利用 70％乙醇溶液表面灭菌对根结线虫卵的孵化没有影响。
表1根结线虫卵表面灭菌后孵化率

前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。 这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述 教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在 于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实 现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。 本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。