说明书五环三萜类化合物及其制备方法以及该化合物在制备防治肿瘤药物中的应用
技术领域
本发明涉及有机化学和生物化学领域，具体涉及一类五环三萜的S-苯基-L-半胱氨酸缀合物的制备方法和用途。本发明对五种体外培养的人体肿瘤细胞株，即人肺癌A549细胞株，人乳腺癌MCF-7细胞株，人子宫颈癌Hela细胞株，人肝癌HepG2细胞株，人神经胶质瘤U87细胞株进行了细胞生长抑制活性筛选。本发明系列化合物被发现具有一定的抑制肿瘤细胞生长的活性，可预期作为抗肿瘤药物的用途。
背景技术
癌症被认为是人类的“头号杀手”，被称为“不治之症”。攻克癌症一直是全世界关注的热点话题。在发达国家，癌症在常见人口死亡原因中排名第二，仅次于心脏病，迄今为止，全世界已耗资300多亿美元投入到癌症的预防、治疗、药物研制和临床治疗中[1]。化疗是目前治疗癌症的主要手段之一，尽管抗癌药物及化疗方案不断推陈出新，但是治疗效果仍不尽如人意，其中一个重要的原因就是肿瘤细胞对化疗药物产生耐药性。统计表明，肿瘤患者死因大多与耐药性有关，甚至有些新药刚用于临床就发现耐药。对于恶性肿瘤的治疗仍存在效率低、选择性差、毒副作用大等问题。因此，寻找高效、低毒、特异性强的抗肿瘤药物仍是药物治疗的当务之急。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明的目的是提供一种高效、低毒、选择性强、特异性强的五环三萜类化合物及其制备方法以及该化合物在制备防治肿瘤药物中的应用。
本发明的五环三萜类化合物，所述化合物的结构式如下：
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其中，R1 是S-苯基-L-半胱氨酰基；R2 是氢或羰基，R3 和R4选自COOH，-CH3，-COOCH3。
所述的化合物为3β-O-S-苯基-L-半胱氨酰基齐墩果酸甲酯；结构式为：
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所述的化合物为3β-O-S-苯基-L-半胱氨酰基甘草次酸甲酯；结构式为：
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本发明的五环三萜类化合物3β-O-S-苯基-L-半胱氨酰基齐墩果酸甲酯的制备方法，步骤如下：
以齐墩果酸为起始原料，在N,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶剂中，K2CO3作用下与CH3I反应得到C-28位羧基甲酯化的产物，在4-二甲氨基吡啶(DMAP)为催化剂，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDCI)为脱水剂条件下与氨基被保护的S-苯基-L-半胱氨酸进行偶联，最后以CH2Cl2为溶剂，二乙胺(Et2NH)条件下脱去9-芴基甲氧羰基(Fmoc)保护基得到齐墩果酸S-苯基-L-半胱氨酸缀合物；
合成路线如下：
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本发明的五环三萜类化合物3β-O-S-苯基-L-半胱氨酰基甘草次酸甲酯的制备方法，步骤如下：
首先将甘草次酸C-30位甲酯化，然后以CH2Cl2为溶剂，将其在DMAP和EDCI作用下，与带有Fmoc保护基的S-苯基-L-半胱氨酸进行偶联，最后用Et2NH去掉保护基，得到甘草次酸S-苯基-L-半胱氨酸缀合物；
合成路线如下：
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本发明的五环三萜类化合物在制备防治肿瘤药物中的应用。
本发明的五环三萜类化合物可药用盐在制备防治肿瘤药物中的应用。
本发明的五环三萜类化合物具有高效、低毒、选择性强、特异性强的优点。五环三萜类化合物具有重要的药理特性和各种生物活性。这类化合物具有一定的抗炎活性，可抑制肿瘤细胞的增殖，诱导细胞凋亡，抑制血管生成和转移等。合成的五环三萜类化合物在预防和治疗各种癌症方面都具有潜在的应用价值。
S-苯基-L-半胱氨酸(S-phenyl-L-cysteine, S-P-C)是一种非蛋白质氨基酸，它是一种抗艾滋药物人类免疫缺陷病毒蛋白酶抑制剂的构成元件。非蛋白质氨基酸可用于稳定多肽防御蛋白酶水解的攻击，还可通过改变化学构象来模拟天然结构，它们增加了天然氨基酸手性源的复杂性，因此用于丰富肽类多样性。本发明利用拼合原理将S-苯基-L-半胱氨酸与具有生物活性的五环三萜类化合物进行偶联，以期得到高效、低毒新的抗肿瘤药物。
具体实施方式
本发明的五环三萜类化合物，该化合物的结构式如下：
；
其中，R1 是S-苯基-L-半胱氨酰基；R2 是氢或羰基，R3 和R4选自COOH，-CH3，-COOCH3。
所述的化合物为3β-O-S-苯基-L-半胱氨酰基齐墩果酸甲酯；结构式为：
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所述的化合物为3β-O-S-苯基-L-半胱氨酰基甘草次酸甲酯；结构式为：
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本发明的五环三萜类化合物3β-O- S-苯基-L-半胱氨酰基齐墩果酸甲酯的制备方法，步骤如下：
以齐墩果酸为起始原料，在DMF溶剂中，K2CO3作用下与CH3I反应得到C-28位羧基甲酯化的产物，在DMAP为催化剂，EDCI为脱水剂条件下与氨基被保护的S-苯基-L-半胱氨酸进行偶联，最后以CH2Cl2为溶剂，Et2NH条件下脱去Fmoc保护基得到齐墩果酸S-苯基-L-半胱氨酸缀合物；
合成路线如下：
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本发明的五环三萜类化合物3β-O-S-苯基-L-半胱氨酰基甘草次酸甲酯的制备方法，步骤如下：
首先将甘草次酸C-30位甲酯化，然后以CH2Cl2为溶剂，将其在DMAP和EDCI作用下，与带有Fmoc保护基的S-苯基-L-半胱氨酸进行偶联，最后用Et2NH去掉保护基，得到甘草次酸S-苯基-L-半胱氨酸缀合物；
合成路线如下：
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本发明的五环三萜类化合物在制备防治肿瘤药物中的应用。
本发明的五环三萜类化合物可药用盐在制备防治肿瘤药物中的应用。
为了更好地理解本发明的实质，下面用制备实施例的形式说明3β-O-S-苯基-L-半胱氨酰基齐墩果酸甲酯和3β-O-S-苯基-L-半胱氨酰基甘草次酸甲酯化合物制备的过程，实施例给出了化合物的结构表征数据。必须说明，本发明的实施例是用于说明而不是对本发明的限制。根据本发明的实质对本发明进行的简单改进都属于本发明要求保护的范围。
实施例1：化合物3β-O- S-苯基-L-半胱氨酰基齐墩果酸甲酯的制备
在250mL圆底烧瓶中加入齐墩果酸(5g， 11mmol)和无水K2CO3(3.78g，27.35mmol)，再加入干燥的DMF(50mL)，搅拌下慢慢滴加CH3I(1.37mL，21.89mmol)，常温下搅拌6小时，反应完毕后用水稀释，用1M的盐酸洗涤至微酸性，再用水洗至中性，并用饱和氯化钠洗涤，所得有机相用无水硫酸镁干燥，过滤，减压蒸馏除去溶剂得粗产品，再用乙酸乙酯/石油醚(1:5, v:v)作洗脱剂进行加压柱层析，分离得到白色固体齐墩果酸甲酯。产量：5g，产率：97%，熔点：197-198℃；IR(KBr): 3348, 2948, 1728, 1426cm-1；1H NMR(400 MHz, CDCl3): 5.27(t, J=3.6Hz, 1H, H-12), 3.61(s, 3H, -OCH3), 3.20(dd, J=10.4Hz, 5.2Hz, 1H, H-3), 2.85(dd, J=14.0Hz, 4.0Hz, 1H, H-18), 1.06, 1.00, 0.92, 0.78, 0.73(s, each 3H)。
在100mL圆底烧瓶中，将齐墩果酸甲酯(400mg，0.86mmol)、N-芴甲氧羰基-S-苯基-L-半胱氨酸(382mg，1.02mmol)、DMAP(124mg，1.02mmol)溶于CH2Cl2(7mL)中，将反应液冷却到0℃，再将EDCI(197mg，1.02mmol)溶于CH2Cl2(3mL)中，在搅拌下逐滴加入反应瓶中，滴加完毕后再在0℃ 条件下搅拌5分钟，室温下搅拌5小时，反应完毕后，用CH2Cl2提取，并用饱和NaCl溶液洗涤，有机相用无水硫酸镁干燥，过滤，减压蒸馏除去溶剂得粗产品，再用乙酸乙酯/石油醚(1:10, v:v)作洗脱剂进行加压柱层析，分离得白色固体3β-O-(N-芴甲氧羰基)-S-苯基-L-半胱氨酰基齐墩果酸甲酯。产量：372mg，产率：66.7%，熔点：71.2-72.4℃; IR(KBr): 3440, 2952, 2716, 1728, 1510, 1452cm-1; 1H NMR(500MHz, CDCl3): δ 7.76(d, J=7.6Hz, 2H, Fluorenyl H-4 & H-5), 7.58(d, J=6.7Hz, 2H, Fluorenyl H-1 & H-8), 7.41-7.30(m, 9H, Fluorenyl H-2 & H-3 & H-6 & H-7, 5×Ph-H), 5.56-5.51(m, 1H, -CH-NH-CO), 5.28(t, J=3.4Hz, 1H, H-12), 4.67-4.56(m, 2H, Fluorenyl H-9 & H-3), 4.30(d, J=6.9Hz, 2H, -CHCH2OCONH-), 4.17(t, J=7.2Hz, 1H, -CH2-CH-NH-), 3.61(s, 3H, -OCH3)，3.56(dd, J=13.6Hz, 4.6Hz, 1H, -S-CH-CH-), 3.35(dd, J=13.3Hz, 5.2Hz, 1H, -S-CH-CH-), 2.88(dd, J=13.9Hz, 4.1Hz, 1H, H-18), 1.16, 1.14, 0.94, 0.91, 0.89, 0.85, 0.74(s, each 3H)。
在100mL圆底烧瓶中，将3β-O-(N-芴甲氧羰基)-S-苯基-L-半胱氨酰基齐墩果酸甲酯(250mg， 0.29mmol)溶于CH2Cl2(5mL)中，再加入二乙胺(5mL)，常温下搅拌2小时，反应完毕后，减压蒸馏除去溶剂得粗产品，再用乙酸乙酯/石油醚(1:2, v:v)作洗脱剂进行加压柱层析，分离得白色固体3β-O-S-苯基-L-半胱氨酰基齐墩果酸甲酯。产量：100mg，产率：66.2%，熔点：58.2-59.3℃; IR(KBr): 3392, 2936, 1732, 1506, 1456cm-1; 1H NMR(500MHz, CDCl3): δ 7.35(d, J=7. 5Hz, 2H, Phenyl H-2 & H-6), 7.22(t, J=7.4Hz, 2H, Phenyl H-3 & H-5), 7.15(t, J=7.3Hz, 1H, Phenyl H-4), 5.21(t, J=3.5Hz, 1H, H-12), 4.59-4.56(m, 1H, H-3), 3.61(s, 3H, -OCH3), 3.67(brs, 1H, -CH2-CH-NH2), 3.43(dd, J=13.2Hz, 7.6Hz, 1H, -S-CH-CH-), 3.10(dd, J=13.2Hz, 3.7Hz, 1H, -S-CH-CH-), 2.23(d, J=11.0Hz, 1H, H-18), 1.26, 1.08, 0.95, 0.90, 0.88, 0.84, 0.75(s, each 3H)。
实施例2：化合物3β-O-S-苯基-L-半胱氨酰基甘草次酸甲酯的制备
在250mL圆底烧瓶中加入甘草次酸(1g, 2.13mmol)和无水K2CO3(0.735g, 5.32mmol)，再加入干燥的DMF(10mL)，搅拌下滴加CH3I(0.26mL, 4.25mmol)，常温下搅拌6h，反应完毕，用水(20mL×3) 洗涤，用乙酸乙酯(50ml)萃取有机相，然后用饱和NaCl溶液洗涤，再无水MgSO4干燥、过滤、减压蒸馏、柱层析乙酸乙酯/石油醚(1:2，v:v)得到白色固体甘草次酸甲酯。产量：875.2mg，产率：85.6%，熔点：240.5-241.8℃; IR(KBr): 3453, 2945, 1723, 1662cm-1; 1H NMR(400MHz, CDCl3): δ 5.65(s, 1H, H-12), 3.68(s, 3H, -OCH3), 3.24-3.21(m, 1H, H-3), 2.79(dt, J1=13.2Hz, J2=3.6Hz, 1H, H-18), 2.34(s, 1H, H-9), 1.36, 1.15, 1.14, 1.12, 1.00 (s, each 3H, -CH3), 0.80(s, 6H, -CH3×2)。
将甘草次酸甲酯(225mg, 0.48mmol)、Fmoc-S-P-C(300mg, 0.72mmol)及DMAP(88.2mg, 0.72mmol)用CH2Cl2(2.3mL)溶解，将反应液冷却到0℃，将EDCI(91.8mg, 0.72mmol)溶于CH2Cl2(1mL)中逐渐加入，滴加完毕后再在0℃下搅拌5min，然后在室温下搅拌3h，反应完毕减压蒸馏出去溶剂，再用CH2Cl2/H2O萃取，用饱和NaCl溶液(10mL)洗涤，MgSO4干燥、过滤、减压蒸馏、乙酸乙酯/石油醚(1:5，v:v)得到白色固体3β-O-(N-芴甲氧羰基)-S-苯基-L-半胱氨酰基甘草次酸甲酯。产量：347.2mg，产率：40.9%, 熔点：125.4-126.0℃; IR(KBr):3437, 2934, 2879, 1723, 1532, 1438, 1369, 1195, 1067, 773, 721cm-1; 1H NMR(400MHz, CDCl3): δ 7.76(d, J=7.6Hz, 2H, fluorenyl H-4’, H-5’), 7.55(m, 2H, fluorenyl H-1’, H-8’), 7.43-7.18(m, 9H, fluorenyl H-2’, H-7’, H-3’, H-6’, Ph-H), 5.671(s, 1H, H-12), 5.52(d, J=8.0Hz, 1H, -NH-), 4.66-4.63(m, 1H, -CH2CHNH-), 4.31-4.28(m, 2H, -COOCH2CH-), 4.16(t, J=7.2Hz, 1H, -COOCH2CH-), 3.69(s, 4H, -OCH3, H-3), 3.55(dd, J1=14.0Hz, J2=4.8Hz, 1H, -SCH2-), 3.36(dd,, J1=13.6Hz, J2=4.8Hz, 1H, -SCH2-), 2.81-2.80(m, 1H, H-18), 2.36(s, 1H, H-9), 1.37,1.16, 1.15, 1.13, 0.92, 0.86, 0.81(each, s, 3H)。
在50mL圆底烧瓶中，将3β-O-(N-芴甲氧羰基)-S-苯基-L-半胱氨酰基甘草次酸甲酯(133.6mg, 0.15mmol)溶解于CH2Cl2(2mL),搅拌下滴加二乙胺(3.32mL, 32.24mmol)，常温下搅拌2h，反应完毕，减压蒸馏除去溶剂，柱层析乙酸乙酯/石油醚(1:5，v:v)得到白色固体3β-O-S-苯基-L-半胱氨酰基甘草次酸甲酯。产量：84.7mg，产率：85%，熔点：143.7-144.1℃; IR(KBr): 3448, 3380, 2967, 2824, 1724, 1653, 1465, 1384, 1256, 1167, 769, 712cm-1; 1H NMR(400MHz, CDCl3): δ 7.42-7.19(m, 5H, Ph-H), 5.67(s, 1H, H-12), 3.69(s, 3H, -OCH3), 3.67-3.65(m, 1H, NH2-CH-), 3.42(dd, J1=13.2Hz, J2=4.4Hz, 1H, -SCH2-), 3.10(dd, J1=13.2Hz, J2=7.6Hz, 1H, -SCH2-), 2.85-2.79(m, 1H, H-18), 2.36(s, 1H, H-9), 1.37, 1.16, 1.15, 1.13, 0.91, 0.89, 0.81( each, s, 3H)。
本发明的化合物具有抑制肿瘤细胞生长的活性，对五种体外培养的人体肿瘤细胞株，即人肺癌A549细胞株，人乳腺癌MCF-7细胞株，人子宫颈癌Hela细胞株，人肝癌HepG2细胞株，人神经胶质瘤U87细胞株的细胞毒活性试验表明此类五环三萜的S-苯基-L-半胱氨酸缀合物对肿瘤细胞生长具有抑制作用，可预期作为新的抗肿瘤药物。
本发明的化合物或其可药用盐及其溶剂化物可以与药学上常用的辅料或载体结合，制备得到具有抑制肿瘤细胞生长从而可用于防治肿瘤的药物组合物。上述各类药物组合物可以采用注射剂、片剂、胶囊剂、栓剂、纳米制剂等剂型药物。
本发明的化合物或其可药用盐及其溶剂化物可以与现已上市的抗肿瘤药物联合使用。
为了更好地理解本发明的实质，下面用本发明的化合物对五种肿瘤细胞株生长的抑制作用实验结果说明其在抗肿瘤药物研究领域中的新用途。药理实施例给出了部分实验数据，是用于说明本发明而不是对本发明的限制。对本发明进行的简单改进属于本发明要求保护的范围。
药理实施例：
实验操作：将两种化合物分别由适量二甲基亚砜(DMSO)溶解，并由细胞培养液稀释成实验所需浓度梯度，DMSO的终浓度≦1‰。取对数生长期的细胞制成细胞悬液，按100 μL/孔将细胞悬液铺于96孔板内，培养24 h。实验设置药物处理组、阴性对照组（不加测量样品只加培养基）、阳性对照组（加抗肿瘤药物顺铂）和空白对照组（不加入细胞）。吸去孔内培养液，各孔分别加入配制好的相应浓度梯度的样品100 μL。继续孵育48 h。吸去孔中培养液，每孔加入10 μL噻唑蓝(Methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide, MTT) 溶液。继续培养4 h，MTT 可以被活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲臜(Formazan)并沉积在细胞中，而死细胞则无此功能。吸去培养液，加入100 μL DMSO，振荡10 min，使紫色结晶完全溶解，使用酶标仪检测490 nm处的吸光值，在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比，记录实验数据。每组实验设置3-5个复空，取平均值计算细胞存活率及样品半数致死浓度(IC50)。细胞存活率=（实验孔A值-空白对照孔A值）/（阴性对照孔A值-空白对照孔A值）×100%。
实验结果：化合物3β-O-S-苯基-L-半胱氨酰基齐墩果酸甲酯对A549细胞，MCF-7细胞，Hela细胞，HepG2细胞，U87细胞的IC50分别为：1.52 × 10-5M；7.04 × 10-6M；8.35 × 10-6M；4.15 × 10-5M；5.56 × 10-5M。
3β-O-S-苯基-L-半胱氨酰基甘草次酸甲酯对A549细胞，MCF-7细胞，Hela细胞，HepG2细胞，U87细胞的IC50分别为：3.65 × 10-5M；4.83 ×10-5M；8.64 × 10-6M；5.80 × 10-5M；6.46× 10-5M。
阳性对照顺铂对A549细胞，MCF-7细胞，Hela细胞，HepG2细胞，U87细胞的IC50分别为：3.04 × 10-5M；5.11× 10-6M；6.18 × 10-6M；2.62× 10-5M；2.23 × 10-5M。
实验结论：上述实验表明本发明的五环三萜的S-苯基-L-半胱氨酸缀合物对人肺癌A549细胞株，人乳腺癌MCF-7细胞株，人子宫颈癌Hela细胞株，人肝癌HepG2细胞株，人神经胶质瘤U87细胞株的生长具有较强的细胞毒性，可预期作为新的抗肿瘤药物。