一种增强肿瘤抗原免疫原性的新策略及其在肺癌免疫治疗中的应用.pdf

本发明公开了一种增强肿瘤抗原免疫原性的新策略及其在肺癌免疫治疗中的应用。本发明通过将肿瘤特异抗原与自噬基因融合，并利用腺病毒载体高效率感染机体APC细胞，二者协同作用可增强机体对肿瘤靶标抗原的免疫应答水平，具有明显的抗肿瘤效果。

1.  一种重组腺病毒，其携带自噬相关蛋白与肿瘤相关抗原的融合蛋白的编码序列。

2.  根据权利要求1所述的重组腺病毒，其特征在于，所述自噬相关蛋白为LC3b蛋白。

3.  根据权利要求1所述的重组腺病毒，其特征在于，所述肿瘤相关抗原为肺癌特异抗原MUC1、PRAME或人类黑色素瘤抗原MAGE-A3或其它肿瘤相关抗原。

4.  根据权利要求1-3任一项所述的重组腺病毒，其特征在于，所述融合蛋白的编码序列从5’到3’依次具有：肿瘤相关抗原编码序列、任选的连接肽编码序列和自噬相关蛋白编码序列。

5.  根据权利要求1-3任一项所述的重组腺病毒，其特征在于，所述融合蛋白编码序列的插入位点位于腺病毒的E1基因或E3 基因区域。

6.  根据权利要求5所述的重组腺病毒，其特征在于，所述腺病毒为2型腺病毒或5型腺病毒或55型腺病毒。

7.  权利要求1-6任一项所述的重组腺病毒在制备用于预防或治疗癌症的制剂中的应用。

8.  根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述癌症是指肺癌。

9.  一种用于预防或治疗癌症的组合物，其包括权利要求1-6任一项所述的重组腺病毒。

10.  根据权利要求9所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物中还包括药学或免疫学上可接受的载体、赋形剂或佐剂。

一种增强肿瘤抗原免疫原性的新策略及其在肺癌免疫治疗中的应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种增强肿瘤抗原免疫原性的新策略及其在肺癌免疫治疗中的应用。
背景技术
肺癌是当前世界上最常见的恶性肿瘤之一，其死亡率居世界肿瘤相关疾病死因的首位。在大多数的病例当中，患者就诊时已经是不可切除的病变或者无法治愈的疾病状态。局部进展期或者一般情况较好的非小细胞肺癌患者可以接受同步放化疗，联合或不联合手术治疗，这样可以获得平均 8 个月的无疾病进展生存，但是5年总生存率仍小于 15%。
因此迫切需要新的更有效的肺癌治疗模式。近年来，在人们不断探索的肿瘤治疗新方法中，免疫治疗是一种治疗肺癌的有效新方法。肺癌免疫治疗是一种极具前景的治疗方法。目前已经发现了一些肿瘤免疫学治疗的靶点：
MUC1 是一种跨膜糖蛋白，它在正常的管道上皮中都有表达，如乳腺、前列腺、肺、胃、膀胱和汗腺等。它的正常功能是与黏蛋白的形成有关，然而，在肿瘤当中它的作用发生了改变，过量的糖蛋白表达会导致免疫活性的产生。高度的 MUC1 表达可以增加癌症的侵袭性，导致肺癌患者的不良预后。不仅如此，MUC1 的过度表达也会激活PI3K 和 AKT 通路，导致肿瘤的增殖。
MAGE-A3，人类黑色素瘤抗原（MAGE）-A，-B，-C 是一个基因家族，它是胚胎来源的正常表达抗原，也在人类特殊免疫组织部位表达。诸如黑色素瘤、肉瘤、膀胱癌、肝癌、食管癌以及肺癌的肿瘤细胞可表达此类抗原，因而它被认为是肿瘤相关性抗原。MAGE-A3 是这个家族基因的一个亚型，在早期（35%）及进展期（55%）肺癌中的表达存在差异，于是被认为是免疫治疗的一个非常好的靶点。
抗原PRAME，它参与维 A 酸受体抑制，在黑色素瘤及非小细胞肺癌中高表达，因此可以作为一个疫苗靶点。
尽管已经发现了上述潜在的肿瘤免疫治疗靶点，然而肿瘤免疫治疗尚面临诸多问题。例如上述肿瘤抗原由于来自机体自身，因此免疫原性通常都很低。如何提高肿瘤抗原的免疫原性是当今肿瘤治疗领域的重大科学难题。
2014年德国默克公司宣布公司开发的新型抗癌疫苗药物Tecemotide（muc1抗原特异性的抗癌疫苗）临床三期研究宣告失败。就在不久之前，葛兰素史克公司开发的抗癌疫苗MAGE A-3也在临床三期研究中宣告失败。这些试验的失败原因很大程度上是因为肿瘤抗原免疫原性低，疫苗无法诱导出足够强度的免疫应答。
诱发机体产生免疫应答的关键步骤在于抗原如何有效被抗原提呈细胞（APC细胞）提呈到免疫细胞表面。机体内的APC细胞主要为树突状DC细胞。
自噬作用最初被认为是细胞在营养缺乏或受到外界应急情况下，降解自身细胞内一些成分获得营养从而能够存活下来的机制。近来的研究表明自噬在固有免疫、适应性免疫中也发挥了重要的作用。有研究数据表明机体能通过自噬机制提呈内源性蛋白抗原，并激发相应的免疫应答。
只有增强肿瘤抗原的免疫原性，使之能在体内引起更有效的肿瘤特异性免疫应答，并且观察到临床疗效，肿瘤的免疫治疗才能真正使得人类获益。
发明内容
本发明的目的在于提供一种携带肿瘤融合抗原的重组腺病毒及其在制备用于预防或治疗癌症的制剂中的应用。
本发明所采取的技术方案是：
一种重组腺病毒，其携带自噬相关蛋白与肿瘤相关抗原的融合蛋白的编码序列。
作为优选的，所述自噬相关蛋白为LC3b蛋白。
作为优选的，所述肿瘤相关抗原为黑色素瘤特异性抗原（PRAME）或人类黑色素瘤抗原（MAGE-A3）或MUC1。
所述融合蛋白的编码序列从5’到3’依次具有：肿瘤相关抗原编码序列、任选的连接肽编码序列和自噬相关蛋白编码序列。
所述融合蛋白编码序列的插入位点位于腺病毒的E1基因或E3 基因区域。
所述腺病毒为2型腺病毒或5型腺病毒或55型腺病毒。
以上所述的重组腺病毒在制备用于预防或治疗癌症的制剂中的应用，所述癌症是指肺癌。
一种用于预防或治疗癌症的组合物，其包括以上所述的重组腺病毒。
所述药物组合物中还包括药学或免疫学上可接受的载体、赋形剂或佐剂。
本发明的有益效果是：
通过将肿瘤特异抗原与自噬基因融合，并利用腺病毒载体高效率感染机体APC细胞，二者协同作用可增强机体对肿瘤靶标抗原的免疫应答水平，具有明显的抗肿瘤效果。
附图说明
图1: 表达肺癌特异抗原的重组载体的构建和鉴定；
图2：通过ELISOPOT技术检测针对肿瘤特异抗原的细胞免疫应答水平；
图3：通过流式细胞技术检测针对肿瘤特异抗原的CD4+ T细胞和CD8+ T细胞免疫应答水平；
图4：携带肿瘤融合抗原的重组腺病毒在小鼠肿瘤模型中起到了良好的杀伤肿瘤细胞的作用。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。
以下实施例中所采用的分子生物学实验技术包括PCR扩增、质粒提取、质粒转化、DNA片段连接、酶切、凝胶电泳等，如无特殊说明，通常按照常规方法操作，具体可参见《分子克隆实验指南》(第三版) (Sambrook J, Russell DW，Janssen K, Argentine J.黄培堂等译，2002，北京：科学出版社) ，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1携带肿瘤融合抗原的重组腺病毒的构建和鉴定
下面以腺病毒中插入肺癌相关抗原（PRAME、Muc-1、MAGE-A3）与LC3b蛋白的融合蛋白编码序列制备重组腺病毒为例，对本发明的增强肿瘤抗原免疫原性策略作进一步的说明。
从NCBI数据库中得到LC3b基因序列，如SEQ ID NO.1所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，通过全基因合成得到LC3b基因。携带有人 PRAME 全长ORF cDNA 序列的pVAX载体由本实验室保存。 PRAME 全长ORF cDNA如SEQ ID NO.3所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
按常规分子克隆技术方法将靶标基因PRAME 全长ORF cDNA与LC3b基因融合，其融合基因序列如SEQ ID NO.5所示。
Muc-1基因序列如SEQ ID NO.6所示，其与LC3b基因的融合基因序列如SEQ ID NO.7所示。
MAGE-A3基因序列如SEQ ID NO.8所示，其与LC3b基因的融合基因序列如SEQ ID NO.9所示。
按照本实验室常规的重组腺病毒构建方法，将LC3b，PRAME，PRAME-LC3b， MAGE-A3，MAGE-A3-LC3b，Muc-1，Muc-1-LC3b分别构建到腺病毒载体中，其中的腺病毒载体为缺失了E1和E3区域的人2型或5型或55腺病毒，然后拯救得到携带目的基因的重组腺病毒，扩增后进行表达和基因组酶切鉴定，接着在Trex293细胞中大量扩增，并采用氯化铯梯度密度离心进行纯化，对纯化的病毒再次鉴定正确后测定其感染滴度TCID50和物理颗粒浓度，然后分装冻存备用（相关方法的具体操作步骤可参见本团队先前的专利，授权专利号：ZL 2007 1 0026295.X）。图1中A是肿瘤抗原基因（如PRAME，MAGE-A3，Muc-1）与LC3b融合的示意图；图1中B是携带目的基因的重组腺病毒的构建鉴定图；图1中C是用western-blot方法检测重组腺病毒蛋白表达水平的检测结果图，可见纯化的重组腺病毒可以高水平的表达目的蛋白。例如Ad5-PRAME可表达55KD左右的靶标蛋白，并且不能被LC3b抗体认别（条带1），只能被PRAME抗体认识（条带3）；Ad5-PRAME-LC3b表达的条带大小约为72Ka和55Ka，且该目标蛋白既能被LC3b抗体认别（条带2），也能被PRAME抗体认识（条带4），这表明融合蛋白表达正确。
同样，实验结果表明：Ad5-Muc-1-LC3b和Ad5-MAGE-A3-LC3b融合蛋白表达正确。
实施例2、携带肿瘤融合抗原的重组腺病毒在小鼠模型中可显著增强肿瘤抗原的免疫原性
进一步研究融合了LC3b的上述基因是否能够在机体内发挥作用而有效的提高T淋巴细胞反应。
1．实验材料
1.1流式抗体
所用单克隆抗体，抗鼠anti-CD3-PerCP, anti-CD4-FITC and anti-CD8-APC (BD Biosciences) anti-IFN-γ-PE, anti-TNF-α-PE-cy7, anti-IL-2-APC-cy7 (BD Pharmingen)购自BD公司。
1.2 肿瘤抗原多肽
肿瘤多肽由本实验室合成，大部分肽由15个氨基酸组成，两两之间有11个氨基酸重叠.纯度>80%。用二甲基亚砜（DMSO）溶解配制成0.4mg/ml/肽的储存液，分装后-70℃保存。
1.3其他试剂
ELISPOT 板(品牌：Millipore；货号：MSIPS4510)购自达科为生物科技有限公司，SIVgag蛋白购自苏州杰恩生物技术有限公司，TMB/E底物（货号：ES001）购自美国Chemicon公司。BCIP/NBT底物（品牌：Pierce；货号：34042）购自广州吉泰生物科技有限公司。链霉素偶联的碱性磷酸酶（品牌：BD PharMingen，货号：554065）购自基因有限公司。
2、实验方法
2.1实验动物和免疫策略
每组10只6-8龄雌性C57BL/6小鼠。DNA疫苗免疫剂量为50ug/100ul/只；腺病毒疫苗免疫剂量为1×10⁹vp/只/100μL，分别在小鼠两侧的股四头肌各注射50μL。共免疫4次，间隔2周。免疫2次DNA疫苗后（即4周），每组随机取4只，处死，进行免疫检测。剩余4只继续注射重组腺病毒疫苗。
2.2 多色流式技术检测多功能 T 细胞
1）分离好的PBMC细胞计数后调整至2×10⁶/ml，加入到96孔培养板,每孔200ul。培养基为R10。
2）在上述细胞悬液中加入特异性抗原肽，阴性对照孔加入相应浓度的DMSO，阳性对照加入佛波酯（PMA）（20ng/ml）+离子霉素（1000ng/ml）。
3）37 ℃, 5％CO₂培养1-2h。
4）加入布雷菲德菌素（BFA）（10μg/ml）混匀。
5）37 ℃, 5％ CO₂培养16h。
6）吹打均匀细胞，转移至流式管中（12×75mm聚苯乙烯管）。加入1ml 流式洗液。混匀后300g室温离心10分钟。
7）弃上清。分别加入细胞表明标记抗体，如anti-CD3-PerCP, anti-CD4-FITC and anti-CD8-APC，振荡2－3秒。
8）室温避光放置25－30分钟。
9）加入3ml FACS 洗液。混匀后300g室温离心10分钟。
10）重复洗涤一次。
11）振荡均匀细胞，然后加入250μl 细胞固定/通透液（cytofix/cytoperm，品牌：BD；货号：554722），混匀。
12）4℃，避光反应20min。
13）加入1ml 1×细胞通透/洗涤液（perm/wash，品牌：BD Biosciences；货号：554723。产品为10倍，用之前用无菌蒸馏水稀释至1倍），400g，离心8min。弃上清。
14）重复一次。
15）弃上清，加入anti-IFN-γ-PE, anti-TNF-α-PE-cy7, anti-IL-2-APC-cy7，混匀。
16）4℃避光30－60分钟。
17）加入1ml 1×细胞通透/洗涤液（perm/wash），400g，离心8min。
18）弃上清，加入1ml 流式洗液。混匀后400g室温离心10分钟。
19）吸走大部分上清，约留300μl。振荡混匀后上机。
20）在FACSAria上检测，用Cell Quest软件获取数据，然后用Modfit软件分析。
2.3IFN-γ酶联免疫斑点技术
第一天：取一管包被抗体（抗鼠IFN-γ 抗体对其中包含有这个抗体，品牌：BD，PharMingen；克隆号为R4-6A2）用无菌PBS（pH7.2-7.4）1:100稀释，100μl/孔加入到96孔 PVDF膜板，4℃包被过夜。
第二天：甩去液体，用无菌PBS洗涤3次，每孔加入200μl R10完全培养基，37℃封闭 2小时。封闭期间分离PBMC。采用95%稀释的淋巴细胞分离液（商品名为opti-prep）分离淋巴细胞。弃去封闭液，每孔加入100μl PBMC。实验中设阳性对照组（ConA组），特异肽，空白对照（DMSO）。在37℃ 5%CO2培养箱中孵育。
第三天： 24h后，弃去细胞悬液，用无菌PBST 220μl/well洗涤6次。甩去洗液，在无菌干燥纸上扣干。用含5％FBS的PBST按1:400稀释检测抗体（生物素标记的抗鼠IFN-γ 抗体），100μl/well，4℃过夜。
第四天：用无菌PBST 220μl/孔洗涤4次。甩去洗液，在无菌干燥纸上扣干。配置链霉素偶联的碱性磷酸酶：用含5％FBS的PBST按1:2500稀释链霉素偶联的碱性磷酸酶，100μl/孔，37℃，2小时。处理BCIP/NBT底物（Pierce, Cat：34042）,37℃温浴30min。用无菌PBST 220μl/孔洗涤5次，甩去洗液，在无菌干燥纸上扣干。加入BCIP/NBT底物，100μl/孔，避光反应7min。弃去底物，用水洗涤2次。风干读板。
2.4 ELISA检测特异性结合抗体
1）用肿瘤蛋白包板，浓度为1ug/ml，过夜。
2）弃包被蛋白， PBST洗3遍，每次5min。
3）4%的脱脂奶粉封闭1h。
4）4%的脱脂奶粉2倍比稀释待检测的小鼠血清，每孔100ul，37℃，2小时。
5）弃血清，PBST洗3遍，每次5min。
6）辣根过氧化物标记山羊抗小鼠1：5000稀释，每孔100ul，37℃，1小时。
7）弃上清，PBST洗3遍，每次5min。
8）加入TMB/E显色，每孔100ul，室温避光10min。
9）加入1mol/L硫酸终止反应。
10）读板。使用Synergy? HT Multi-Mode Plate Reader (BioTek Instruments, Inc., Vermont, USA)在450nm吸光值下读板。
3．实验结果
3.1PRAME-LC3b融合蛋白可以诱发更强的抗原特异性的细胞免疫反应
比较了PRAME和PRAME-LC3b在小鼠体内的免疫源性，ELISPOT检测IFN-γ的分泌情况。如图2所示，在加强免疫后，免疫PRAME-LC3b组诱发的更强的免疫反应，与免疫PRAME组比较，产生的斑点显著增多，差异极显著（p<0.0001）。
3.2PRAME-LC3b融合蛋白诱发更强更多功能性的CD4+ T淋巴细胞免疫反应
ELISPOT检测的是总IFN-γ的量，进一步检测CD4+ T，CD8+ T细胞抗原特异性的免疫反应。图3中A和B是诱发的CD4+ T细胞反应，免疫PRAME-LC3b组的CD4+ T分泌IFN-γ，TNF-α，IL-2的能力显著高于免疫PRAME组（p<0.001，图3中A）；分泌细胞因子IFN-γ/ TNF-α，IFN-γ/ IL-2，IFN-γ/ TNF-α/ IL-2的多功能性CD4+ T细胞的也均高于PRAME组，多功能性CD4+ T细胞具有更显著的杀伤作用（图3中B）。更有意义地是，该融合策略诱发更强的CD8+ T淋巴细胞免疫反应（如图3中C和D），功能性CD8+ T细胞在杀伤肿瘤细胞中的作用是非常重要的。
实施例3、携带肿瘤融合抗原的重组腺病毒在小鼠肿瘤模型中起到了良好的杀伤肿瘤细胞的作用
3.1肿瘤细胞和小鼠肿瘤模型
小鼠Lewis 肺癌细胞（LLC）细胞购买于中国科学院上海细胞库。按照常规方法培养扩增，收获处于对数生长期的80～90%融合的Lewis 肺癌细胞（LLC）细胞，用不含小牛血清的培养液冲洗两次并制成浓度为5×10⁶/mL的细胞悬液，于C57BL/6的右上腋皮下注射LLC细胞5×10⁵（0.1mL）/只，建立小鼠肺癌模型。注射后继续饲养，每天观察小鼠进食、精神、活动状态及肿瘤生长的情况。
3.2 重组腺病毒在小鼠体内的抗肿瘤实验
6-8龄雌性C57BL/6小鼠，小鼠随机分成4组，每组10只。(1)Ad5空载体组；（2）Ad5-PRAME组；（3）Ad5-PRAME-LC3b组；（4）Lc3b组。将上述腺病毒分别在接种肿瘤细胞后第3、5、7天在瘤周多点注射，10⁹vp/只。每2天测量肿瘤的最大纵径（a）及最大横径（b）1次，计算肿瘤近似体积（V），公式为V=0.5×a×b²，绘制生长曲线，并计算实验组的抑瘤率，肿瘤抑瘤率=（对照组平均肿瘤体积-实验组平均肿瘤体积）/对照组平均肿瘤体积×100%。同时观察各组小鼠生存时间，绘制生存曲线。
3.3评估肿瘤转移实验，
如3.2实验，对小鼠进行接种肿瘤和免疫，其中（5-6）×105（0.1mL）LLC 细胞在C57BL/6的右腋皮下单点注射。35天后，处死小鼠，检测在小鼠肺脏中的肿瘤转移灶数目。
对小鼠接种Lewis 肺癌细胞（LLC）进行观察。观察24 天发现，相比Ad5-PRAME免疫组，Ad5-PRAME-LC3b免疫组的肿瘤受到明显抑制，这些小鼠体内的肿瘤体积明显缩小（图4中A）。而且Ad5-PRAME-LC3b免疫组的肿瘤转移明显收到抑制，而其他对照组都有很明显的肿瘤皮下转移灶和肝脏弥漫性转移灶（如图4中B）。
以上实施例表明：通过将肿瘤特异抗原与自噬基因融合，并利用腺病毒载体高效率感染机体APC细胞，二者协同作用可增强机体对肿瘤靶标抗原的免疫应答水平，具有明显的抗肿瘤效果。
以上实施例仅为介绍本发明的优选案例，对于本领域技术人员来说，在不背离本发明精神的范围内所进行的任何显而易见的变化和改进，都应被视为本发明的一部分。
<110>  红土生物科技有限公司
 
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1               5                   10                  15     
 
 
Met Ser Val Trp Thr Ser Pro Arg Arg Leu Val Glu Leu Ala Gly Gln
            20                  25                  30         
 
 
Ser Leu Leu Lys Asp Glu Ala Leu Ala Ile Ala Ala Leu Glu Leu Leu
        35                  40                  45             
 
 
Pro Arg Glu Leu Phe Pro Pro Leu Phe Met Ala Ala Phe Asp Gly Arg
    50                  55                  60                 
 
 
His Ser Gln Thr Leu Lys Ala Met Val Gln Ala Trp Pro Phe Thr Cys
65                  70                  75                  80 
 
 
Leu Pro Leu Gly Val Leu Met Lys Gly Gln His Leu His Leu Glu Thr
                85                  90                  95     
 
 
Phe Lys Ala Val Leu Asp Gly Leu Asp Val Leu Leu Ala Gln Glu Val
            100                 105                 110        
 
 
Arg Pro Arg Arg Trp Lys Leu Gln Val Leu Asp Leu Arg Lys Asn Ser
        115                 120                 125            
 
 
His Gln Asp Phe Trp Thr Val Trp Ser Gly Asn Arg Ala Ser Leu Tyr
    130                 135                 140                
 
 
Ser Phe Pro Glu Pro Glu Ala Ala Gln Pro Met Thr Lys Lys Arg Lys
145                 150                 155                 160
 
 
Val Asp Gly Leu Ser Thr Glu Ala Glu Gln Pro Phe Ile Pro Val Glu
                165                 170                 175    
 
 
Val Leu Val Asp Leu Phe Leu Lys Glu Gly Ala Cys Asp Glu Leu Phe
            180                 185                 190        
 
 
Ser Tyr Leu Ile Glu Lys Val Lys Arg Lys Lys Asn Val Leu Arg Leu
        195                 200                 205            
 
 
Cys Cys Lys Lys Leu Lys Ile Phe Ala Met Pro Met Gln Asp Ile Lys
    210                 215                 220                 
 
 
Met Ile Leu Lys Met Val Gln Leu Asp Ser Ile Glu Asp Leu Glu Val
225                 230                 235                 240
 
 
Thr Cys Thr Trp Lys Leu Pro Thr Leu Ala Lys Phe Ser Pro Tyr Leu
                245                 250                 255    
 
 
Gly Gln Met Ile Asn Leu Arg Arg Leu Leu Leu Ser His Ile His Ala
            260                 265                 270        
 
 
Ser Ser Tyr Ile Ser Pro Glu Lys Glu Glu Gln Tyr Ile Ala Gln Phe
        275                 280                 285            
 
 
Thr Ser Gln Phe Leu Ser Leu Gln Cys Leu Gln Ala Leu Tyr Val Asp
    290                 295                 300                
 
 
Ser Leu Phe Phe Leu Arg Gly Arg Leu Asp Gln Leu Leu Arg His Val
305                 310                 315                 320
 
 
Met Asn Pro Leu Glu Thr Leu Ser Ile Thr Asn Cys Arg Leu Ser Glu
                325                 330                 335    
 
 
Gly Asp Val Met His Leu Ser Gln Ser Pro Ser Val Ser Gln Leu Ser
            340                 345                 350        
 
 
Val Leu Ser Leu Ser Gly Val Met Leu Thr Asp Val Ser Pro Glu Pro
        355                 360                 365            
 
 
Leu Gln Ala Leu Leu Glu Arg Ala Ser Ala Thr Leu Gln Asp Leu Val
    370                 375                 380                
 
 
Phe Asp Glu Cys Gly Ile Thr Asp Asp Gln Leu Leu Ala Leu Leu Pro
385                 390                 395                 400
 
 
Ser Leu Ser His Cys Ser Gln Leu Thr Thr Leu Ser Phe Tyr Gly Asn
                405                 410                 415    
 
 
Ser Ile Ser Ile Ser Ala Leu Gln Ser Leu Leu Gln His Leu Ile Gly
            420                 425                 430        
 
 
Leu Ser Asn Leu Thr His Val Leu Tyr Pro Val Pro Leu Glu Ser Tyr
        435                 440                 445            
 
 
Glu Asp Ile His Gly Thr Leu His Leu Glu Arg Leu Ala Tyr Leu His
    450                 455                 460                
 
 
Ala Arg Leu Arg Glu Leu Leu Cys Glu Leu Gly Arg Pro Ser Met Val
465                 470                 475                 480
 
 
Trp Leu Ser Ala Asn Pro Cys Pro His Cys Gly Asp Arg Thr Phe Tyr
                485                 490                 495    
 
 
Asp Pro Glu Pro Ile Leu Cys Pro Cys Phe Met Pro Asn
            500                 505                
 
 
<210>  5
<211>  1914
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  5
atggaacgaa ggcgtttgcg gggttccatt cagagccgat acatcagcat gagtgtgtgg       60
 
acaagcccac ggagacttgt ggagctggca gggcagagcc tgctgaagga tgaggccctg      120
 
gccattgccg ccctggagtt gctgcccagg gagctcttcc cgccactctt catggcagcc      180
 
tttgacggga gacacagcca gaccctgaag gcaatggtgc aggcctggcc cttcacctgc      240
 
ctccctctgg gagtgctgat gaagggacaa catcttcacc tggagacctt caaagctgtg      300
 
cttgatggac ttgatgtgct ccttgcccag gaggttcgcc ccaggaggtg gaaacttcaa      360
 
gtgctggatt tacggaagaa ctctcatcag gacttctgga ctgtatggtc tggaaacagg      420
 
gccagtctgt actcatttcc agagccagaa gcagctcagc ccatgacaaa gaagcgaaaa      480
 
gtagatggtt tgagcacaga ggcagagcag cccttcattc cagtagaggt gctcgtagac      540
 
ctgttcctca aggaaggtgc ctgtgatgaa ttgttctcct acctcattga gaaagtgaag      600
 
cgaaagaaaa atgtactacg cctgtgctgt aagaagctga agatttttgc aatgcccatg      660
 
caggatatca agatgatcct gaaaatggtg cagctggact ctattgaaga tttggaagtg      720
 
acttgtacct ggaagctacc caccttggcg aaattttctc cttacctggg ccagatgatt      780
 
aatctgcgta gactcctcct ctcccacatc catgcatctt cctacatttc cccggagaag      840
 
gaagagcagt atatcgccca gttcacctct cagttcctca gtctgcagtg cctgcaggct      900
 
ctctatgtgg actctttatt tttccttaga ggccgcctgg atcagttgct caggcacgtg      960
 
atgaacccct tggaaaccct ctcaataact aactgccggc tttcggaagg ggatgtgatg     1020
 
catctgtccc agagtcccag cgtcagtcag ctaagtgtcc tgagtctaag tggggtcatg     1080
 
ctgaccgatg taagtcccga gcccctccaa gctctgctgg agagagcctc tgccaccctc     1140
 
caggacctgg tctttgatga gtgtgggatc acggatgatc agctccttgc cctcctgcct     1200
 
tccctgagcc actgctccca gcttacaacc ttaagcttct acgggaattc catctccata     1260
 
tctgccttgc agagtctcct gcagcacctc atcgggctga gcaatctgac ccacgtgctg     1320
 
tatcctgtcc ccctggagag ttatgaggac atccatggta ccctccacct ggagaggctt     1380
 
gcctatctgc atgccaggct cagggagttg ctgtgtgagt tggggcggcc cagcatggtc     1440
 
tggcttagtg ccaacccctg tcctcactgt ggggacagaa ccttctatga cccggagccc     1500
 
atcctgtgcc cctgtttcat gcctaacgtc gacaccatgc cgtccgagaa gaccttcaag     1560
 
cagcgccgga gctttgaaca aagagtggaa gatgtccggc tcatccggga gcagcacccc     1620
 
accaagatcc cagtgattat agagcgatac aagggggaga agcagctgcc cgtcctggac     1680
 
aagaccaagt tcctggtgcc tgaccacgtg aacatgagcg agctcatcaa gataatcaga     1740
 
cggcgcttgc agctcaatgc taaccaagcc ttcttcctcc tggtgaatgg gcacagcatg     1800
 
gtgagtgtgt ccactcccat ctccgaagtg tacgagagtg agagagatga agacggcttc     1860
 
ctgtacatgg tttatgcctc gcaggagaca ttcgggacag caatggctgt gtaa           1914
 
 
<210>  6
<211>  1140
<212>  DNA
<213>  human
 
<400>  6
atgcacggcg tcacctctgc cccagacacc aggccggccc cgggttccac tgctcctcca       60
 
gctggatctc acggcgtcac ctctgcccca gacaccaggc cggccccggg ttccactgct      120
 
cctccagctg gatctcacgg cgtcacctct gccccagaca ccaggccggc cccgggttcc      180
 
actgctcctc cagctggatc tcacggcgtc acctctgccc cagacaccag gccggccccg      240
 
ggttccactg ctcctccagc tggatctcac ggcgtcacct ctgccccaga caccaggccg      300
 
gccccgggtt ccactgctcc tccagctgga tctcacggcg tcacctctgc cccagacacc      360
 
aggccggccc cgggttccac tgctcctcca gctggatctc acggcgtcac ctctgcccca      420
 
gacaccaggc cggccccggg ttccactgct cctccagctg gatctcacgg cgtcacctct      480
 
gccccagaca ccaggccggc cccgggttcc actgctcctc cagctggatc tcacggcgtc      540
 
acctctgccc cagacaccag gccggccccg ggttccactg ctcctccagc tggatctcac      600
 
ggcgtcacct ctgccccaga caccaggccg gccccgggtt ccactgctcc tccagctgga      660
 
tctcacggcg tcacctctgc cccagacacc aggccggccc cgggttccac tgctcctcca      720
 
gctggatctc acggcgtcac ctctgcccca gacaccaggc cggccccggg ttccactgct      780
 
cctccagctg gatctcacgg cgtcacctct gccccagaca ccaggccggc cccgggttcc      840
 
actgctcctc cagctggatc tcacggcgtc acctctgccc cagacaccag gccggccccg      900
 
ggttccactg ctcctccagc tggatctcac ggcgtcacct ctgccccaga caccaggccg      960
 
gccccgggtt ccactgctcc tccagctgga tctcacggcg tcacctctgc cccagacacc     1020
 
aggccggccc cgggttccac tgctcctcca gctggatctc acggcgtcac ctctgcccca     1080
 
gacaccaggc cggccccggg ttccactgct cctccagctg gatccaccgg atctagataa     1140
 
 
<210>  7
<211>  1503
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  7
atgcacggcg tcacctctgc cccagacacc aggccggccc cgggttccac tgctcctcca       60
 
gctggatctc acggcgtcac ctctgcccca gacaccaggc cggccccggg ttccactgct      120
 
cctccagctg gatctcacgg cgtcacctct gccccagaca ccaggccggc cccgggttcc      180
 
actgctcctc cagctggatc tcacggcgtc acctctgccc cagacaccag gccggccccg      240
 
ggttccactg ctcctccagc tggatctcac ggcgtcacct ctgccccaga caccaggccg      300
 
gccccgggtt ccactgctcc tccagctgga tctcacggcg tcacctctgc cccagacacc      360
 
aggccggccc cgggttccac tgctcctcca gctggatctc acggcgtcac ctctgcccca      420
 
gacaccaggc cggccccggg ttccactgct cctccagctg gatctcacgg cgtcacctct      480
 
gccccagaca ccaggccggc cccgggttcc actgctcctc cagctggatc tcacggcgtc      540
 
acctctgccc cagacaccag gccggccccg ggttccactg ctcctccagc tggatctcac      600
 
ggcgtcacct ctgccccaga caccaggccg gccccgggtt ccactgctcc tccagctgga      660
 
tctcacggcg tcacctctgc cccagacacc aggccggccc cgggttccac tgctcctcca      720
 
gctggatctc acggcgtcac ctctgcccca gacaccaggc cggccccggg ttccactgct      780
 
cctccagctg gatctcacgg cgtcacctct gccccagaca ccaggccggc cccgggttcc      840
 
actgctcctc cagctggatc tcacggcgtc acctctgccc cagacaccag gccggccccg      900
 
ggttccactg ctcctccagc tggatctcac ggcgtcacct ctgccccaga caccaggccg      960
 
gccccgggtt ccactgctcc tccagctgga tctcacggcg tcacctctgc cccagacacc     1020
 
aggccggccc cgggttccac tgctcctcca gctggatctc acggcgtcac ctctgcccca     1080
 
gacaccaggc cggccccggg ttccactgct cctccagctg gatccatgcc gtccgagaag     1140
 
accttcaagc agcgccggag ctttgaacaa agagtggaag atgtccggct catccgggag     1200
 
cagcacccca ccaagatccc agtgattata gagcgataca agggggagaa gcagctgccc     1260
 
gtcctggaca agaccaagtt cctggtgcct gaccacgtga acatgagcga gctcatcaag     1320
 
ataatcagac ggcgcttgca gctcaatgct aaccaagcct tcttcctcct ggtgaatggg     1380
 
cacagcatgg tgagtgtgtc cactcccatc tccgaagtgt acgagagtga gagagatgaa     1440
 
gacggcttcc tgtacatggt ttatgcctcg caggagacat tcgggacagc aatggctgtg     1500
 
taa                                                                   1503
 
 
<210>  8
<211>  945
<212>  DNA
<213>  human
 
<400>  8
atgcctcttg agcagaggag tcagcactgc aagcctgaag aaggccttga ggcccgagga       60
 
gaggccctgg gcctggtggg tgcgcaggct cctgctactg aggagcagga ggctgcctcc      120
 
tcctcttcta ctctagttga agtcaccctg ggggaggtgc ctgctgccga gtcaccagat      180
 
cctccccaga gtcctcaggg agcctccagc ctccccacta ccatgaacta ccctctctgg      240
 
agccaatcct atgaggactc cagcaaccaa gaagaggagg ggccaagcac cttccctgac      300
 
ctggagtccg agttccaagc agcactcagt aggaaggtgg ccgagttggt tcattttctg      360
 
ctcctcaagt atcgagccag ggagccggtc acaaaggcag aaatgctggg gagtgtcgtc      420
 
ggaaattggc agtatttctt tcctgtgatc ttcagcaaag cttccagttc cttgcagctg      480
 
gtctttggca tcgagctgat ggaagtggac cccatcggcc acttgtacat ctttgccacc      540
 
tgcctgggcc tctcctacga tggcctgctg ggtgacaatc agatcatgcc caaggcaggc      600
 
ctcctgataa tcgtcctggc cataatcgca agagagggcg actgtgcccc tgaggagaaa      660
 
atctgggagg agctgagtgt gttagaggtg tttgagggga gggaagacag tatcttgggg      720
 
gaccccaaga agctgctcac ccaacatttc gtgcaggaaa actacctgga gtaccggcag      780
 
gtccccggca gtgatcctgc atgttatgaa ttcctgtggg gtccaagggc cctcgttgaa      840
 
accagctatg tgaaagtcct gcaccatatg gtaaagatca gtggaggacc tcacatttcc      900
 
tacccacccc tgcatgagtg ggttttgaga gagggggaag agtag                      945
 
 
<210>  9
<211>  1329
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  9
atgcctcttg agcagaggag tcagcactgc aagcctgaag aaggccttga ggcccgagga       60
 
gaggccctgg gcctggtggg tgcgcaggct cctgctactg aggagcagga ggctgcctcc      120
 
tcctcttcta ctctagttga agtcaccctg ggggaggtgc ctgctgccga gtcaccagat      180
 
cctccccaga gtcctcaggg agcctccagc ctccccacta ccatgaacta ccctctctgg      240
 
agccaatcct atgaggactc cagcaaccaa gaagaggagg ggccaagcac cttccctgac      300
 
ctggagtccg agttccaagc agcactcagt aggaaggtgg ccgagttggt tcattttctg      360
 
ctcctcaagt atcgagccag ggagccggtc acaaaggcag aaatgctggg gagtgtcgtc      420
 
ggaaattggc agtatttctt tcctgtgatc ttcagcaaag cttccagttc cttgcagctg      480
 
gtctttggca tcgagctgat ggaagtggac cccatcggcc acttgtacat ctttgccacc      540
 
tgcctgggcc tctcctacga tggcctgctg ggtgacaatc agatcatgcc caaggcaggc      600
 
ctcctgataa tcgtcctggc cataatcgca agagagggcg actgtgcccc tgaggagaaa      660
 
atctgggagg agctgagtgt gttagaggtg tttgagggga gggaagacag tatcttgggg      720
 
gaccccaaga agctgctcac ccaacatttc gtgcaggaaa actacctgga gtaccggcag      780
 
gtccccggca gtgatcctgc atgttatgaa ttcctgtggg gtccaagggc cctcgttgaa      840
 
accagctatg tgaaagtcct gcaccatatg gtaaagatca gtggaggacc tcacatttcc      900
 
tacccacccc tgcatgagtg ggttttgaga gagggggaag aggtcgacac catgccgtcc      960
 
gagaagacct tcaagcagcg ccggagcttt gaacaaagag tggaagatgt ccggctcatc     1020
 
cgggagcagc accccaccaa gatcccagtg attatagagc gatacaaggg ggagaagcag     1080
 
ctgcccgtcc tggacaagac caagttcctg gtgcctgacc acgtgaacat gagcgagctc     1140
 
atcaagataa tcagacggcg cttgcagctc aatgctaacc aagccttctt cctcctggtg     1200
 
aatgggcaca gcatggtgag tgtgtccact cccatctccg aagtgtacga gagtgagaga     1260
 
gatgaagacg gcttcctgta catggtttat gcctcgcagg agacattcgg gacagcaatg     1320
 
gctgtgtaa                                                             1329