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1、10申请公布号43申请公布日21申请号201380032302022申请日20130613102012210183720120618DEC12Q1/68200601G01N27/41420060171申请人西门子公司地址德国慕尼黑72发明人W冈布雷赫特O海登74专利代理机构北京市柳沈律师事务所11105代理人贾静环54发明名称用于分析核酸序列的组件和方法57摘要本发明涉及借助所谓的合成测序法分析核酸序列的组件和方法。根据本发明，检测在核苷酸与待测序的核酸序列结合的过程中释放的化学物质群。借助于喷雾装置将试剂施加至检测所释放的物质群的传感器。这样做的优势在于，不会发生横向流动。假阴性和假阳性结果。
2、的比例得以显著降低。此外，少量的试剂就足以浸润所述传感器。就流动室而言不必要充填输送管道和排放管道。30优先权数据85PCT国际申请进入国家阶段日2014121886PCT国际申请的申请数据PCT/EP2013/0622092013061387PCT国际申请的公布数据WO2013/189818DE2013122751INTCL19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书4页附图3页10申请公布号CN104379767A43申请公布日20150225CN104379767A1/1页21一种借助所谓的合成测序法分析核酸序列的组件，其中能够检测在核苷酸与待测序的核酸序列14结。
3、合的过程中释放的化学物质群，所述组件包括用于检测所释放的物质群的传感器3和用于将试剂11,12,13施加至所述传感器3的喷雾装置1,100。2如权利要求1所述的组件，包括能够相对于所述喷雾装置1,100旋转的传感器支架9。3如前述权利要求中任一项所述的组件，其中将所述传感器3集成进芯片2中。4如前述权利要求中任一项所述的组件，其中所述传感器3为离子选择性场效应晶体管ISFETS3。5如前述权利要求中任一项所述的组件，包括至少两个传感器3。6如权利要求5所述的组件，其中在两个传感器3之间布置疏水边界层17。7如权利要求6所述的组件，其中所述疏水边界层17包括金属，特别是金。8如权利要求6或7所述。
4、的组件，其中所述疏水边界层17为所述离子选择性场效应晶体管ISFETS3的参比电极。9如前述权利要求中任一项所述的组件，其中所述喷雾装置为超声波雾化装置1。10一种借助所谓的合成测序法分析核酸序列的方法，其中将至少一种试剂11,12,13施加至传感器3，其特征在于，将所述试剂11,12,13喷雾在所述传感器3上。11如权利要求10所述的方法，其中所述试剂为含核苷酸的溶液、清洗液或保护液。12如权利要求10或11所述的方法，其中传感器支架9相对于喷雾装置1,100旋转。13如权利要求1012中任一项所述的方法，其中将所述试剂11,12,13作为气溶胶喷雾在所述传感器3上。权利要求书CN10437。
5、9767A1/4页3用于分析核酸序列的组件和方法0001本发明涉及通过所谓的合成测序法SEQUENCINGBYSYNTHESIS分析核酸序列的组件和方法。0002在“下一代测序技术”NGS“NEXTGENERATIONSEQUENCING”的领域中主要追求两个目的。第一，应显著缩短分析的持续时间。这应使分析人类基因组的价格低于1000美元。第二，应保持所获得的数据的质量或者进而在进行快速分析的同时进一步改进数据的质量。0003所述NGS方法包括合成测序SEQUENCINGBYSYNTHESIS，例如焦磷酸测序PYROSEQUENCING和“离子半导体测序”“IONSEMICONDUCTORSE。
6、QUENCING”。0004焦磷酸测序的基础是在DNA链中纳入核苷酸。提供作为结合至微球或“微珠”的单链形式的待测序的DNA并将其用作模板。一个接一个地加入四种类型的核苷酸。当添加匹配模板的核苷酸时，通过DNA聚合酶会释放焦磷酸盐PYROPHOSPHATE。这导致了由酶级联而触发的闪光，其可以光学的方式被检测到。为了能平行分析，将微球布置在阵列中的微凹部MICRODEPRESSIONS或“微孔”中。然后分析各个孔的光学信号。0005离子半导体测序法也是基于核苷酸的纳入。质子的释放表明DNA矩阵MATRIX链中成功地纳入了核苷酸。为此，具体地，使用化学敏感场效应晶体管CHEMICALLYSENS。
7、ITIVEELDEFFECTTRANSISTORSCHEMFETS其也被称为离子选择性场效应晶体管IONSELECTIVEELDEFFECTTRANSISTORSISFETS来测量PH值。0006US2009/0026082A1则结合了这两种方法。在该过程中，将具有DNA单链的微球布置在凹部。借助于由CHEMFET测得的PH值来检测各个核酸的装配INSTALLATION。0007所述测序技术需要大量的不同试剂，其被相继输送至相应的分析单元。这些试剂特别包括四种类型的核苷酸中的一种或核苷三磷酸NTP。试剂的进料通常在流动室FLOWCELLS中进行。此处发生的试剂在传感器阵列上方的横向流动对焦磷酸。
8、盐PYROPHOSPHATE物质群或所释放的质子是不利的。这些物质可以在流动方向上从第一凹部流向第二凹部并在那里导致假阳性的结果。此外，由于横向的流动，在第一凹部形成了测试组分的浓度的降低，这导致了假阴性的结果。质子扩散远离CHEMFET也会导致极低的PH值变化并且会不利地导致假阴性的结果。此外，不利的是，由于极小的测量效果，使得对均聚物的分辨率不足。此处的均聚物指的是类型相同的几个核苷酸附着在一起。0008上述测序技术的另一缺点是试剂的高使用率。这是因为必须将每种新的试剂充满包括所有输送管道和排放管道的流动室的整个体积。此外，阵列上方的液体层的厚度必须为约100M以使新的试剂能够被输送至阵列。
9、中所有的凹部。0009本发明的目的是提供克服上述缺点的用于分析核酸序列的组件和方法。0010与组件相关的这一目的是通过权利要求1所述的组件来实现的。与方法相关的目的是通过具有权利要求10的特征的方法来实现的。从属权利要求涉及本发明的优选的实施方式。0011根据本发明的组件被设计用来通过所谓的合成测序法分析核酸序列。在通过合成的核酸序列的测序中，检测在核苷酸与待测序的核酸序列结合的过程中释放的化学物质说明书CN104379767A2/4页4群。为此，该组件包括用于检测所释放的物质群的传感器。最后，该组件包括用于将试剂施加至该传感器的喷雾装置SPRAYINGDEVICE。0012在本发明的通过合成。
10、测序法分析核酸序列的方法中，将至少一种试剂施加至该传感器。以将试剂喷雾到所述传感器上的方式来施加试剂。0013在该组件和该方法中，有利的是不会发生横向流动。因此，有利的是减少了假阴性和假阳性的结果。因此，获得了更大的测量效果从而改善了均聚物的分析。此外，少量的试剂就足以完全浸润传感器。传感器上试剂的液体层的厚度优选为1M。另外，对于流动室来说无需充填输送管道和排放管道。这也有利地减少了试剂的使用。0014在本发明优选的发展和构造中，组件包括被设置成可相对于所述喷雾装置旋转的传感器支架。将传感器牢靠地连接在所述传感器支架上。有利的是，甚至通过旋转传感器支架来实现传感器的浸润。此外，通过高速的旋转。
11、可将过量的试剂，特别是清洗液运送至传感器支架的外边缘。优选地，在施加含核苷酸的试剂期间不旋转或仅是缓慢地旋转所述传感器支架。由此，有利地防止了横向流动。有利的是，在传感器支架中可内置电子装置，其接收来自于所述传感器的电子的传感信号并将它们传递至外部的测量值记录系统。0015所述传感器被适当地集成进芯片中。0016在本发明另一有利的实施方式和发展中，传感器为离子选择性场效应晶体管ISFET。由此，在合成期间可以检测所释放的质子。在进行分析之前，将待测序的核酸序列连同引物一起施加至ISFET。此外，将用于核酸合成的酶加入待测序的核酸序列中。在核酸序列为DNA的情况下，例如添加DNA聚合酶。在其它核。
12、酸序列的情况下，添加相应的合成酶。可替代地或额外地，可使用测量化学发光光信号CHEMILUMINESCENCELIGHTSIGNAL的传感器。优选地，所述传感器测量由以焦磷酸盐的释放为基础的酶级联产生的光信号。0017在本发明又一有利的实施方式和发展中，组件包括两个传感器。因此，有利的是可同时进行多个测量，从而可实施众多序列的快速、平行的检测。有利地，在一个操作中同时对两个传感器进行试剂的喷雾。优选将传感器布置在传感器阵列中。0018在本发明另一有利的实施方式和发展中，在每两个传感器之间布置疏水的边界层。该疏水边界层用作传感器上试剂的隔离。由此，有利地防止了相邻排列的传感器上的试剂的交错RUN。
13、NINGTOGETHER。此外，有利地避免了将待测序的核酸布置在微孔中。0019在本发明又一有利的实施方式和发展中，疏水边界层包括金属，特别是金。0020在本发明另一有利的实施方式和发展中，疏水边界层为用于离子选择性场效应晶体管的参比电极REFERENCEELECTRODE。有利的是，随后布置所述参比电极使其在空间上接近传感器。因此，在传感器和参比电极之间仅产生小的电阻，从而有利地降低了信号噪音。0021在本发明又一有利的实施方式和发展中，喷雾装置为超声波雾化器ULTRASONICATOMIZER。有利的是，由此可实现小于1M的雾滴尺寸DROPLETSIZES。0022在本发明另一有利的实施方。
14、式和发展中，试剂是含核苷酸的溶液、清洗液或保护液。有利的是，在用于分析核酸序列的方法中首先将含核苷酸的溶液，特别是DNTP溶液施加至传感器。该溶液仅含一种类型的核苷酸。在施加含核苷酸的溶液期间可缓慢地旋转传感器支架。有利地是，施加核苷酸溶液的方式使得在每个传感器上形成与其相邻的传感说明书CN104379767A3/4页5器局部分离的液体体积，并且所述液体体积在传感器和参比电极的边缘之间形成电化学接触。如果待测序的核酸序列纳入所述核苷酸，那么之后就产生了质子。这些质子仅在各自的传感器中产生信号。从而有利地防止质子从第一传感器向第二传感器转移CARRYOVER。在接受信号之后，优选显著增加旋转速度。
15、并将通常体积大于核苷酸溶液的清洗液喷雾至传感器并离心SPUNOFF。清洗液通常为能完全除去第一溶液中存在的核苷酸的类型。旋转传感器支架直至清洗液几乎全干。随后，将作为试剂的另一含核苷酸的溶液喷雾至传感器。所述含核苷酸的溶液也只包含一种类型的核苷酸。随后，再次通过清洗液除去含核苷酸的溶液。0023可替代地，传感器可设有保护液。所述液体包括水溶性成膜剂WATERSOLUBLELMFORMINGAGENT，其有利地防止了所释放的物质群在测序期间的横向扩散。0024在本发明另一有利的实施方式和发展中，将所述试剂作为气溶胶喷雾在传感器上。0025通过参考在附图中示出的示例性的实施方式将对本发明进行更详细。
16、的描述。0026图1示出了使用ISFET传感器和参比电极来分析核酸序列的组件的示意图。0027图2示出了用于分析核酸序列的方法的示意图。0028图3示出了使用ISFET传感器和使用疏水边界结构作为参比电极来分析核酸序列的组件的示意图。0029图1示出了用于核酸合成的组件的示意图。该组件包括超声波雾化装置1、微阵列芯片2、传感器支架9和用于旋转的电动机10。微阵列芯片2包括离子选择性场效应晶体管ISFETS3、参比电极4和信号处理单元5。使用第一装置6将所述微阵列芯片2固定至传感器支架9。所述第一装置优选为夹紧装置CLAMPINGDEVICE。可替代地，可以通过负压将所述微阵列芯片2固定至传感器。
17、支架9。阵列的面积通常为1CM2，其中阵列优选包括多达1,000,000个传感器。传感器支架9包括电源8和针对ISFETS3的数据处理单元7。通过超声波雾化装置1将第一试剂11喷雾在微阵列芯片2上。所述第一试剂通常为清洗液。0030由于使用相对大体积的清洗液，因此可替代的是以喷射的形式从喷嘴中喷雾所述清洗液。将第一试剂11喷雾至微阵列芯片2的同时旋转电动机10。由于旋转，第一试剂11均匀地分布在微阵列芯片2上。随后增加转速以将第一试剂11径向甩出。通过改变旋转速度可以设置所限定的干燥状态。0031图2示意性地示出了用于操作分析核酸序列用的组件的方法。该组件对应于图1所示的布置。所述微阵列芯片2。
18、还包括主动的ISFETSACTIVEIONSELECTIVEELDEFFECTTRANSISTORS18和被动的PASSIVEISFETS19。主动的ISFETS18包括含用于DNA合成的引物的DNA序列14。此外，使DNA聚合酶结合至待查的DNA序列14。所述微阵列芯片2优选包括主动的ISFETS18。0032在使用第一试剂11清洗微阵列芯片2并且接下来干燥所述微阵列芯片2之后，在下一步骤中将第二试剂13保护液施加至微阵列芯片2。保护液通常为洗涤缓冲液，其含有增加粘度的物质，特别是成膜剂，例如聚乙烯吡咯烷酮POLYVINYLPYRROLIDONE。设置电动机10的转速使得含第二试剂13的第一。
19、层21优选具有1M的厚度。0033如图2中的A部分所示，将第三试剂12施加至含第二试剂13的第一层21。第三说明书CN104379767A4/4页6试剂12包括第一核苷酸类型通常为腺嘌呤，胸腺嘧啶，胞嘧啶或鸟嘌呤，各自作为脱氧核苷三磷酸DNTP。此时，第三试剂12基本上垂直地细密分布在第一层21上。设置电动机10的转速使得含第三试剂12的第二层20优选具有1M的厚度。0034在施加第三试剂12之后将电动机10减速。第三试剂12在垂直于层平面的方向上均匀地扩散进第一层21中。由第二试剂13和第三试剂12形成了混合层15。这在图2中的B部分被示出。0035第三试剂12中的核苷酸可以与待查的DNA序。
20、列14连接。这在图2中的C部分被示出。通过与引物14相匹配的核苷酸的连接ATTACHMENT，质子被释放。借助于ISFET传感器可以测量质子的浓度。所测量的变量即为PH值。由于横向的扩散被成膜剂所限制，从而在很大程度上防止了所释放质子的转移。在核苷酸顺利地连接于引物14的情况下产生了信号16。0036在信号处理之后，显著增加旋转速度并且再次施加作为第一试剂11的清洗液。由此，微阵列芯片2得以被液体或试剂清洗。可替代的是，通过超声波雾化装置1喷雾潮湿的空气来清洗传感器。0037在接下来的步骤中，施加作为保护液的第二试剂13并且施加含第二核苷酸类型的第三试剂12。由于液体的垂直施加以及相关的横向扩。
21、散的预防，因此不会发生转移。0038图3示出了可替代的用于分析核酸序列的组件的示意图。该组件包括用于雾化试剂的喷嘴装置100、微阵列芯片2和用于旋转的电动机10、信号处理单元5、电源8和数据处理单元7。微阵列芯片2包括场效应晶体管3。通过疏水边界层17将各个ISFETS3彼此分离开来。所述疏水边界层17含金。因此它可以用作各个ISFETS3的参比电极。微阵列芯片2还包括主动的ISFETS18和被动的ISFETS19。将含核苷酸的第三试剂12雾化在微阵列芯片2上。通过缓慢地旋转传感器支架9使得第三试剂分布在微阵列芯片2上。疏水边界层17防止了多个ISFETS上的第三试剂12流淌到一起。所形成的雾滴具有约1M3的尺寸。0039在待查的DNA14顺利纳入第三试剂12中的核苷酸的情况下，借由所释放的质子产生信号16。在顺利地处理完信号16之后，将作为清洗液的第一试剂11喷雾在微阵列芯片2上。通过高速旋转，微阵列芯片2得以被第三试剂3清洗。在清洗完成之后这可由PH信号来确定，喷雾含另一核苷酸类型的第四试剂。以这种方式，使得快速的流程执行因短时喷雾在秒的范围内而成为可能。说明书CN104379767A1/3页7图1说明书附图CN104379767A2/3页8图2说明书附图CN104379767A3/3页9图3说明书附图CN104379767A。