一种降解原油细菌及其应用.pdf

本发明涉及一种降解原油细菌及其应用，该菌株为枯草芽孢杆菌，命名为Bacillus subtilis1098-4，保藏号为CGMCC No.9844，其16S rRNA序列如SEQ ID NO.1所示。应用于降解原油。该枯草芽孢杆菌1098-4利于原油降解，以原油为唯一营养源生长，可在1-2天内完全降解土壤及水中原油污染。

权利要求书
1.  一种降解原油细菌，其特征在于：该菌株为枯草芽孢杆菌，命名为Bacillus subtilis 1098-4， 保藏号为CGMCC No.9844，其16S rRNA序列如SEQ ID NO.1所示。

2.  一种如权利要求1所述的降解原油细菌的应用，其特征在于：应用于降解原油，具体为： 将菌株接种于培养基中，37℃条件下，培养1-2天。

3.  根据权利要求2所述的一种降解原油细菌的应用，其特征在于：所述培养基为：每100ml 培养基中胰蛋白胨1.0g，氯化钠0.5g，原油10g，100ml去离子水，pH 7.0-7.2。

说明书一种降解原油细菌及其应用
技术领域
本发明属于生物降解原油材料及其应用领域，特别涉及一种降解原油细菌及其应用。
背景技术
石油及其产品在开采、炼制、贮运和使用过程中进入环境会造成严重污染；其中溢油污 染危害最大，石油泄漏被称为海洋污染的超级杀手。全世界因油轮事故溢入海洋的石油每年 约为39万吨(王传远等，2009)。近年来中国每年排入大海的石油约12万吨，中国近海海域 石油的平均质量浓度已达到0.055mg/L，而且污染正日趋加剧。除营养盐之外，石油烃已成 为世界海洋(尤其是浅海)的主要污染物(Al-Majed et al.2012)。随着我国经济发展和能源 战略的确定,海运将会有一个更大的发展。同时船舶溢油污染的潜在威胁也在同步增加。上 海港从1999年至2009年共发生各类船舶油类污染事故173起，油类累计泄漏量达2619.51 吨，平均每年发生污染事故15.73起，每年污染物泄漏量达238.14吨(陈维，2010)。
目前处理溢油的方法有物理法、化学法和生物法(King et al.2014)。化学法由于使用化学试 剂毒性大，造成生态环境危害，难以大范围广泛利用。物理法主要有围栏法、撇油器法、吸 油材料法、活性炭吸附过滤法等，其中吸附剂处理是最经济有效的方法。这些物理主要是应 对大规模、大范围的海面石油泄漏事故，通过物理措施将原油吸收、捕捉后再进行分离、回 收。但对于汽、煤、柴油等轻质油及大规模处理后残余量油，因其密度小、黏度小，在海面 扩散速度快等特点，目前工艺方法难以奏效。这些油在海面形成大片油膜，阻隔了大气和海 水之间的自由交换，妨碍空气溶解到海水中去，使水中氧减少。影响海洋植物及藻类的光合 作用，对海洋生物、渔业、水产养殖业带来严重危害，另一方面它易粘附到其他物体上或漂 到做为疗养性地的海滨，影响优美的环境，导致海洋光量下降(桂客，2011)。
以油作为生长底物的细菌清除油污作为主要的生物处理工艺，其修复过程具有安全性高、 经济性强、应用范围广、去除效率高和无明显的二次污染等显著优点(Wiszniowski et al.2011)。 然而细菌个体小，移动性能差，单纯细菌在油污自然环境下存活期短生长慢，在实践应用上 自主性差，与目标接触慢等缺点，限制了该工艺在实际中的应用(Wang et al.2013)。因此开 发出新的溢油清除菌，对于减轻油污污染，维护环境尤为重要(杨伟华等，2004)。生物界有 着十分丰富的微生物资源，人们对微生物的认知还仅仅局限在一小部分当中。因此，还有大 量的具有开放潜力的生物表面活性剂菌种未被发现。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种降解原油细菌及其应用，该枯草芽孢杆菌1098-4 利于原油降解，以原油为唯一营养源生长，可在1-2天内完全降解土壤及水中原油污染。
本发明的一种降解原油细菌，该菌株为枯草芽孢杆菌，命名为Bacillus subtilis 1098-4， 保藏号为CGMCC No.9844，其16S rRNA序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)1098-4，于2014年10月27日保藏于中国微 生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.9844。
本发明的一种降解原油细菌的应用，应用于降解原油，具体为：将菌株接种于培养基中， 37℃条件下，培养1-2天。
所述培养基为：每100ml培养基中胰蛋白胨1.0g，氯化钠0.5g，原油10g，100ml去离子水， pH 7.0-7.2。
本发明就是分离出一株高效降解原油的细菌菌株，并利用该菌株进行原油污染水体除油 效果。
根据BLAST聚类分析及形态学鉴定结果，将该菌株定命名为Bacillus subtilis1098-4。该 菌经发明人检测产生表面活性剂，这种功能国内外已经发现菌株是前所未见或未有应用的， 要求保护该菌株。
本发明提供的枯草芽孢杆菌1098-4的特征如下：
该菌菌落表面干躁，边缘不整齐；呈乳白色不透明；呼吸类型为好氧呼吸，在有氧条件 下生长良好，革兰氏染色呈阳性，形态观察菌体圆柱形杆状，菌体长度为1.717μm。测定菌 株的16S rRNA部分序列，进行系统发育学分析(菌株的16S rRNA全序列见附表)。
有益效果
本发明的枯草芽孢杆菌1098-4利于原油降解，以原油为唯一营养源生长，可在1-2天内 完全降解土壤及水中原油污染，需要成本低，对环境友好。
附图说明
图1枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)1098-4菌株降解原油效果，其中a为加菌前油污染水状 态；b为培养24小时后状态；c为培养48小时后状态；
图2枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)1098-4菌株16S rRNA序列系统发育树。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不 用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可 以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1
新菌株枯草芽孢杆菌1098-4(Bacillus subtilis1098-4)，已保藏在中国微生物菌种保藏管理 委员会普通微生物中心，其保藏编号是：CGMCC No.9844。
菌种来源：
(1)富集 取油土样按5％的接种量接种到富集培养基(牛肉膏0.5g、蛋白胨1g、氯化钠0.5 g,去离子水100mL，pH7.0～7.6)中，于37℃、180rpm培养48h。
(2)初筛 取富集液100μL涂布于油平板(以原油为唯一碳源的无机盐培养基)，37℃培养筛 选出生长的单菌落，挑选出有噬油斑的菌落接种于斜面上。
(3)复筛 将初筛得到的菌种活化后接种于发酵培养基中37℃、180rpm培养，发酵液离心后 测其表面张力，重复几次做进一步的分离纯化，最后获得菌株1098-4。
菌种鉴定：
(1)菌落形态观察 将菌株Bacillus subtilis 1098-4在LB平板上进行划线分离，24h后观察菌 落的形状、颜色、表面质地、菌落边缘等并记录。
(2)菌体形态观察 将菌株Bacillus subtilis 1098-4制片，进行革兰式染色，用带拍摄装置的 光学显微镜观察菌体的形状、大小、及其特殊构造。
(3)电镜观察 将菌株Bacillus subtilis 1098-4在LB培养基中培养24h，用phenon-world台式 扫描电子显微镜进行观测和拍摄。实验方法如下：
①收集菌体：8000rpm离心5min收集菌体,弃上清；
②固定、脱水：加2.5％戊二醛固定2h，再用PH为7.2的磷酸盐缓冲液固定20-30min；
③干燥：加入蒸馏水稀释，充分混合后用滴管取混合液10-20mL于盖玻片上吸附2min，用滤 纸吸去多余溶液；
④喷金：加0.1％戊二醛固定1h，再用0.5％戊二醛置换2h，用蒸馏水洗后用70％、90％、100％ 的乙醇依次脱水，每次5-10min。最后用双面胶将载玻片黏在样品台上，喷金，电镜观察。(4) 分子鉴定
①菌株DNA的提取方法
A、取1ml细菌过夜培养液移至1.5mL的Eppendorf管中，5000rpm离心10分钟，去上清 液；
B、立即加入600μL预热的提取缓冲液，混匀后，65℃温浴1h；
C、冰浴冷却(5分钟)，加入600μL酚/氯仿(1:1)溶液，颠倒混匀后，静置10min，然后12000rpm 离心6min；
D、上清转移至另一个Eppendorf管中，加入等体积氯仿，静置5min，12 000rpm离心5min；
E、取上清液，加入等体积异丙醇，沉淀DNA；
F、用玻棒捞出DNA沉淀，70％乙醇漂洗后，吸干，溶解于500μLTE或重蒸水中，-20℃保 存。如DNA沉淀无法捞出，可5000rpm离心，使DNA沉淀；
②16S rRNA的基因扩增
A、PCR反应引物AGAGTTTGATCCTG GCTCAG/AAGGAGGTGATCCAGCCGC
B、在冰上建立PCR反应体系：
10×扩增缓冲液 5μL 引物(AGAGTTTGATCCTG GCTCAG/AAGGAGGTGATCCAGCCGC) 各50pmol dNTP 各200μmoL/L 模板DNA 0.1～2μg Taq DNA聚合酶 1U Mg2+ 1.5mmol/L 加双或三蒸水至 50μL
94℃预变性5min；94℃变性60sec；55℃复性30sec；72℃延伸90sec；32个循环， 72℃下延伸为双链10min。最后将系统稳定在4℃。取3μL的PCR产物，在1％的琼脂糖凝 胶100V下电泳30min，电极缓冲液为0.5×TAE，然后用溴化乙锭(EB)染色检验扩增产物。 扩增产物由上海生工生物工程有限公司完成。
(6)所得序列的分析
序列同源性搜索使用Blast进行在NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)中进行。并 应用MEGA 4.0(Molecular Evolutionary Genetics Analysis,version 4.0)对其进行分子进化系统 发育树分析。
实施例2
将过夜用LB培养基培养Bacillus subtilis1098-4 1mL加入灭菌处理的三角瓶中(内含胰 蛋白胨1.0g，氯化钠0.5g，原油10g，水100mL,pH 7.0-7.2)，37℃培养，观察原油降解情 况照相。培养2天后，水中污染原油全部被降解。