一种鉴定肝素制品动物物种来源的方法 【技术领域】
本发明涉及一种鉴定肝素制品动物物种来源的方法。
背景技术
肝素是从猪、牛、羊动物组织提取的具有抗凝血作用的黏多糖硫酸酯类物质，在临床和科研中具有广泛的用途。将从猪组织提取的肝素，记作猪来源肝素，由其制备得到的肝素制品记作猪来源肝素制品。牛或羊来源的肝素制品分别记作牛源肝素制品或羊源肝素制品。20世纪90年代以来，由于受疯牛病、口蹄疫等传染病的影响，牛、羊源的肝素钠制品在生产和使用上被限制。因此，准确、快速检测肝素制品物种来源成为肝素制品生产和使用的必要程序。
在肝素制品的生产加工过程中，动物组织中的部分DNA通常能够保留于肝素制品中。
脊椎动物线粒体基因组大小为16kb左右，呈闭合环状结构，在细胞中呈多拷贝形式存在于线粒体中(依细胞类型不同而异)。动物线粒体基因在进化上保守，且遵循严格的母系遗传特性，因此被广泛用于起源进化分析和物种鉴定。
【发明内容】
本发明的一个目的是提供一种鉴定肝素制品动物物种来源的方法。
本发明所提供的鉴定肝素制品动物物种来源的方法，包括如下步骤：检测待鉴定肝素制品中的线粒体DNA序列，然后进行如下1)-8)步骤中的至少一个步骤：
1)将所述待鉴定肝素制品中的线粒体DNA序列与牛的完整线粒体DNA序列中的保守区序列进行比较，若所述待鉴定肝素制品中的线粒体DNA序列与所述牛的完整线粒体DNA序列中的保守区序列不相同，则所述待鉴定肝素制品为非牛源肝素制品；若所述待鉴定肝素制品中的线粒体DNA序列与所述牛的完整线粒体DNA序列中的保守区序列相同，则所述待鉴定肝素制品候选为含有牛源肝素制品；
2)将所述待鉴定肝素制品中的线粒体DNA序列与羊的完整线粒体DNA序列中的保守区序列进行比较，若所述待鉴定肝素制品中的线粒体DNA序列与所述羊的完整线粒体DNA序列中的保守区序列不相同，则所述待鉴定肝素制品为非羊源肝素制品；若所述待鉴定肝素制品中的线粒体DNA序列与所述羊的完整线粒体DNA序列中的保守区序列相同，则所述待鉴定肝素制品候选为含有羊源肝素制品；
3)将所述待鉴定肝素制品中的线粒体DNA序列与牛和羊的完整线粒体DNA序列中的保守区序列进行比较，若所述待鉴定肝素制品中的线粒体DNA序列与所述牛的完整线粒体DNA序列中的保守区序列不相同且与所述羊的完整线粒体DNA序列中的保守区序列不相同，则所述待鉴定肝素制品为非羊源肝素制品也非牛源肝素制品；若所述待鉴定肝素制品中的线粒体DNA序列与所述牛的完整线粒体DNA序列中的保守区序列相同且与所述羊的完整线粒体DNA序列中的保守区序列相同，则所述待鉴定肝素制品候选为含有牛羊源肝素制品；
4)将所述待鉴定肝素制品中的线粒体DNA序列与猪的完整线粒体DNA序列中的保守区序列进行比较，若所述待鉴定肝素制品中的线粒体DNA序列与所述猪的完整线粒体DNA序列中的保守区序列不相同，则所述待鉴定肝素制品为非猪源肝素制品；若所述待鉴定肝素制品中的线粒体DNA序列与所述猪的完整线粒体DNA序列中的保守区序列相同，则所述待鉴定肝素制品候选为含有猪源肝素制品；
5)将所述待鉴定肝素制品中的线粒体DNA序列与牛的完整线粒体DNA序列进行比较，若所述待鉴定肝素制品中的线粒体DNA序列与所述牛的完整线粒体DNA序列不相同，则所述待鉴定肝素制品为非牛源肝素制品；若所述待鉴定肝素制品中地线粒体DNA序列与所述牛的完整线粒体DNA序列相同，则所述待鉴定肝素制品候选为含有牛源肝素制品；
6)将所述待鉴定肝素制品中的线粒体DNA序列与羊的完整线粒体DNA序列进行比较，若所述待鉴定肝素制品中的线粒体DNA序列与所述羊的完整线粒体DNA序列不相同，则所述待鉴定肝素制品为非羊源肝素制品；若所述待鉴定肝素制品中的线粒体DNA序列与所述羊的完整线粒体DNA序列相同，则所述待鉴定肝素制品候选为含有羊源肝素制品；
7)将所述待鉴定肝素制品中的线粒体DNA序列与牛和羊的完整线粒体DNA序列进行比较，若所述待鉴定肝素制品中的线粒体DNA序列与所述牛的完整线粒体DNA序列不相同且与所述羊的完整线粒体DNA序列不相同，则所述待鉴定肝素制品为非羊源肝素制品也非牛源肝素制品；若所述待鉴定肝素制品中的线粒体DNA序列与所述牛的完整线粒体DNA序列相同且与所述羊的完整线粒体DNA序列相同，则所述待鉴定肝素制品候选为含有牛羊源肝素制品；
8)将所述待鉴定肝素制品中的线粒体DNA序列与猪的完整线粒体DNA序列进行比较，若所述待鉴定肝素制品中的线粒体DNA序列与所述猪的完整线粒体DNA序列不相同，则所述待鉴定肝素制品为非猪源肝素制品；若所述待鉴定肝素制品中的线粒体DNA序列与所述猪的完整线粒体DNA序列相同，则所述待鉴定肝素制品候选为含有猪源肝素制品。
所述检测待鉴定肝素制品中的线粒体DNA序列的方法包括如下步骤：以所述待鉴定肝素制品中的DNA为模板，PCR扩增，得到PCR扩增产物，将所述PCR扩增产物进行测序，得到所述待鉴定肝素制品中的线粒体DNA序列；
所述PCR扩增中所用的引物为如下1)或2)所述引物：1)扩增所述动物物种的完整线粒体DNA序列的引物；2)扩增所述动物物种的完整线粒体DNA序列中的保守区序列的引物。
所述检测待鉴定肝素制品中的线粒体DNA序列的方法中，在所述PCR扩增之前，包括从所述待鉴定肝素制品中提取DNA的步骤。
所述从所述待鉴定肝素制品中提取DNA的方法包括如下步骤：将肝素制品溶于水中，震荡混匀，沸水浴10min后再冰浴2min，离心取上清液；用乙醇沉淀所述上清液，收集沉淀，得到所述待鉴定肝素制品的DNA。
所述检测待鉴定肝素制品中的线粒体DNA序列的方法中，在所述从所述待鉴定肝素制品中提取DNA后，在所述PCR扩增前，包括纯化所述待鉴定肝素制品的DNA的步骤。
所述纯化所述待鉴定肝素制品的DNA的方法包括如下步骤：将所述待鉴定肝素制品的DNA进行琼脂糖凝胶电泳，割胶回收目的条带，用苯酚回收目的条带中的DNA，再用异丙醇沉淀，收集沉淀，得到纯化的所述待鉴定肝素制品的DNA。
所述用苯酚回收目的条带中的DNA的方法包括如下步骤：将苯酚与所述割胶回收的目的条带混合，-70℃冻融2-3次，取水相；苯酚与所述割胶回收的目的条带的体积相同；
所述用异丙醇沉淀的方法包括如下步骤：将所述水相与5M NaCl水溶液等体积混合，再向其中加入异丙醇，静置；所述异丙醇的体积是所述水相与5M NaCl水溶液的混合溶液体积的0.6倍。
所述猪的完整线粒体DNA序列中的保守区序列如序列表中序列1所示，所述牛的完整线粒体DNA序列中的保守区序列如序列表中序列2所示，所述羊的完整线粒体DNA序列中的保守区序列如序列表中序列3所示。
当将所述待鉴定肝素制品中的线粒体DNA序列与猪的完整线粒体DNA序列中的保守区序列进行比较时，所述PCR扩增中使用的引物对为：一条引物序列如序列表中序列4所示；另一条引物的序列如序列表中序列5所示；
当将所述待鉴定肝素制品中的线粒体DNA序列与牛和/或羊的完整线粒体DNA序列中的保守区序列进行比较时，所述PCR扩增中使用的引物对为：一条引物序列如序列表中序列6所示；另一条引物的序列如序列表中序列7所示。
所述肝素制品可为肝素钠或肝素钙。
本发明方法可用于判定待检测肝素制品是来源于猪、牛还是羊，从而检测市面上的肝素制品动物物种来源是否合法。
肝素是PCR反应的抑制剂，直接影响肝素中DNA的PCR扩增，导致样本肝素中DNA的直接鉴定无法开展；同时，肝素制品在生产加工过程中外源DNA污染也影响PCR结果的准确性。本发明方法中克服了上述缺陷，将DNA从肝素制品中提取出来，并进一步纯化，排除肝素对PCR的影响，使PCR顺利进行，保证了DNA信息的真实性和PCR结果的可靠性。因此，本发明方法在肝素制品的物种来源鉴定领域具有广阔的应用前景。
【附图说明】
图1为肝素钠制品DNA纯化前后电泳对比图。
图2为样品中猪源成分鉴定结果。
图3样品中牛源成分鉴定结果。
【具体实施方式】
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、肝素钠制品物种来源的鉴定
本实验的流程是先检测各肝素钠中线粒体DNA的序列，然后将得到的DNA序列分别与猪、牛、羊完整线粒体DNA序列中的保守区序列进行比较，从而判别各肝素钠的物种来源。
肝素钠购自北京正元化学科技有限公司，产品目录号为bjzy071408-1，bjzy031209-1，bjzy031209-2；已知此三个目录号的肝素钠均是猪来源的。
分别将三批肝素钠编号为1、2和3，以双蒸水为空白对照，制备牛羊DNA混合的内参对照和猪DNA的内参对照。内参对照和空白对照的目的在于监控样品误差。
具体实验步骤如下：
(一)实验组
1、肝素钠制品DNA的提取与纯化
(1)肝素钠制品总DNA的提取
取肝素钠样品10mg溶于500μl双蒸水中，充分震荡混匀，沸水浴10min，迅速转入冰浴2min，15000g离心10min，上清液以100％乙醇沉淀、70％乙醇洗涤后溶于50μL双蒸水中，得到肝素钠制品DNA溶液。
(2)肝素钠制品DNA样品的纯化
将提取的DNA以1％琼脂糖凝胶进行电泳，切胶回收目的DNA条带，等体积苯酚-70℃冻融2-3次，取水相，将水相加入到5M NaCl水溶液中(水相与5M NaCl水溶液的体积比为1∶1)，再向其中加入异丙醇(异丙醇的体积是所述水相与5M NaCl水溶液的混合溶液体积的0.6倍)，静置10min，收集沉淀，70％乙醇洗涤沉淀，再将沉淀溶解于50μl双蒸水中，得到纯化后的肝素钠制品DNA溶液，用紫外分光光度计测定DNA浓度。
肝素钠制品DNA纯化前后电泳对比结果如图1所示。图中1、2、3、B为样品纯化前(即步骤(1)得到的DNA样品)，1’、2’、3’、B’为样品纯化后(即步骤(2)得到的DNA样品)。其中B、B’为空白对照。样品纯化前为黄色液体，DNA浓度较高，且有严重的杂质污染。纯化后为无色透明液体，DNA浓度降低，杂质基本除去。
2、PCR扩增
根据Genbank上公布的猪、牛、羊线粒体基因组序列及其保守区序列，利用DNAstar软件(Lasergene)分别设计一对猪源特异性引物和一对牛羊源共用特异性引物，各引物对分别对应各物种的线粒体序列中的保守区序列，具体如下：猪的完整线粒体DNA序列中的保守区序列如序列表中序列1所示，牛的完整线粒体DNA序列中的保守区序列如序列表中序列2所示，羊的完整线粒体DNA序列中的保守区序列如序列表中序列3所示。
(1)猪特异性引物及序列：扩增片段长度：143bp；
pigcytb F：5’-CGCCTACGCTATCCTACGTTCAAT-3’(序列4)
pigcytb R：5’-GGCATTGACTTAGTGGTCGAAAT-3’(序列5)
(2)牛羊共用特异性引物及序列：扩增片段长度：146bp；
cattlecytb F：5’-GTACTAGCCCTAGCCTTCTC-3’(序列6)
cattlecytb R：5’-CCAATTCATGTGAGTGTCAAT-3’(序列7)
分别以各批肝素钠制品的纯化后的DNA为模板，分别用上述引物对(1)和(2)进行PCR扩增；
反应体系为25μl，其中10×PCR缓冲液2.5μl，dNTPs(10mM)0.5μl，上下游引物(10μM)各0.5μl，Taq DNA聚合酶(5U/μl)0.5μl，DNA模板(50ng/μl)1μl，无菌超纯水补至25μl。
扩增条件：95℃预变性5min；95℃30s，54℃30s，72℃30s，30个循环；72℃延伸10min。
3、琼脂糖凝胶电泳检测
2％琼脂糖凝胶，5V/cm电泳20分钟，EB染色后紫外灯下观察拍照。
4、PCR产物的测序鉴定：将PCR产物进行测序，测得三批肝素钠制品的线粒体DNA序列如序列表中序列1所示。
5、序列比较：三批肝素钠制品的线粒体DNA序列与猪的完整线粒体DNA序列中的保守区序列相同，与牛或羊的完整线粒体DNA序列中的保守区序列不同，表明三批肝素钠制品来源于猪，而非来源于牛或羊。
(二)对照组
1、内参对照：
分别取离体的猪、牛、羊的外周静脉血，提取DNA并进行纯化，分别获得猪、牛、羊纯化DNA样品：EDTA抗凝，SDS、蛋白酶K消化，酚/氯仿/异戊醇纯化，异丙醇沉淀。用紫外分光光度计测定DNA浓度。
猪的内参对照：取猪DNA样品1ng，加入到50ng纯化后的肝素钠制品DNA中，混合均匀；
牛和羊的内参对照：取牛DNA样品0.5ng、羊DNA样品各0.5ng，加入到50ng纯化后的肝素钠制品DNA中，混合均匀；
2、空白对照：在PCR反应体系中不加任何DNA模板，用双蒸水代替DNA模板。
分别以各内参对照中的DNA为模板，分别用引物对(1)和(2)进行PCR扩增，PCR产物用琼脂糖凝胶电泳检测，方法如实验组所述。
结果如图2和图3所示。显示肝素钠制品中检测到猪源线粒体DNA，未检测到牛羊源线粒体DNA。
图2为猪源鉴定结果。pig为猪的内参对照；1、2、3为肝素钠制品的DNA；B为空白对照。1、2、3号样品扩增结果与猪的内参对照扩增结果一致，空白对照无目的条带，说明肝素钠制品存在猪源DNA。
图3为牛羊源鉴定结果。cattle为牛和羊的内参对照；1、2、3为肝素钠制品的DNA样品；B为空白对照。内参对照扩增结果为阳性，1、2、3号样品无目的条带，空白对照无目的条带，说明肝素钠样品中没有牛和羊扩增模板，且不存在肝素抑制PCR作用，而是肝素钠制品中无牛羊源线粒体DNA。进一步说明肝素钠制品不是牛或羊来源。
设置内参对照的目的是为了检测PCR扩增过程中是否存在肝素抑制的情况，即当检测样品中PCR未扩增出任何DNA时，有两个可能的原因，一是肝素样品中未含有猪源、牛源或羊源的线粒体DNA，另一个是PCR反应被肝素抑制。若检测样品中未扩增得到目的DNA，而相应的内参对照中扩增出目的DNA，则说明检测样品中不含有猪源、牛源或羊源的线粒体DNA；若检测样品中未扩增得到目的DNA，且相应的内参对照中也未扩增出目的DNA，则说明是PCR反应存在抑制剂问题，可判断是PCR反应被肝素抑制。在上述实验中，内参对照扩增结果均为阳性，未出现阴性情况，说明PCR反应正常，没有被肝素抑制，进一步证明本发明的从肝素钠制品中提取和纯化DNA的方法有效，排除了肝素对PCR的抑制，且有力证明本发明方法检测结果可靠。
【序列表】
<110>中国农业大学
<120>一种鉴定肝素制品动物物种来源的方法
<160>7
<210>1
<211>143
<212>DNA
<213>猪(Sus scrofa)
<400>1
cgcctacgct atcctacgtt caattcctaa taaactaggt ggagtgctag ctctaatagc 60
ctccatccta atcctaattt taatgcccat actacacaca tccaaacaac gaagcataat 120
atttcgacca ctaagtcaat gcc 143
<210>2
<211>146
<212>DNA
<213>牛(Bos taurus)
<400>2
gtactagccc tagccttctc tatcctaatt cttgctctaa tccccctact acacacctcc 60
aaacaacgaa gcataatatt ccgaccactc agccaatgcc tattctgagc cctagtagca 120
gacctattga cactcacatg aattgg 146
<210>3
<211>146
<212>DNA
<213>羊(Ovis aries，Capra hircus)
<400>3
gtactagccc tagccttctc aatcctaatc ttagtacttg tacccttcct ccacacatct 60
aaacaacgaa gcataatatt ccgcccaatc agccaatgca tattctgaat cctggtagca 120
gatctattga cactcacatg aattgg 146
<210>4
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>4
cgcctacgct atcctacgtt caat 24
<210>5
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>5
ggcattgact tagtggtcga aat 23
<210>6
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>6
gtactagccc tagccttctc 20
<210>7
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>7
ccaattcatg tgagtgtcaa t 21