一个棉花BHLH转录因子基因GHFP1及其启动子的鉴定及应用.pdf

棉花GhFP1基因属于bHLH转录因子基因家族成员，其cDNA全长1262bp，编码一个含有355氨基酸的bHLH蛋白。GhFP1在棉花各组织中均有表达，在纤维发育前中期有较高表达。分离克隆了长度为1061bp的GhFP1启动子片段。利用GUS报告基因对启动子活性进行分析，表明启动子在棉花纤维中有较高的特异表达活性。实验表明，在拟南芥中过量表达GhFP1导致叶片表皮毛增长；在棉花中过量表达GhFP1，导致棉纤维细胞油菜素内酯相关基因表达上调，成熟棉纤维长度增加。上述结果证明，GhFP1蛋白在棉纤维伸长过程中发挥正调节作用，促进纤维细胞伸长，对于改良棉纤维品质、增加棉花产量可能具有重要的应用价值。

权利要求书
1.  棉花GhFP1基因的cDNA序列如下：


2.  权利要求1所述的棉花GhFP1基因编码的蛋白质序列如下：



3.  棉花GhFP1基因的上游启动子序列如下：

说明书一个棉花bHLH转录因子基因GhFP1及其启动子的鉴定及应用
技术领域
本发明涉及棉花基因，具体是棉花basic helix-loop-helix(bHLH)家族中的一个新成员基因GhFP1的表达及功能鉴定，以及其启动子纤维特异表达活性鉴定，进而应用于棉纤维品质改良。
背景技术
棉花是全世界最重要的经济作物之一。依照其基因组构成可分为异源四倍体棉花(AADD)，以及二倍体棉花(AA)和(DD)。目前种植的棉花主要是异源四倍体棉花(约占全部棉花种植面积的95％以上)，二倍体棉花种植较少。异源四倍体棉花又分为陆地棉(Gossypium hirsutum)与海岛棉(G.barbadense)。陆地棉原产中美洲，其适应性广，是目前种植最多的棉花种，占全部棉花种植面积的90％以上。随着纺织工业快速发展，人民生活水平不断提高，纺织工业及其相关产业对棉纤维品质的要求愈来愈高。我国棉花产量据世界第一位，但棉花纤维品质较差，因此，纤维品质问题已成为制约我国棉花产业可持续发展的主要障碍之一。
棉纤维是由种皮上突起的细胞产生的，每根纤维都是一个单细胞。而纤维长度是衡量棉花纤维品质的一个重要指标，因此对调控细胞伸长基因的研究对于改良棉纤维品质具有重要意义。
植物细胞伸长受到诸多因素的影响，生长素(Auxin)、赤霉素(GA)和油菜素内酯(BR)等植物激素对细胞伸长具有重要促进作用。在拟南芥中研究发现，上述3类激素对于细胞伸长的调控机制最终都经过了一个HLH/bHLH家族转录因子相互作用的调控网络。虽然还没有棉纤维发育中关于HLH/bHLH转录因子功能研究相关的报道，但在对二倍体棉花的基因组测序中发现了200多个HLH/bHLH家族转录因子成员，暗示着HLH/bHLH转录因子可能对棉纤维细胞发育具有重要作用。
HLH/bHLH家族转录因子广泛存在于真核生物中。该家族蛋白都具有一个约60个氨基酸组成的bHLH结构域。该结构域又分为2个部分，位于N端的basic区域以及随后的helix-loop-helix(HLH)区域。Basic区域一般由15到20个氨基酸残基组成，该区域主要与DNA的结合有关。HLH结构域主要参与蛋白质之间的相互作用来形成同源或异源复合体，从而发挥其对下游靶基因的调控作用。
发明内容
本发明的目的在于提供一个参与棉花纤维发育调控的新基因GhFP1，分析其启动子活性，蛋白亚细胞定位和转录激活活性，蛋白质间的相互作用及其在转基因拟南芥和棉花植株中产生的表型变化，以研究其功能，为解析纤维细胞伸长的分子机制，改良棉花纤维的品质提高新的科学资料。
采用比较基因组学和生物信息学等研究方法，从棉花纤维cDNA文库中分离鉴定了一些棉花HLH/bHLH家族基因，并对其中的GhFP1进行了研究。分析表明，GhFP1cDNA全长序列为1262bp，如SEQ.ID.No.1所示，开放阅读框为1068bp，编码一个含355氨基酸的bHLH蛋白质，蛋白质氨基酸序列如SEQ.ID.No.2所示，分子量为39.2kDa。
利用染色体步移法(genome walking PCR)，分离克隆了长度为1061bp的GhFP1启动子片段，如SEQ.ID.No.3所示。将该启动子GhFP1pro与GUS报告基因融合，构建了pBI121-GhFP1pro:GUS表达载体，转化棉花。分析了GUS基因在棉花纤维等组织细胞中的表达，表明该启动子在棉纤维发育过程中有较高的表达活性。
为验证GhFP1基因编码的bHLH蛋白是否为转录因子，我们利用表1中的GhFP1-ORF-L与GhFP1-ORF-R为引物克隆到了GhFP1的开放阅读框，构建相关的表达载体，分析该蛋白的亚细胞定位及转录激活活性。构建了pBI121-GhFP1:GFP融合表达载体，转化了拟南芥，观察转基因拟南芥幼苗的下胚轴，结果显示GhFP1:GFP融合蛋白定位于细胞核中。
为了分析该蛋白的转录激活活性，构建了pGBKT7-GhFP1和pGADT7-GhFP1表达载体，分别转化酿酒酵母菌株Y187和AH109，进行划线及X-gal显色实验，结果显示GhFP1蛋白具有转录激活能力。同时，我们在拟南芥中过量表达了GhFP1蛋白，观察发现GhFP1蛋白的过量表达导致转基因拟南芥叶片表皮毛形态发生了明显改变，表皮毛体积变大，长度增加。
为进一步研究GhFP1基因的功能，构建了由棉纤维特异启动子GhTUA9p(本发明人克隆鉴定的纤维特异启动子，已申请获得的授权专利ZL 2010 1 0028915.5)驱动的GhFP1过量表达及RNAi载体，转化棉花，获得了转基因棉花植株。对GhFP1过量表达转基因棉花的成熟纤维进行了长度测量，结果显示过量表达GhFP1增加了棉花成熟纤维的长度。利用定量RT-PCR分析了转基因棉花中一些纤维发育相关基因的表达情况，结果表明油菜素内酯(BR)受体基因GhBRI1及参与BR合成的基因GhDWF4和GhCPD的表达上调。离体胚培养实验也显示GhFP1过量表达后，增强了棉纤维发育过程中对油菜素内酯合成抑制剂(BRZ)的耐受。以上结果表明，GhFP1基因在棉纤维中的过量表达增加了BR信号，促进棉纤维伸长发育。
进而分离克隆了BR合成相关基因GhDWF4及GhCPD的启动子序列，对其进行了分析，发现这两个启动子上都含有被bHLH家族转录因子识别的E-box(CANNTG)元件。表达纯化了GhFP1蛋白，利用EMSA(electrophoretic mobility shift assay)实验验证蛋白与DNA之间的相互作用，结果表明GhFP1蛋白能够与这些E-box序列相结合，调控这些基因的功能表达，从而影响棉纤维伸长发育。
利用酵母双杂交及pull-down实验分析了GhFP1蛋白与其他HLH/bHLH家族蛋白的相互作用。结果显示GhFP1蛋白自身能形成同源二聚体，也能与其他HLH/bHLH蛋白之间形成异源二聚体。
本发明的优点：
1、提供了一个棉花新基因GhFP1的全长cDNA序列及其编码的蛋白质序列，分析了该蛋白的亚细胞定位和转录活性，证实了该基因编码的蛋白属于HLH/bHLH转录因子。
2、提供了一个GhFP1基因上游启动子序列，分析证明该启动子在棉纤维发育过程中有较高的特异表达活性。
3、GhFP1基因在拟南芥中的过量表达能促进表皮毛细胞发育，导致表皮毛增大变长；在棉花纤维中过量表达GhFP1导致油菜素内酯相关基因表达上调，促进纤维伸长发育，成熟棉纤维长度增加。
4、棉花HLH/bHLH蛋白之间存在一个相互作用网络，参与棉纤维的发育调节，在棉纤维伸长发育过程中发挥重要作用。
附图说明：
图1.GhFP1基因组织表达、GhFP1蛋白亚细胞定位及转录激活分析。
A.Real-time RT-PCR分析GhFP1在棉花各组织中的表达(1,根；2,下胚轴；3,子叶；4,叶；5,花瓣；6,花药；7胚珠；8,3DPA纤维；9,5DPA纤维；10,10DPA纤维；11,12DPA纤维；12,15DPA纤维；13,20DPA纤维)。用表1中的GhFP1-RT-L、GhFP1-RT-R、GhUBI1-L与GhUBI1-R为引物，不同棉花组织cDNA为模板，进行实时荧光定量PCR，最后计算出GhFP1表达量的相对值。B.GhFP1蛋白的亚细胞定位。箭头表示GFP荧光信号在细胞核中。C.GhFP1蛋白转录激活分析。左图：显示pGBKT7-GhFP1及阳性对照pGBKT7-53转入酵母后能在SD/-Trp-Ade培养基上生长，而阴性对照则不能生长；右图：pGBKT7-GhFP1及阳性对照pGBKT7-53转入酵母后能在显色实验中显蓝色，而阴性对照不能显色。这说明GhFP1蛋白具有转录激活能力。
图2.GhFP1启动子在棉花纤维发育阶段中的活性分析。GhFP1p:GUS转基因棉花不同发育阶段胚珠及纤维GUS染色分析。通过棉花遗传转化，获得了GhFP1p:GUS转基因棉花。对不同发育阶段的转基因棉花胚珠和纤维进行GUS染色，分析在GhFP1启动子驱动下GUS基因表达活性(如果GhFP1启动子具有活性，则会激活下游GUS报告基因表达，在染色实验中产生蓝色反应)。(A)–(G)分别为开花当天(0天)及开花后1、3、5、10、15和20天的棉花胚珠和纤维。
图3.GhFP1过量表达转基因拟南芥叶片表型及表皮毛长度统计分析。
(A,B,C)野生型拟南芥第九片莲座叶及表皮毛；(D,E,F)GhFP1过量表达转基因拟南芥株系L1；(G,H,I)GhFP1过量表达转基因拟南芥株系L2。(A,D,G)标尺为500μm；(C,F,I)标尺为100μm.(J)野生型和GhFP1过量表达拟南芥生长22天时第九片莲座叶上表皮毛长度统计，误差值代表相对误差，**代表t-test中有极显著差异(P<0.01)。
图4.GhFP1过量表达转基因棉花鉴定及纤维长度统计分析。
A.定量RT-PCR分析转基因棉花中GhFP1基因的表达。WT为野生型棉花，CK是从转基因棉花中分离出来的非转基因植株，L5-5-1、L5-5-3、L14-1-2及L14-1-5为转基因棉花的不同株系；B.Western-blotting检测棉纤维中GhFP1蛋白的积累。CK是从转基因棉花中分离出来的非转基因植株，L5-5-1、L14-1-2及L14-1-5为转基因棉花的不同株系；C.转基因棉花与野生型棉花纤维的长度比较。WT为野生型棉花，CK1和CK2是从转基因棉花中分离出来的非转基因植株，其余为转基因棉花的不同株系；D.转基因棉花与野生型棉花纤维长度统计。纵坐标表示纤维长度(fiber length)，横坐标表示与C图相同。通过测量成熟纤维长度，每个株系至少测量50个棉花种子样本，进行统计分析，并计算t-test值，**代表t-test的P值<0.01，表明转基因棉花与野生型在纤维长度上存在极显著差异。
图5.GhFP1过量表达转基因棉花中油菜素内酯相关基因表达分析及离体胚培养实验。
A.定量RT-PCR分析转基因棉花中BR相关基因的表达。WT为野生型棉花，CK是从转基因棉花中分离出来的非转基因植株，L5-5-1、L5-5-3、L14-1-2及L14-1-5为不同Line的转基因棉花；B.离体胚培养观察转基因与野生型棉花胚珠及纤维生长状况。CK是指正常的离体胚培养条件，BRZ表示在离体胚培养时加入了BR合成的抑制剂BRZ，WT表示野生型棉花，L5和L14表示两个不同的转基因棉花株系；C.离体胚培养实验中转基因与野生型棉花胚珠及纤维生长状况的统计分析。通过Image软件分析离体胚珠培养实验后胚珠的大小，并进行统计分析。
图6.GhDWF4和GhCPD启动子分析及EMSA实验。上图：GhDWF4和GhCPD启动 子分析；下图：GhFP1蛋白与E-box结合能力的EMSA实验分析。*表示自由探针的位置，箭头表示出现滞后的迁移条带。GhFP1蛋白能够与G-box以及从GhCPD和GhDWF4启动子上选取的3个含有E-box的DNA片段发生相互作用，而不能与突变后的G-box m发生相互作用。
图7.Pull-down实验分析GhFP1蛋白形成同源二聚体。将表达纯化的GhFP1蛋白进SDS-PAGE电泳，利用His标签抗体进行Western-blot检测。结果表明，His-GhFP1蛋白能够与MBP-GhFP1蛋白发生相互作用，而不能与空的MBP蛋白发生相互作用，这表明GhFP1蛋白能够形成同源二聚体。
图8.棉花HLH/bHLH蛋白之间的相互作用分析。A.酵母双杂交分析棉花GhFP1及HLH/bHLH蛋白间的相互作用；B.pull-down实验分析GhFP1蛋白与GhIBH2/3之间的相互作用。上图：Pull-down实验后的Western-blot检测分析，结果显示His-GhFP1能够与MBP-GhIBH2及MBP-GhIBH3发生相互作用，而不能与MBP蛋白发生相互作用。下图：用于Western-blot分析的蛋白电泳图(考马斯亮蓝染色)。
具体实施方式：
本发明通过以下附图和实施进行进一步阐述，但并不限制本发明的范围。
1、棉花GhFP1基因的全长cDNA分离克隆
从棉纤维cDNA文库(按Li XB等，2002，Molecular characterization of the cotton GhTUB1gene that is preferentially expressed in fiber.Plant Physiol 130:666-674中的方法进行)中分离一个bHLH家族的新基因，命名为GhFP1。分析表明，GhFP1cDNA全长序列为1262bp，如SEQ.ID.No.1所示，开放阅读框为1068bp，编码一个含355氨基酸的bHLH蛋白质，蛋白质氨基酸序列如SEQ.ID.No.2所示，分子量为39.2kDa。
2、GhFP1启动子序列分离克隆及GUS染色分析
利用染色体步移法分离克隆了长度为1061bp的GhFP1启动子片段，序列如SEQ.ID.No.3所示。将GhFP1启动子GhFP1p与GUS报告基因融合，构建了pBI121-GhFP1p:GUS表达载体，转化棉花。利用GUS报告基因来分析GhFP1启动子的活性。收取开花后不同天数的转基因棉花胚珠及纤维进行GUS染色分析，分析在GhFP1启动子驱动下GUS基因表达活性(如果GhFP1启动子具有活性，则会激活下游GUS报告基因表达，在染色实验中产生蓝色反应)，结果如图2所示(按Li XB,Cai L,Cheng NH,Liu JW,2002.Molecular characterization of the cotton GhTUB1gene that preferentially expressed in fiber.Plant Physiology 130:666-674进行)。结果表明，在开花后1天与3天的胚珠和纤维中，GUS信号 很弱；从开花后第5天开始，纤维中GUS表达明显增强，直到第20天时GUS信号又开始相对减弱。这说明GhFP1启动子主要在纤维发育的伸长期具有活性，表明GhFP1参与调控棉纤维的伸长过程。
为验证GhFP1基因编码的bHLH蛋白是否为转录因子，我们利用表1中的GhFP1-ORF-L与GhFP1-ORF-R为引物克隆到了GhFP1的开放阅读框，构建相关的表达载体，分析该蛋白的亚细胞定位及转录激活活性。
3、GhFP1蛋白亚细胞定位分析
(1)构建pBI121-GhFP1:GFP融合表达载体，转化农杆菌Gv3101。
(2)浸花法转化拟南芥，筛选获得拟南芥转基因植株，收获转基因种子。
(3)荧光观察：在激光共聚焦显微镜(Leica公司TCS SP5)下观察转基因拟南芥小苗下胚轴细胞，分析荧光蛋白亚细胞定位。结果见图1B，图1B表明：GhFP1:GFP融合蛋白定位于细胞核中。
4、GhFP1转录激活活性检测
为了分析该蛋白的转录激活活性，构建了pGBKT7-GhFP1和pGADT7-GhFP1表达载体，分别转化酿酒酵母菌株Y187和AH109，进行划线及X-gal显色实验，结果显示GhFP1蛋白具有转录激活能力。
A、将转入pGBKT7空载体的AH109(BD)/Y187(BD)菌株和转入pGBKT7-GhFP1融合载体的AH109(BD-GhFP1)/Y187(BD-GhFP1)菌株在SD/-Ade/-Trp平板上划线培养，待生长2–3天后，观察是否有新的菌落生长；
B、X-gal滤纸显色：将阴性对照(pGBKT7载体)与阳性对照(pGBKT7-53载体)转入Y187/AH109菌株和转入pGBKT7-GhFP1的Y187/AH109菌株培养收集细胞，然后在液氮中反复冻融三次，在加有β-巯基乙醇和X-gal的Z-buffer中显色。结果见图1C，由图可看出：GhFP1蛋白具有转录激活能力。
5、GhFP1转基因拟南芥表型分析
利用浸花法转化拟南芥，获得过量表达GhFP1基因的转基因拟南芥植株。统计分析转基因拟南芥叶片表型及表皮毛长度，见图3，观察发现GhFP1过量表达导致转基因拟南芥叶片表皮毛形态发生了明显改变，表皮毛体积变大，长度增加。上述实验结果表明，在拟南芥中过量表达GhFP1促进表皮毛细胞生长发育。
6、转GhFP1基因棉花表型分析
为进一步研究GhFP1基因的功能，构建了由纤维特异启动子GhTUA9p(本发明人克隆鉴定的纤维特异启动子，已申请获得的授权专利ZL 201010028915.5)驱动的GhFP1过量表达及RNAi载体，转化棉花，获得了转基因棉花植株。定量RT-PCR分析转基因棉花中GhFP1基因的表达。检测棉纤维中GhFP1蛋白的积累，并进行转基因棉花与野生型棉花纤维的长度比较，及长度统计。
A.定量RT-PCR分析转基因棉花中GhFP1基因的表达。
a.分析转基因棉花各组织中GhFP1基因的表达：
(1)棉花各组织总RNA的提取(按蒋建雄、张天真，2003，利用CTAB/酸酚法提取棉花组织总RNA。棉花学报，15:166-167进行)；
(2)逆转录：按M-MLV逆转录酶(Promega公司)的使用说明书操作；
(3)实时荧光定量PCR：按荧光定量PCR试剂盒(TOYOBO公司)的使用说明书操作。以棉花持家基因GhUBI1作为内参，计算基因表达的相对值。PCR反应中所使用的基因特异性引物GhFP1-RT-L、GhFP1-RT-R、GhUBI1-L与GhUBI1-R见表1。为了得到最佳的实验效果，PCR扩增条件及引物效率都以目的基因的cDNA为模板进行优化。该实验中每个组织采集3次样品，分别提取RNA，每个样品重复3次实时定量RT-PCR实验，最后统计9次实验结果，计算其平均值和标准差。结果见图1A。图1可看出：GhFP1在棉花各组织中均有表达，在纤维发育前中期有较高表达。
表1 GhFP1基因全长DNA序列克隆引物及RT-PCR引物

b采用上述方法，提取野生型及转基因棉花10天纤维RNA，进行实时荧光定量RT-PCR分析得到转基因棉花纤维中GhFP1基因表达相对于野生型的比值，见图4A，结果表明在转基因棉花纤维中GhFP1基因表达量显著提高。
B.Western-blotting检测棉纤维中GhFP1蛋白的积累。提取开花后10天的棉纤维的细胞核蛋白，利用制备的GhFP1抗体进行Western-blot分析。结果表明：转基因棉花纤维中GhFP1蛋白含量明显高于野生型。
C.转基因棉花与野生型棉花纤维的长度比较。WT为野生型棉花，CK1和CK2是从转基因棉花中分离出来的非转基因植株，其余为转基因棉花的不同株系；结果显示过量表达GhFP1增加了棉花成熟纤维的长度(图4C)。
D.转基因棉花与野生型棉花纤维长度统计。纵坐标表示纤维长度(fiber length)，横坐标表示与C图相同。通过测量成熟纤维长度，每个株系至少测量50个棉花种子样本，进行统计分析，并计算t-test值，**代表t-test的P值<0.01，表明转基因棉花与野生型在纤维长度上存在极显著差异。
利用定量RT-PCR分析了转基因棉花中一些纤维发育相关基因的表达情况，结果见图5A，结果表明油菜素内酯(BR)受体基因GhBRI1及参与BR合成的基因GhDWF4和GhCPD的表达上调。离体胚培养实验结果显示在加入BRZ的实验组中，野生型与转基因的胚珠及纤维生长都明显受到了抑制，通过Image软件分析离体胚珠培养实验后胚珠的大小，并进行统计分析得到：野生型纤维长度只有对照的56.2％，而两个转基因株系纤维L5和L14的长度分别为77.1％与72.5％，统计分析结果显示在BRZ处理后转基因株系纤维生长状态明显好于野生型，说明GhFP1过量表达后，增强了棉纤维发育过程中对油菜素内酯合成抑制剂(BRZ)的耐受，见图5B和5C。以上结果表明，GhFP1基因在棉纤维中的过量表达增加了BR信号，促进棉纤维伸长发育。
7、EMSA实验分析GhFP1蛋白与下游基因启动子上的E-box顺式作用元件的结合
分离克隆了BR合成相关基因GhDWF4及GhCPD的启动子序列，对其进行了分析，发现这两个启动子上都含有被bHLH家族转录因子识别的E-box(CANNTG)元件。表达纯化了GhFP1蛋白，利用EMSA(electrophoretic mobility shift assay)实验验证GhFP1蛋白与DNA之间的相互作用，结果表明GhFP1蛋白能够与这些E-box序列相结合，调控这些基因的功能表达，从而影响棉纤维伸长发育，见图6。
EMSA实验步骤：合成含有所需元件序列的2条互补的寡核苷酸，进行退火合成双链。将合成好的探针与纯化的GhFP1蛋白室温暗反应30分钟，经4％丙烯酰胺凝胶电泳后SYBR Green染色分析。
8、酵母双杂交实验和Pull-dwon实验分析棉花HLH/bHLH蛋白之间的相互作用
利用酵母双杂交及pull-down实验分析了GhFP1蛋白与其他HLH/bHLH家族蛋白的相互作用。结果显示GhFP1蛋白自身能形成同源二聚体，也能与其他HLH/bHLH蛋白之间形成异源二聚体。
酵母双杂交：将克隆到的棉花GhFP1的同源基因(GhIBL2、GhIBH2、GhIBH3)构建到 pGBKT7载体上，并将GhFP1、GhACE1、GhHBI1、GhPRE1与GhPRE5(都是棉花HLH/bHLH家族成员)构建到pGADT7载体上，转入酵母菌株AH109和Y187，检测后选取阳性菌落，依照Biosciences Clontech公司提供的使用手册(BD Matchmaker Library Construction&Screening Kits User Manual)进行，结果见图8A，GhFP1与GhACE1及GhHBI1一样能与GhIBH2及GhIBH3发生较强的相互作用，而GhPRE1与GhIBH2及GhIBH3间的相互作用则非常弱，GhPRE5能与GhIBL2、GhIBH2、及GhIBH3发生较强的相互作用。
Pull-dwon实验：将GhFP1以及编码待测蛋白的基因开放阅读框序列分别构建到pMAL及Pet28a表达载体上，然后将构建好的载体以及空载体转入大肠杆菌中，分别进行蛋白诱导表达。用Ni柱对诱导的His-GhFP1蛋白进行纯化，分装保存；将诱导表达的MBP蛋白及其他MBP融合蛋白分别结合到Amylose Resin上，将纯化的His-GhFP1蛋白分别加入含有MBP蛋白及其他MBP融合蛋白的Amylose Resin中，置于冰上孵育2小时，然后漂洗数次后，在含20mM麦芽糖的柱中用缓冲液进行洗脱。将洗脱的蛋白进行SDS-PAGE电泳，利用His标签抗体进行Western-blot检测。将表达出来的MBP融合蛋白结合到Amylose resin上，然后加入纯化过的His-GhFP1蛋白，经SDS-PAGE电泳后，进行Western-blotting,用His标签抗体检测。结果见图7和图8B，GhFP1能够形成同源二聚体，也能够与GhIBH2及MBP-GhIBH3发生相互作用，而不能与MBP蛋白(对照)发生相互作用。