4－4－噻唑基苯氧基烷氧基－苄脒衍生物用于治疗骨质疏松症的应用.pdf

具体实施方式

通过以下实施例更详细地解释本发明。

实施例1：各测试物质对破骨细胞分化的抑制作用

通过与成骨细胞共培养来评价各测试物质对破骨细胞增殖和分
化过程的作用。

1.细胞的制备

a)骨髓细胞的制备

在无菌条件下从6～8周雄性ddY小鼠切除胫骨和股骨，以通过
使用注射器(21G，Korea Green Cross)收集骨髓细胞。

将骨髓细胞悬浮在含有碳酸氢钠(2.0g/L)、链霉素(100mg/L)和青
霉素(100000单位/mL)的5mL α-MEM培养基(Gibco BRL Co.)中。将
收集的细胞在800×g下离心5分钟，以收集全量。为了除去骨髓细
胞中的红细胞，加入3mL Tris HCl(0.83％NH₄Cl，pH 7.5)并充分混
合。离心上层细胞后，对骨髓细胞的数目进行计数，接着立即将该骨
髓细胞用于与成骨细胞共培养系统。

b)成骨细胞的制备

从无菌条件下从1～2天新生ICR小鼠切除颅盖，用PBS溶液洗
涤并与酶溶液混合物(0.2％胶原酶和0.1％dispase)在37℃轻微震荡下
一起培养。这一过程依次重复(10、10、10、20、20和20分钟)，接
着，将具有成骨细胞特征的颅盖细胞大部分从III～VI消化组释放，
收集并用培养基(无血清α-MEM)洗涤。将洗涤的细胞在含有10％FBS
的α-MEM培养基中培养2～3天。传代培养后，将这些细胞用于本实
验，并稀释到浓度为1×10⁶细胞/mL，贮存在-70℃下。

2.破骨细胞分化的测量

a)样本的制备

将用于本发明的测试物质的N-羟基-4-{5-[4-(5-异丙基-2-甲基
-1，3-噻唑-4-基)苯氧基]戊氧基}-苄脒(DW1350)和4-{5-[4-(5-异丙基-2-
甲基-1，3-噻唑-4-基)苯氧基]戊氧基}-苄脒(DW1352)，以及作为对照的
N，N-二异丙基4-[4-(3-氨基苯并[d]异噁唑-6-基氧)丁氧基]-3-甲氧
基苄脒(下文中称为“HS-1141”)和4-[5-[4-(氨基亚氨基甲基)苯氧基]
戊氧基]-3-甲氧基-N，N-二(1-甲基乙基)苯甲酰胺马来酸(Morrissey，
M.M.，Suh，H.美国专利第5451700号；下文中称为“CGS-25019C”)，
LTB-4受体拮抗剂溶于无菌蒸馏水中，在稀释后制备所需要的浓度。
加入到培养基中的最中样本体积以1∶1000的比率确定。

b)经共培养系统与样本反应

将从以上第一项制备的骨髓细胞和来自颅盖的成骨细胞共培养，
以进行破骨细胞分化。将骨髓细胞(25000细胞/cm²)和成骨细胞(10000
细胞/cm²)加样于96孔板的含有10％FBS与样本的α-MEM培养基中，
并接着将反应混合物培养7天。还从培养的第一天开始向培养基中连
续加入一些分化因子，如地塞米松(10^-6M)和维生素D₃(10^-9M)。每2
～3天以含有样本和分化因子混合物的新鲜培养基更换培养基。

c)破骨细胞分化的评价

1)耐酒石酸酸性磷酸酶(tartarate resistance acid phosphatase，
TRAP)染色溶液的制备

将TRAP用作测量破骨细胞的标记物，因为它对TRAP染色溶液
显示阳性反应。通过将5mg萘酚AS-MS磷酸盐(sigma N-4875)、底
物和25mg着色剂(Fast Red Violet LB盐)溶于N，N-二甲基甲酰胺(约
0.5mL)中并加入含有50mM酒石酸的0.1N NaHCO₃缓冲液的方式制
备TRAP染色溶液，在使用前将反应混合物贮存在冰箱中。

2)染色方法

在7天培养后，从孔中移出培养基，接着用PBS溶液将细胞洗
涤一次，并固定于含有10％福尔马林的PBS，持续2～5分钟。将细
胞也固定于混合溶液，乙醇和丙酮(1/1)中，持续约1分钟，并干燥。
用TRAP染色溶液将细胞进一步处理15分钟，并用PBS洗涤，以在
镜检下测量细胞染色程度的实验结果。

3)实验结果的分析

在镜检下计算显示TRAP阳性反应的只带有3个以上核的破骨细
胞的数目，每个实验通过三次得到再次证实，以获得更可信的数据。

如下表1所示，与对照相比，各实验组对破骨细胞分化的抑制作
用表示为抑制百分数值，并将对破骨细胞分化的50％抑制浓度计算为
IC₅₀。

将各测试物质的抗骨质疏松症作为与对照，如CGS-25019C和
HS-1141(美国专利第6150390号和韩国专利申请第98-3138号)进行
比较，HS-1141是与CGS-25019C属于同一家族的常规抗骨质疏松症
药，这证实了对存在的LTB-4受体的拮抗作用。

表1

如表1所示，实验结果表明，DW1350和DW1352对破骨细胞增
殖和分化的抑制作用显著好于HS-1141和CGS-25019C。这些在低浓
度下影响破骨细胞分化的测试物质可能证明有效预防和治疗骨质疏
松症。

实施例2：融合测定

设计该测定用以评价各测试物质在分化过程期间破骨细胞融合
方面的影响，在所述分化过程中不成熟的融合前(prefusion)破骨细胞
(pOC；还具有一个核的破骨细胞结构)通过细胞与细胞融合而转化成
成熟的多核破骨细胞(OCL)(Gregg Wesolowski等，Experimental Cell
Research 219，679-686，1995)。

1.融合前破骨细胞(pOC)的制备

可以通过将从实施例1制备的骨髓细胞和成骨细胞共培养而获
得融合前破骨细胞。将成骨细胞(约5×10⁵细胞/板)和骨髓细胞(约1×
10⁷细胞/板)的混合物在100mm培养皿中共培养。从培养第一天开始
向培养基中加入一些分化因子，如地塞米松(10^-6M)和维生素D₃(10^-9
M)。每2天以含有分化因子的新鲜培养基更换培养基。

因为在4天的共培养期间，在融合过程中形成大量具有一个或多
个核的融合前破骨细胞，因此在4天后分离共培养细胞。从细胞中除
去培养基，并加入0.2％胶原酶溶液(4mL)，将细胞在37℃下培养20
分钟，以分离附着的细胞。由于多数分离的细胞是成骨细胞，因此将
所有的成骨细胞用PBS溶液洗涤两次或三次，以将它们彻底除去。

通过加入含10％BSA的echistatin反应20分钟而分离剩余的融
合前破骨细胞之后，通过离心收集细胞。

2.融合实验的反应

将在各浓度下稀释的测试物质在α-MEM培养基(加入10％FBS)
中稀释到所需浓度，将它们加于96-孔板中，每孔剂量为100μL。将
从前述第一项分离的破骨细胞单核细胞以每孔5×10³细胞/100μL的
剂量加于96孔板上，并在37℃下培养24小时，这样成功进行破骨
细胞融合。在没有样本和阳性对照的情况下，以与上面相同的方式进
行实验。用于这一实验的阳性对照包括与HS-1141、CGS-25019C、
DW1350和DW1352具有相似化学结构的4-{4-[4-(5-异丙基-2-甲基
-1，3-噻唑-4-基)苯氧基]丁氧基}-苄脒(下文中称为“DW1351”)和N-
羟基-4-{4-[4-(5-异丙基-2-甲基-1，3-噻唑-4-基)苯氧基]丁氧基}-苄脒
(下文中称为“DW1349”)。

3.破骨细胞融合的测量及其分析

从细胞中除去培养基，接着将细胞用PBS洗涤一次，并固定于
含有10％福尔马林的PBS溶液中，持续约5分钟。再将细胞固定于
乙醇和丙酮(1/1)混合溶液中，持续约5分钟，并干燥。将细胞用TRAP
染色溶液进一步处理15分钟并用水洗涤，从而在显微镜下观察细胞。
测量从单核细胞经融合过程分化成多核细胞(具有10个以上核的破骨
细胞)的TRAP-阳性破骨细胞数目。

下表2显示测量的细胞数目对对照的％抑制浓度的差别。

表2

如表2所示，实验结果证明，DW1350和DW1352对破骨细胞融
合发挥显著的抑制作用(IC₅₀分别为0.81和0.74uM)。更具体地说，
DW1350与DW1352对破骨细胞融合的抑制作用可能预防成熟破骨
细胞形成，这将导致破骨细胞依赖性骨吸收的显著抑制。不管在何种
药物浓度下，对照CGS-25019C对破骨细胞融合都几乎没有抑制作
用。HS-1141对破骨细胞融合的抑制作用低于DW1350与DW1352，
虽然前者依赖于药物浓度。在具有与DW1350和DW1352非常相似
的结构的DW1349和DW1351的情况下，它们对破骨细胞融合的抑
制作用显著低于DW1350和DW1352，虽然前者与HS-1141一样依赖
于药物浓度。

因此，预期在4-[(4-噻唑基)苯氧基]烷氧基-苄脒衍生物中，
DW1350和DW1352都可能基于破骨细胞融合抑制机理通过有效抑
制成熟破骨细胞形成而被开发成新的抗骨质疏松症药。

实施例3：骨再吸收的测量(点隙形成测定)

成熟破骨细胞(OCL)主要与通过骨吸收除去矿物质有关。设计本
实验以使用象牙碎片测量各测试物质对破骨细胞骨再吸收的抑制作
用(Eijiro Jimi等，Endocrinology 137，p2187-2190，1996)。

1.成熟破骨细胞的制备

a)胶原凝胶溶液的制备

使用含有胶原凝胶(细胞基质I-A型)的培养皿进行骨髓细胞和成
骨细胞的共培养系统。在低温下以7∶2∶1的比率混合胶原、5倍浓
缩的α-MEM培养基和0.05M NaOH缓冲液(2.2％NaHCO₃，pH 7.4)，
接着贮存在低温下。接着，向100mm培养皿中加入4mL混合溶液，
均匀施加并在37℃下放置5分钟。

b)经共培养系统制备成熟破骨细胞

使用α-MEM培养基，将从实施例1分离的骨髓细胞(约1×10⁷
细胞/板)和成骨细胞(约5×10⁵细胞/板)混合物加于含有胶原凝胶的
100mm培养皿上。在分化因子，如维生素D(10^-9M)和地塞米松(10^-6
M)的存在下进行共培养。如上所述，经7天的共培养，获得大量具
有骨再吸收能力的成熟多核破骨细胞。从细胞中除去培养基，并加入
0.2％胶原酶溶液，通过培养20分钟而分离附着的细胞。经离心收集
细胞。将收集的粗破骨细胞再次在α-MEM培养基中稀释至浓度为
5000细胞/100μl。

2.苏木精染色溶液的制备

通过以下方式制备苏木精染色溶液：将制备的苏木精(1g)溶于
500ml蒸馏水中，并加入500ml蒸馏水和碘化钠(0.2g)，将反应混合
物搅拌15分钟。再向反应混合物中加入铵矾(50g)和7.5ml醋酸，并
滤出。

3.象牙碎片上的反应

对切割成厚度为1mm的象牙碎片进行消毒后，将各碎片放置在
96孔板中，接着加入100μl α-MEM培养基(10％FBS)。为了测量其
对破骨细胞点隙形成的抑制作用，加入各测试物质，每个浓度的最大
量为3μl。加入测试物质后，再加入100μl破骨细胞溶液，剧烈混合，
并在37℃下使用5％CO₂培养箱培养24小时。为了观察在象牙碎片
上形成的点隙，在将成熟破骨细胞部分从96孔板中移出后，将它们
向上引导并放置在纸巾上。将象牙上的细胞除去后，在象牙上滴加
10μl苏木精溶液进行染色，持续约5分钟。用软棉棒摩擦象牙碎片
表面以彻底除去染色溶液。

4.点隙形成的观察及其分析

下表3显示在镜检下，在各浓度下，象牙碎片上的点隙数目对对
照的抑制百分数。

表3

如表3所示，实验结果证明，DW1350和DW1352都对破骨细胞
骨再吸收发挥明显的抑制作用。它还表明，DW1350和DW1352的IC₅₀
值分别为0.075μM和0.131μM，这比HS-1141的抑制作用高3～6
倍。在阳性对照CGS-25019C的情况下，它对破骨细胞骨再吸收的抑
制作用较低。

实施例4：测量成骨细胞活性的碱性磷酸酶(ALP)活性的评价

设计该实验以通过与成骨细胞骨形成具有密切关系的ALP活性
来评价成骨细胞的分化和活性(Y.Wada等，Bone，22，479-485，1998)。

将来自成骨细胞的MC3T3-E1细胞(3000细胞/孔)放置在96孔板
上，经24小时培养后，以含有各种分化因子，如抗坏血酸(100ug/ml)
和β-甘油磷酸(β-glycerophosphatic acid)(5mM)的新鲜培养基更换培
养基。还用测试物质处理该培养基，并且每3天以新鲜培养基更换含
有分化因子和样本的培养基。

两周后终止培养以测量ALP活性。除去上清液后，加入0.5％
Triton X-100使细胞发生溶胞。将100μl p-硝基苯基磷酸酯(1.21mM)
加入50ul以上混合物中。在37C下将混合物培养30分钟，并且加
入0.2N氢氧化钠(50μl)，终止反应。使用p-硝基酚作为标准物质以
405nm的吸光度作标准曲线，测量这样反应的测试物质的吸光度，
以观测p-硝基酚的产生量。

如下表4所示，测定各测试物质的反应混合物中含有的蛋白的量
之后，以每时间单位(每分钟或每小时)产生的p-硝基酚的量(nM)/1μg
蛋白确定ALP活性单位。

表4

如表4所示，实验结果证明，在所有测试物质中，DW1350发挥
最高的ALP活性。还发现DW1352的ALP活性超过对照、HS-1141
和CGS-25019C的活性。这一实验已表明，DW1350和DW1352通过
影响成骨细胞分化和形成而在刺激成骨细胞活性方面有效。因此，
DW1350和DW1352都是预防和治疗骨质疏松症的非常有用的药物，
因为它能抑制破骨细胞功能，同时刺激成骨细胞活性。