一种提高转基因鲤受精卵孵化率的方法.pdf

一种提高转基因鲤受精卵孵化率的方法
    所属领域

    本发明属于鲤鱼转基因育种技术领域，涉及转基因鲤制备中的外源基因导入技术，由其是利用显微注射技术构建转基因鲤方法。

    背景技术

    转基因鱼研究已有近二十年的历史。将外源基因导入鱼类受精卵主要采用显微注射技术，此外还利用精子携带、电脉冲导入等方法构建转基因鱼。由于用后两种方法制备转基因鱼外源基因整合率较低，在实际工作中很少采用。而原始制备转基因鱼的显微注射方法是：先将鱼受精卵的卵膜用人工拨膜或胰酶消化的方法脱膜，然后再进行显微注射。由于整个受精卵没有卵膜的保护给孵化管理带来很大的不便，更严重的是卵黄等营养物质暴露在水体中，极易遭受细菌等侵害，加之显微注射对受精卵造成的机械损伤，导致孵化率极低。另外采用显微注射技术制备转基因鱼外源基因在基因组中的整合是随机的。要获得有外源基因整合的转基因鱼，就必需有足够数量地转基因鱼供筛选。因此，大量制备转基因鱼是转基因鱼育种研究成败的关建。

    【发明内容】

    为了提高转基因鲤受精卵的孵化率，扩大转基因鲤的数量，本发明在原有技术基础上进行了改进，这一技术改进不仅解决了转基因鲤受精卵孵化率低的问题，而且还简化了显微操作程序，同时转基因鲤数量得到了大幅度提高。

    本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：用拉针仪将显微注射用玻璃针的直径拉至10微米，对未经物理或化学方法脱膜处理的受精卵进行外源基因直接导入。由于未脱膜的受精卵有很大的内压，用直径小于10微米的玻璃针刺压卵膜可以避免挤破卵子，卵膜上小于10微米的小孔靠卵子的自身修复能力将很快得到修复。同时未脱膜的受精卵有卵膜的包被减少了水体中细菌的感染机会。而玻璃针的直径小于10微米，针内的外源核酸及受精卵的卵黄极易睹塞针尖降低外源基因导入的效率。因此，用10微米直径的显微注射用玻璃针对未脱膜的受精卵直接进行外源基因导入，可减少细菌对受精卵的危害、提高受精卵的孵化率，达到了获得足够数量的转基因鲤用于外源基因整合、表达筛选的目的。

    本发明的有益效果是，在简化制备转基因鲤的操作程序的同时，减少了细菌对导入外源基因受精卵的危害程度及玻璃针对受精卵的机械损伤，提高了导入外源基因受精卵的孵化率，为后序大量的转基因鲤的制备提供了必要的技术保障。