治疗牙槽骨吸收的单方剂地龙口服液及其制取方法.pdf

治疗牙槽骨吸收的单方剂地龙口服液及其制取方法。用于治疗炎症性牙槽骨吸收和其它破骨细胞性骨吸收疾病。其制法：取地龙，经清洗、干燥并粉碎后与蒸馏水或95％乙醇以1∶10(W∶V)混合，经沸水回流、粗滤，并将滤渣再沸水回流、粗滤，合并两次滤液并蒸发浓缩，在水提液或醇提液的浓度达1－10kg/L、多糖含量10％以上便得。以小鼠成骨细胞株MC3T3－E1作为细胞模型、以大肠杆菌内毒素脂多糖诱导SD大鼠牙槽骨吸收作为动物模型的药理实验，证实对成骨细胞增殖、分化和基质矿化的促进作用及对动物性牙槽骨吸收抑制的显著效果，从而为治疗牙槽骨吸收及相关骨科疾病提供中草药制剂。其方法简便、价格低廉、易于推广应用。

1、  一种治疗牙槽骨吸收的单方剂地龙口服液，是一种多糖含量在10％以上的地龙水提液或地龙醇提液。

2、  一种制取权利要求1的治疗牙槽骨吸收的单方剂地龙口服液的方法，其特征是：它包含以下的步骤：1)取用地龙，经清洗、干燥并粉碎成粉料；2)取用提取液，该提取液是蒸馏水或95％乙醇，然后将地龙粉料和蒸馏水或95％乙醇以1∶10(W∶V)的比例混合均匀后，通过沸水回流3～10h进行粗滤，并在其滤渣中再以上述比例加蒸馏水或95％乙醇进行沸水回流3～10h、其后再粗滤；3)合并上述的两次滤液并作蒸发浓缩，在浓度达到1-10kg/L、多糖含量在10％以上即是治疗牙槽骨吸收的单方剂地龙口服液。

3、  一种含权利要求1所述的治疗牙槽骨吸收的单方剂地龙口服液的复合药，其特征是：单方剂地龙口服液还同药用缓释介质结合成一种可置于牙周袋的治疗牙周炎的缓释型药，其制备方法是直接将单方剂地龙口服液与药用缓释介质结合，成为软膏或凝胶或缓释膜。

治疗牙槽骨吸收的单方剂地龙口服液及其制取方法
技术领域
一种用于治疗炎症性牙槽骨吸收和其它破骨细胞性骨吸收疾病或骨质疏松性疾病的药物，尤其是一种能阻断牙槽骨吸收或促进牙槽骨再生的单方剂地龙口服液及其制取方法。
背景技术
众所周知，骨代谢是成骨细胞和破骨细胞的动态平衡过程，该平衡的失调将引发骨代谢性疾病，例如牙周炎是各国人群中最为常见的口腔疾病之一，其主要病理改变之一是牙槽骨的吸收，从而导致牙松动甚至脱落。牙槽骨是人体骨骼中代谢最为活跃的骨组织，正常生理情况下，成骨细胞和破骨细胞平衡维持着牙槽骨代谢的稳定；但牙周感染时，细菌内毒素及多种炎性因子诱导破骨细胞活化、增殖，故抑制了成骨细胞的活性，使牙槽骨代谢平衡失调，从而出现病理性牙槽骨吸收。目前是在临床上治疗牙槽骨吸收，是采用自体骨或人工骨植入；该治疗方法因自体损伤大、生物相容性差、对手术医生的操作要求高、价格昂贵而受到制约，故难以在基层医院推广。因此人们期望得到一种能方便服用的、内含有效治疗牙槽骨吸收及骨科的其它疾病的中草药制剂。
一种在中医骨伤科方剂中较为常见的中药-地龙，其拉丁文名为Pheretima guillelmi、是矩蚓科动物参环毛蚓或缟蚯蚓的干燥体。据我国有关药典介绍，地龙含有多糖以及蚯蚓解热碱(Lum-brofebrine)、蚯蚓素(Lumbrilin)、蚯蚓毒素(Terrestro-Lumbroly-sin)、氨基酸类、嘌呤类、胆碱、脂肪酸、微量元素、多种维生素和大量蛋白质，还有人体所必需的八种氨基酸，它具有促进骨折愈合、强骨补肾的功效，故长期以来，地龙出现在中医骨伤科的多方剂中草药中，通过水煎成汤药或压研成粉末伴入药剂。但遗憾的是人们至今还没有对地龙的疗效有准确的了解，特别是对单方剂地龙能否有效抑制骨质吸收、促进骨质再生等方面缺少研究、更无实验验证，因此也就无法将药典中记载的内含众多有效成份的单方剂地龙制成成药、用于治疗牙槽骨吸收及骨科的其它疾病。
发明内容
本发明是要解决人们长期以来期望得到的一种能以实验验证其确实有效治疗牙槽骨吸收及骨科其它疾病的中草药制剂的问题，提供一种治疗牙槽骨吸收的单方剂地龙口服液及其制取方法，并使该口服液具有疗效可靠、其制取方法科学可行、制作简便且成本低等特点。
本发明治疗牙槽骨吸收的单方剂地龙口服液，是一种多糖含量在10％以上的地龙水提液或地龙醇提液。
上述的单方剂地龙口服液的制取方法包含以下的步骤：1)取用地龙，经清洗、干燥并粉碎成粉料；2)取用提取液，该提取液是蒸馏水或95％乙醇，然后将地龙粉料和蒸馏水或95％乙醇以1∶10(W∶V)的比例混合均匀后，通过沸水回流3～10h进行粗滤，并在其滤渣中再以上述比例加蒸馏水或95％乙醇进行沸水回流3～10h、其后再粗滤；3)合并上述的两次滤液并作蒸发浓缩，在浓度达到1-10kg/L、多糖含量在10％以上时，得到的地龙水提液或地龙醇提液即为本发明的治疗牙槽骨吸收的单方剂地龙口服液。
本发明治疗牙槽骨吸收的单方剂地龙口服，还可同药用缓释介质复合成一种可置于牙周袋以治疗牙周炎的缓释型药。该缓释型药的制备方法是将单方剂地龙口服液与药用缓释介质混合，再按常规方法制成软膏或凝胶或缓释膜。
本发明的有益效果是：1)本发明方法以单方剂地龙为原料制得的口服液，通过以小鼠成骨细胞株MC3T3-E1作为细胞模型，及以大肠杆菌内毒素脂多糖诱导的SD大鼠牙槽骨吸收模型的药理实验，证实它具有对成骨细胞增殖、分化(碱性磷酸酶和骨钙素分别是成骨细胞分化早期和中期的标志物)和基质矿化的促进作用及对动物性牙槽骨吸收的明显的治疗效果，也验证了我国药典中记载的关于地龙具有促进骨折愈合、强骨补肾的功效；并且在沸水回流中能充分提取地龙各有效组份并留存在口服液中；如再通过临床试验，即可用于人类牙槽骨吸收及骨科的其它疾病的治疗或促进骨再生；从而可解决人们期望得到的能有效治疗牙槽骨吸收及骨科的其它疾病的中草药制剂的问题；2)本发明方法所用的地龙是一种无害人体的安全可靠的中药，且制取的方法简便可行、取材方便、价格低廉，故易于推广应用；3)本发明方法制得的单方剂地龙口服液，与现有骨伤科中医多方剂中的地龙疗效大有不同，中医多方剂中的地龙在与其它药同煎的过程中，因受到其它中草药不能长时间煎熬的影响，故不能充分提取地龙的有效成份；而本发明方法通过长时间的沸水回流能充分提取地龙各有效组份，并可直接取用，以省去煎药的麻烦。
附图说明
图1是大肠杆菌内毒素脂多糖诱导的牙槽骨吸收大鼠牙体-牙周标本中位于牙槽骨表面的破骨细胞(苏木素-伊红染色，×100倍)；
图2是正常大鼠牙体-牙周标本的形态(苏木素-伊红染色，×100倍)；
图3是大肠杆菌内毒素脂多糖诱导的牙槽骨吸收大鼠牙体-牙周标本中位于牙槽骨表面地活性破骨细胞(抗酒石酸酸性磷酸酶染色，×400倍)；
图4是大肠杆菌内毒素脂多糖诱导后30d牙槽骨吸收大鼠牙体-牙周标本中位于牙槽骨表面的破骨细胞(苏木素-伊红染色，×200倍)；
图5是用药10天的牙槽骨吸收大鼠根分叉区新生未钙化骨样基质及附着的成骨细胞(苏木素-伊红染色，×100倍)。
具体实施方式
实施例1、本实施例治疗牙槽骨吸收的单方剂地龙口服液，是一种能通过凝胶渗透色谱测试方法测得其多糖的含量在10％(重量)以上的地龙水提液或醇提液。
上述的单方剂地龙口服液的制取方法是：1)取用一种地龙，其拉丁文名是Pheretimaguillelmi，属于矩蚓科动物参环毛蚓或缟蚯蚓的干燥体；先经清洗、干燥并粉碎成粉料；2)取用提取液，该提取液是蒸馏水或外购的95％乙醇，然后将地龙粉料和蒸馏水或95％乙醇以1∶10(W∶V)的比例混合，经沸水回流3～10h后进行粗滤，并在滤渣中以上述比例加蒸馏水或95％乙醇再进行沸水回流3～10h、再粗滤；3)合并上述两次滤液并作蒸发浓缩，在浓度达到1-10kg/L、多糖含量在10％以上时，所得到的地龙水提液或地龙醇提液即为本发明的治疗牙槽骨吸收的单方剂地龙口服液。
上述的沸水回流是通过对内含地龙粉料和蒸馏水或95％乙醇的容器加热、沸腾，蒸汽上升，并通过其上的冷凝器冷凝后又回到容器内再加热，如此不断地加热上升、冷凝回流，一个循环接下一个循环直到到达设定的时间为止。沸水回流的时间长短是根据地龙粉料的颗粒度大小选择并设定，颗粒度越大，沸水回流的时间越长，颗粒度越细小，则沸水回流的时间可短，因此视颗粒度的大小在3～10h(小时)内选取，以充分提取地龙所含的各有效成份。
为证实本实施例的单方剂地龙口服液对成骨细胞增殖、分化(碱性磷酸酶和骨钙素分别是成骨细胞分化早期和中期的标志物)和基质矿化的促进作用及对动物性牙槽骨吸收的治疗效果，分别以小鼠成骨细胞株MC3T3-E1作为细胞模型、以大肠杆菌内毒素诱导的SD大鼠牙槽骨吸收模型进行药理实验。
药理动物实验如下：1)用大肠杆菌内毒素(E-LPS)制备稳定可靠的实验性大鼠牙槽骨吸收模型；其中一组采用SD大鼠局部注射大肠杆菌内毒素建立牙槽骨吸收模型(以下称谓建模大鼠)：先给SD大鼠吸入乙醚麻醉，然后在左上颌第一磨牙颊侧正中龈下注射含10g/L大肠杆菌内毒素的生理盐水50μL，且每48小时注射1次，共4次；通过牙槽骨骨密度(BoneMineraldensity，BMD)、破骨细胞数、组织病理学检查确定牙槽骨吸收模型制备的效果；该建模大鼠(n＝5)实验牙位牙槽骨BMD(0.220±0.026)低于正常大鼠(n＝4)(0.343±0.015)(p＜0.05)、破骨细胞数目(7.800±2.683)高于正常大鼠(0.400±0.548)，牙槽骨表面出现Howship陷窝，陷窝内可见破骨细胞，未见成骨细胞及新生骨样基质，如图1所示；另一组是正常对照组，即大鼠牙槽骨表面光滑完整，未见明显破骨或成骨活动，如图2所示；2)对上述的建模大鼠用本实施例单方剂地龙口服液15g/kg每天灌胃1次，分别用药10、20和30d；3)用血清碱性磷酸酶(Alkali phosphate，ALP)活性、钙离子(Ca²⁺)和骨钙素(Osteocalcin，OC)浓度测定，以及牙体-牙周联合标本骨密度(Bone Mineraldensity，BMD)、抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate resistant acid phosphatase，TRAP)染色破骨细胞计数、HE染色组织病理学检查，评价DFS水提液治疗实验性牙槽骨吸收的疗效；结果显示与相应阴性对照组图4比较，用地龙口服液(15g/kg)灌胃治疗10天SD大鼠的实验牙位骨密度显著升高、牙周破骨细胞消失(P＜0.05，如表1所示)，Howship陷窝明显减少，大多出现根分叉区有成骨细胞附着的新生未钙化骨样基质(如图5所示)，且第20天和30天检查结果与第10天相似。阴性对照组大鼠第10，20，30天的牙体-牙周标本中仍存在着明显的Howship陷窝，陷窝内可见破骨细胞，未见成骨细胞及新生未钙化骨样基质(如图3、图4所示)。由此可证明：地龙水提液对SD大鼠实验性牙槽骨吸收有明显的疗效，它能抑制骨质吸收、促进骨质再生。
表1  治疗组和对照组大鼠牙体-牙周标本中的破骨细胞数目(x±s，n＝5)
组别      时间(d)    BMD/g·cm²       破骨细胞数目    P值(与对照比较)
治疗组     10        0.338±0.029^*    0.600±0.548      ^*
           20        0.334±0.017^*    0.200±0.237      ^*
           30        0.331±0.025^*    0.000±0.000      ^*
对照组     10        0.229±0.024      8.000±2.916
           20        0.299±0.013      5.000±1.345
           30        0.281±0.013      4.600±1.949
注：^*中P＜0.05，^**中P＜0.001
表2  不同浓度地龙口服液作用的MC3T3-E1细胞MTT法吸收度A₄₉₀(x±s，n＝6)
组别        药物浓度(mg/L)      吸收度A₄₉₀       P值(与对照比较)
水提液         0.01           0.4516±0.0835
               1              0.4318±0.0204          ^*
               100            0.4794±0.0641
对照组(水)     -              0.3800±0.0141
醇提液         0.01           0.4428±0.0125          ^**
               1              0.4414±0.0296          ^**
               100            0.3862±0.0288
对照组(醇)     -              0.3723±0.0356
注：^*中P＜0.05，^**中P＜0.001
表3  不同浓度地龙口服液作用的MC3T3-E1各增殖周期的细胞百分率(％)
组别        药物浓度(mg/L)    G₀/G₁  S      G₂/M  S+G₂
水提液        0.01             53.7    40.2    6.1    46.3
              1                60.9    31.8    7.4    39.2
              100              55.6    42.2    2.2    44.4
对照组(水)    -                63.0    32.0    5.0    37.0
醇提液        0.01             51.1    44.0    4.8    48.8
              1                55.6    39.9    4.5    44.4
              100              59.1    34.6    6.3    40.9
对照组(醇)    -                61.5    33.4    5.1    38.5
表4  不同浓度地龙提取液作用的MC3T3-E1细胞ALP活性(x±s，n＝6)
组别            药物浓度(mg/L)           ALP活性(U/L)
水提液             0.01                 9.5000±0.5477
                   1                    10.333±0.5164
                   100                  11.000±2.2804
对照组(水)         -                    9.6667±0.8165
醇提液             0.01                 9.5000±0.5477
                   1                    9.5000±1.0488
                   100                  8.6667±1.0328
对照组(醇)         -                    10.000±0.8944
表5  不同浓度地龙提取液作用的MC3T3-E1细胞培养上清中的骨钙素浓度(x±s，n＝6)
                                骨钙素浓度(ng/ml)
组别      药物浓度
          (mg/L)   3d  P值_{(与对照组比较)}     6d              9d  P值_{(与对照组比较)}) 12d  P值_{(与对照组比较)}
水提液      0.01   0.823±0.340^*      1.715±0.779       1.614±0.486         0.504±0.125
            1      0.634±0.092        1.345±0.548       1.506±0.903         0.525±0.117
            100    0.493±0.183        2.117±0.544       2.372±0.798         0.837±0.100^**
对照组_(水)  -      0.481±0.119        1.559±0.423       2.850±1.324         0.381±0.229
醇提液      0.01   0.735±0.252        0.970±0.159       1.967±0.378         1.019±0.281
            1      1.233±0.471^*      1.584±0.621       2.784±0.725         1.024±0.695
            100    0.915±0.254        0.748±0.210       2.023±0.454^**       0.817±0.128
对照组_(醇)   -     0.741±0.117        0.845±0.148       1.665±0.329         1.318±0.638
注：^*中P＜0.05，^**中P＜0.001
表6  不同浓度地龙口服液作用的MC3T3-E1细胞基质矿化面积百分比(x±s，n＝6)
组别       浓度(mg/L^-1)          基质矿化面积(％)    P值(与对照比较)
地龙水提液   0.01                 0.5250±0.1308        ^*
             1                    0.6017±0.0717        ^**
             100  0.4567±0.0812
对照组(水)    -                   0.3600±0.1014
地龙醇提液   0.01                 0.4933±0.0671        ^*
             1                    0.3550±0.0704
             100  0.4150±0.0592
对照组(醇)    -                   0.3722±0.0213
注：上述表中的^*中P＜0.05，^**中P＜0.001。
此外，在细胞学实验研究中，从表2中看到：1mg/L地龙口服液能促进MC3T3-E1细胞增殖(P＜0.05)；1mg/L和0.01mg/L地龙醇提液能显著促进MC3T3-E1细胞增殖(P＜0.001)。从表3中可看到；各浓度的地龙水提液和醇提液均能使S期MC3T3-E1细胞百分率升高，G¹期细胞百分率减少。从表4中看到：各试验组细胞ALP活性无明显升高(P＞0.05)。从表5中看到：0.01mg/L地龙水提液和1mg/L地龙醇提液在作用于MC3T3-E1细胞第1-3d内可提高MC3T3-E1细胞骨钙素合成和分泌(P＜0.05)，100mg/L地龙醇提液在提取液作用于MC3T3-E1细胞第7-9d内、100mg/L地龙水提液在提取液作用于MC3T3-E1细胞第10-12d内可显著提高MC3T3-E1细胞骨钙素合成和分泌(P＜0.001)。从表6中看到：0.01mg/L地龙水提液和醇提液均可提高细胞体外钙(P＜0.05)，1mg/L地龙水提液提液可显著促进细胞体外基质矿化(P＜0.001)。
上述的药理实验是本实施例单方剂地龙口服液治疗牙槽骨吸收的理论基础，它具有进一步研发抗骨质疏松或骨质吸收新药的前景。
实施例2、本实施例治疗牙槽骨吸收的单方剂地龙口服，还可同药用缓释介质复合成一种可置于牙周袋以治疗牙周炎的缓释型药。该缓释型药的制备方法是将单方剂地龙口服液与药用缓释介质，如羟乙基纤维素、氯化镁等混合，再按常规方法制成软膏或凝胶或缓释膜。使用该缓释型药时，只要将它置于牙周袋内，以使缓释的药物对口腔中该局部区域的牙周组织发挥持续作用。它不仅有助于对局部疾病的控制与治疗，并且该药物不会刺激到口腔的正常部位。