知母总酚的提取物及其制备方法和用途 【技术领域】
本发明涉及中药有效部位的提取工艺领域，具体地涉及知母的总酚提取物的提取和制备方法。本发明还涉及含知母总酚提取物的组合物。
背景技术
知母是百合科植物知母(Anemarrhena asphodeloides)的根茎，味苦甘，性寒，入肺、胃、肾经，具有清热泻火，生津润燥等功效。是我国传统治疗糖尿病中药。
已有报道表明，知母具有抗病原微生物、解热、抗血小板聚集、降血糖、磷酸酯酶抑制、抗炎和降低转胺酶的作用(知母的化学成分及药理作用研究进展，杨丽蓉等，国外医学中医中药分册2002年第24卷第4期，pp.207-210)。该文献主要综述了知母中皂甙的作用，并将降糖的主要部位归功于芒果苷及其糖苷。
其它人也研究了知母的降血糖作用，将其归功于知母中的萜类、肽类、氨基酸、黄酮、聚糖、多糖、皂甙等(中草药，1996年第27卷第10期，pp.605-606，中国生化药物杂志，2003年第24卷第2期，pp.81-82)。还公开了用于提取知母皂甙的方法，用乙醇和大孔树脂回流洗涤(中国实验方剂学杂志，2001年2月，Vol.7，No.1，pp.9-11)。
虽然对于知母中各种降糖作用的成分已有多种不同报道，但是究竟其中什么成分是主要的降糖部位并没有得到确认。也没有试验将多个提取部位与水煎液的降糖作用相比较，得到知母降糖主要有效部位的报道。对于提取知母总酚的方法和对其用途也没有研究报道。
因此，本领域迫切开发基于知母中降血糖的有效部位的产品和工艺。
【发明内容】
本发明的一个目的是提供一种制备知母总酚提取物的方法，其中通过水性溶剂回流提取，醇沉，柱层析，洗脱，过滤获得有效部位。该总酚提取物可有效降血糖。
本发明的另一个目的是提供知母总酚提取物及含知母总酚提取物地组合物。
在本发明的一个方面，提供了一种制备知母提取物的方法，其特征在于，该方法包括步骤：
(a)用6-14倍知母药材重量的水性溶剂回流提取，获得提取液，所述的水性溶剂是0-60％重量的乙醇水溶液或水；
(b)过滤去除固体，浓缩滤液得到药液；
(c)调节乙醇浓度至75％±15％，放置10-24小时沉淀，分层，过滤获得滤液；
(d)从滤液中回收乙醇，并获得浓缩药液，向药液中加水稀释至2-50倍药材重量，得稀释药液；
(e)将药液pH调至2-8；
(f)将所得药液过树脂吸附柱，所述树脂选自大孔树脂和阴离子交换树脂；
(g)用水洗涤柱；
(h)用pH10-14的碱性溶液洗脱，获得洗脱液；
(i)将洗脱液pH调至2-8，过滤获得液态知母提取物。
在该方面的一个实施例中，步骤(a)中的水性溶剂的用量优选是药材重量的8-12倍，最优选是10倍；水性溶液优选是水。
在本发明的另一个实施例中，该步骤(a)的回流提取分1-4次进行，每次回流提取1-5小时，然后合并提取液。
在本发明的另一个实施例中，该方法还包括步骤：
(j)水浴蒸干溶液，然后在50-100℃烘干，获得固态的知母提取物。
在本发明的另一个实施例中，该步骤(e)中优选将pH调至5±1，最优选是调至5。
在本发明的另一个实施例中，该步骤(f)中的树脂选自中-弱极性大孔吸附树脂，例如或强碱性阴离子交换树脂，其用量为药材重量的0.5-5倍。
在本发明的另一个实施例中，在该步骤(i)中，优选将pH调至5±1，最优选是5，且步骤(h)中碱性溶液为NaOH溶液、KOH、NaCO3、K2CO3溶液或其混合溶液，优选用0.5％NaOH溶液。
本发明的第二个方面提供了一种知母提取物，其特征在于，该组合物中总酚提取物浓度为50％-95％重量。
在本发明该方面的一个实施例中，该提取物是用本发明第一方面所述的方法制备的。
在本发明的第三个方面，提供了一种降血糖的药物组合物，它含有1-99％本发明的知母提取物和1-99％药学上可接受的载体。
在本发明的第四个方面，提供了本发明的知母提取物用于制备降血糖的药物的用途。
【具体实施方式】
本发明经过研究发现，知母中的酚类物质是其主要的降血糖有效成分，在此基础上开发了有效提取知母总酚提取物的方法，从而完成了本发明。
知母是常规的中药材，可将其切成饮片或研磨成粗粉使用。该药材可从各知母产地或中药商店购得，例如安徽毫州药材市场、苏州天灵中药饮片厂等。或可使用其它形式，例如洗净切成条或粉碎成粗颗粒形式。
本发明的知母提取方法采用水性溶剂作为提取试剂，与常规的乙醇粗浸取上清液不同，与其它的氯仿提取法也不同，而且其有效成分在种类上有本质的差异。
步骤(c)中使用的是常规的乙醇沉淀步骤，分层后用常规的滤纸等过滤得到滤液，其中醇浓度大约为60-90％；
本发明中步骤(d)中的回收乙醇步骤，使得药液去除乙醇，从而能吸附在大孔树脂上有效分离所需的组分。回收是通过常规方法进行的，例如蒸馏等。
本发明的柱层析使用各种常规的大孔树脂吸附柱，可采用各种医药级大孔吸附树脂。常用的大孔树脂为中-弱极性。代表性的树脂例子包括：D101，AB-8，LSA-10，LSA-7，XDA-1。优选树脂购自西安蓝深LSA-10。在使用前可先用水平衡。上样，洗涤，洗脱速度不受限制，但优选每公斤树脂洗脱速度在10-300ml/分钟之间，最优选是60ml/min。
本发明(i)中所使用的过滤装置可以是各种常规过滤装置。例如滤纸真空吸滤，多孔树脂，超滤膜，分子筛，填充柱等。
本发明组合物中总酚提取物含量为50％以上(如50-95％，较佳地为60-90％)，有效部位得率为0.5％以上(基于药材总重量)(即得率为提取物与药材投入的百分比，得率0.5％即1公斤知母药材得到5克总酚提取物)。经紫外分光光度法或比色法检测，提取物中有效部位的含量在50％以上。同时，由于操作步骤简单，没有制备TLC，电泳等昂贵步骤，可用于大批量工业生产。
本发明获得的有效部位主要是总酚提取物，具有降血糖、降低链脲菌素或肾上腺素所致高血糖等作用。本发明获得的主要部位毒性低，可以高剂量使用而无副作用。
由于本发明所获得的提取物是酚提取物，因此可以简单的用分光光度计，通过紫外分光光度法或比色法在660nm的波长下检测其有效部位的浓度。
本发明的知母提取物可直接使用，或与药物学上可接受的载体和添加剂一起，制成药物组合物。例如添加甜味剂、调味剂、着色剂和防腐剂，制备口服给药的片剂、锭剂、水或油悬液、可分散性粉末或颗粒、乳剂、硬或软胶囊、或糖浆或酏剂。片剂含有与适用于制造片剂的无毒的可接受的赋形剂混合的活性成分。这些赋形剂可以是例如惰性稀释剂，如碳酸钙、碳酸钠、乳糖、磷酸钙或磷酸钠；成粒剂及崩解剂，例如褐藻酸；粘合剂，如淀粉、明胶或阿拉伯胶；和润滑剂，如硬脂酸镁、硬脂酸或滑石。片剂可无糖衣或用已知技术包衣，来延迟在胃肠道内的解体和吸收，从而在较长时间内提供持续作用。例如，可施用延时物质，如一硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯。口服使用的制剂还可制成硬明胶胶囊，其中活性成分与惰性固态稀释剂，如碳酸钙、磷酸钙或高岭土混合，或制成软明胶胶囊，其中活性成分和水或油性介质，例如花生油、液态石蜡或橄榄油混合。
本发明的药物组合物中有效成分的含量范围是5-20mg/kg/天，可由有经验的医师根据临床需要确定给药途径和剂量。
本发明的药物组合物还可含有其他降血糖成分，例如目前可得的常规降糖药等或其它中药制剂。
本发明的药物组合物可以用各种途径施用，例如口服、注射、透皮吸收，优选是口服。
发明效果
使用本发明的制备方法，可得到具有高浓度的总酚提取物的知母提取物。本发明的知母提取物具有显著的降血糖作用，与消渴丸作用相当。
实施例
实施例1-4知母总酚的提取和检测
1.材料和仪器
材料：产自中国吉林的知母。
树脂：LSA-10，购自西安蓝深
仪器：多功能提取罐(500L)，常州武进孟河制药机械厂
实施例1
取50kg粉末状知母药材，用10倍知母药材量30％乙醇回流提取，共提取两次，每次1小时，合并两次乙醇提取液，过滤，回收乙醇，浓缩，醇沉至含醇70％，回收乙醇，加水稀释至10倍药材重量，得到500kg稀释药液，调pH至5，所得药液过树脂吸附柱(LSA-10)，树脂用量为药材量的2倍，药液过完柱床后用水洗柱床至流出液为无色，0.4％NaOH洗脱至流出液为无色，收集碱洗脱液，调pH至4，过滤，水浴蒸干，60℃真空烘干，得总酚提取物。
实施例2
取50kg颗粒状知母药材，用9倍药材量10％乙醇回流提取，共提取两次，每次1.5小时，合并两次乙醇提取液，过滤，回收乙醇，浓缩，醇沉至含醇80％，回收乙醇，加水稀释至8倍药材重量，得到400kg稀释药液，，调PH4，所得药液过树脂吸附柱(LSA-10)，树脂用量为药材量的3倍，药液过完柱床后用水洗柱床至流出液为无色，0.6％NaOH洗脱至流出液为无色，收集碱洗脱液，调PH5，过滤，水浴蒸干，70℃真空烘干，得总酚提取物。
实施例3
取50kg片状知母药材，用12倍药材量5％乙醇回流提取，共提取两次，每次2小时，合并两次乙醇提取液，过滤，回收乙醇，浓缩，醇沉至含醇75％，回收乙醇，加水稀释至9倍药材重量，得到450kg稀释药液，调PH6，所得药液过树脂吸附柱(LSA-10)，树脂用量为药材量的1倍，药液过完柱床后用水洗柱床至流出液为无色，0.5％NaOH洗脱至流出液为无色，收集碱洗脱液，调PH6，过滤，水浴蒸干，80℃真空烘干，得总酚提取物。
实施例4 知母提取物中总酚含量的检测
1.仪器：紫外可见分光光度计(UV-1240，日本岛津公司苏州工厂)
2.实验方法：
在660nm下常规酚类比色法检测知母提取物溶液中的总酚含量。
3.结果如下：
总酚含量测定
实施例1 55％
实施例2 53％
实施例3 58％
三批50公斤的药材经提取，主要有效部位知母总酚的最终提取率为在60％以上(以药材中含有的总酚为100％)，有效部位得率在0.3％以上(相对药材投入量)，经检测提取物中有效部位的含量在50％以上(总酚在提取物中所占的重量百分比)。
实施例5 知母降糖有效部位的实验研究
本实验通过提取知母三个有效部位，以链脲佐菌素诱导的糖尿病小鼠模型筛选知母的降血糖主要有效部位，并进一步探讨其降糖作用及其机制。
实验材料
1.药物与试剂
知母多糖、总酚、皂甙提取物：
(1)知母多糖采用常规多糖制备方法即水提醇沉法。
(2)总酚提取物：实施例3的提取物。
(3)知母皂甙根据文献方法制备，即乙醇和大孔树脂回流洗涤法(中国实验方剂学杂志，2001年2月，Vol.7，No.1，pp.9-11)。
柠檬酸缓冲液(pH 7.4)：柠檬酸2.1g，柠檬酸钠2.94g，均为分析纯，分别用生理盐水定量至100ml，使其各自的浓度为0.1mM。取上述柠檬酸溶液65.1ml，柠檬酸钠溶液54.9ml，充分混匀，4℃冰箱保存备用
链脲菌素(streptozotocin，STZ)：Sigma公司，临用前用柠檬酸缓冲液配成浓度为1％的STZ溶液
血糖测定试剂盒：卫生部上海生物制品研究所，批号：20039218
肾上腺素：上海天丰药厂产品，批号：020616
消渴丸：广州中药一厂产品，批号：20030316。
2.动物
昆明种小鼠，雌雄各半，体重20±2g，苏州大学医学院实验动物中心提供，实验动物使用许可证号：SYXK(苏)2002-0037，实验动物生产许可证号：SCXK(苏)2002-008。
3.仪器
分光光度计，752型：上海第三分析仪器厂
电热恒温水槽：上海医疗仪器七厂
4.数据处理
采用SPSS10.0版统计分析软件包处理实验数据。采用±s表示，多组剂量资料显著性检验用单因素方差分析(ANOVA)和两两比较(LSD)法。
实验方法与结果
1、知母多糖、知母总酚、知母皂甙对STZ诱导的糖尿病小鼠降糖作用的研究
取健康小鼠70只，腹腔注射100mg/kg STZ，72h后眼底静脉取血以葡萄糖氧化酶法测定血糖，取血糖值≥13.88mmol/L者列为糖尿病小鼠。随机分为6组，即：糖尿病模型组(DM)；知母多糖组(300mg/kg)，知母总酚(100mg/kg，此处和下文中的用量是指提取物的毫克数)，知母皂甙组(100mg/kg)，三个部位给药量相当于同等生药量(5g/kg)，水煎5g/kg，阳性对照消渴丸组(1500mg/kg)；另取8只小鼠作正常对照组。每天灌胃1次，连续给药10天，正常对照组灌胃给予等量生理盐水。末次给药后动物禁食10h，眼底静脉采血，用葡萄糖氧化酶法测定小鼠血糖。
表1给药组对链脲菌素诱导的糖尿病小鼠血糖的影响
组 剂量(mg/kg) 只 血糖(mmol/L)
正常对照组 -- 8 6.16±0.53
糖尿病组 -- 8 15.48±1.35**
知母多糖 300 8 13.61±1.77#
知母总酚 100 9 11.96±1.18##
知母皂甙 100 10 14.16±2.09
知母水煎 5000 10 11.86±1.11##
消渴丸 1500 9 11.67±1.08##
**P＜0.01(相对于对照)；#P＜0.05，##P＜0.01(相对于对照)
结果表明，同等生药量的知母水煎液、总酚均具有高显著降血糖作用(P＜0.01)，知母多糖也具有一定的降血糖作用(P＜0.05)。其中知母总酚降糖作用较多糖具显著性差异，其降糖作用与知母水煎液及消渴丸相当，且用量少，提示知母总酚为知母降血糖主要有效部位。
2、知母总酚对正常小鼠空腹血糖及餐后血糖的影响
小鼠50只，随机分为5组，正常对照组，消渴丸对照组(1500mg/kg)，知母总酚(A)小剂量组(50mg/kg)，中剂量组(100mg/kg)和大剂量组(200mg/kg)，每天灌胃1次，连续给药10天。末次给药后动物禁食10h，眼底静脉采血，用葡萄糖氧化酶法测定小鼠血糖。结果显示：知母总酚三个剂量均可明显降低正常小鼠的空腹血糖(P＜0.05)。另取72只小鼠，分组、给药、取血、检测均与前面相同，只是末次给药前不禁食。结果显示：三个剂量知母总酚对正常小鼠餐后血糖均有显著降低作用(P＜0.05)(表3)。
表2给药组对正常空腹小鼠血糖的影响
组 剂量(mg/kg) 只 血糖(mmol/L)
对照 0 6 5.86±0.49
消渴丸 1500 8 4.52±0.75*
A(L) 200 10 4.06±0.41**
A(M) 100 9 4.15±0.63**
A(S) 50 9 4.82±0.78*
*P＜0.05，**P＜0.01(相对于对照)
表3给药组对小鼠餐后血糖的影响
组 剂量(mg/kg) 只 血糖(mmol/L)
对照 0 8 6.34±0.71
消渴丸 1500 10 5.19±0.36*
A(L) 250 10 4.97±0.51**
A(M) 125 9 4.95±0.66**
A(S) 62.5 9 5.34±0.32*
*P＜0.05，**P＜0.01(相对于对照)
3 知母总酚对STZ诱导的糖尿病小鼠血糖的影响
小鼠58只，随机取8只为正常对照组，其余尾静脉注射链脲菌素100mg/kg造成糖尿病小鼠模型，注射前禁食12h(过夜)，注射后72h眼底静脉取血测定血糖，去除未造成糖尿病模型(禁食12h，血糖低于13.88mmol/L)者，随机分成8组，模型组与空白组灌胃相应剂量的水，给药组分别灌胃小剂量知母总酚[A(S)，50mg/kg]，中剂量[A(M)，100mg/kg]和大剂量[A(L)，200mg/kg]，阳性药组灌胃消渴丸(1500mg/kg)。每天灌胃给药1次，连续14天，末次给药后禁食10h，眼底静脉取血测血糖，方法同上。结果显示：与糖尿病模型组比较，知母总酚大剂量、中剂量治疗后血糖均显著降低(中剂量P＜0.05；大剂量P＜0.01)(Tab4)。
表4 给药组对链脲菌素诱导的糖尿病小鼠血糖的影响
组 剂量(mg/kg) 只 血糖(mmol/L)
对照 0 8 6.03±0.51
模型组 0 8 14.91±2.82**
消渴丸 1500 10 10.93±2.16▲▲
A(L) 200 10 11.34±2.33▲▲
A(M) 100 8 12.69±1.06▲
A(S) 50 9 12.90±1.76
**P＜0.01(相对于对照)▲P＜0.05，▲▲P＜0.01相对于模型组
4 知母总酚对肾上腺素所致高血糖小鼠血糖的影响
正常小鼠60只，随机分为6组，分组及给药方法同上。末次给药后2h，除空白对照组外，其余腹腔注射肾上腺素20μg/kg，空白对照组腹腔注射生理盐水，30min后取血测血糖。结果显示：与肾上腺素模型组相比，知母总酚三个剂量均可明显降低肾上腺素所致高血糖(小、中剂量P＜0.05；大剂量P＜0.01)(表5)。
表5 给药组对肾上腺素诱导的糖尿病小鼠血糖的影响
组 剂量(mg/kg) 只 血糖(mmol/L)
对照 0 8 5.98±0.56
模型组 0 8 12.76±1.84**
消渴丸 1500 9 10.18±1.23▲
A(L) 200 10 9.24±2.09▲▲
A(M) 100 8 10.71±1.93▲
A(S) 50 9 10.96±1.47▲
**P＜0.01(相对于对照)▲P＜0.05，▲▲P＜0.01对模型组
5 知母总酚对葡萄糖所致高血糖小鼠血糖的影响
正常小鼠45只，随机分为6组，分组、给药及给药剂量同上，给药15天，禁食10h，各组小鼠给药后，取血测定空腹血糖(0h)，2h后所有小鼠均灌胃葡萄糖溶液(2g/kg)，眼底静脉取血测定给葡萄糖后0.5h、1h及2h后的血糖值，结果显示：灌服三个剂量知母总酚的小鼠口服葡萄糖后血糖值均较对照组明显降低，表明知母总酚可以改善小鼠糖耐量(表6)。
表6给药组对葡萄糖诱导的糖尿病小鼠血糖的影响
血糖(mmol/L)
组 N
0h 0.5h
正常对照组 6 5.78±0.53 6.06±0.81
葡萄糖组 7 5.91±0.27 9.35±1.36**
A(L) 7 5.51±0.71 6.99±2.32▲
A(M) 8 5.68±0.31 6.54±1.79▲▲
A(S) 8 5.80±0.64 6.19±1.92▲▲
消渴丸 8 6.13±0.49 6.24±1.89▲▲
*P＜0.05，**P＜0.01(相对于葡萄糖组)
6知母总酚对小鼠的急性毒性试验
知母总酚用于治疗糖尿病。为了提供试验安全用药的剂量范围，对知母总酚进行了急性毒性试验。
在预备试验中，小鼠灌服大剂量SY-2提取物原料药亦不致死，不能测出半数致死量，故采用最大给药量试验。
受试药物知母总酚，由苏州思源医药科技开发公司提供。
配制：加蒸馏水，配制成每ml含20mg原料药的混悬液，供灌胃用。
实验动物
ICR小鼠40只，18～21g，雌雄各半，由苏州大学基础医学院实验动物中心提供，合格证：SCXK(苏)2001-0001号。
试验方法与结果
取健康小鼠20只，雌雄各半，0.4ml/10g灌胃给药，一日内灌胃3次，连续观察7日。
小鼠给药当日，行动缓慢，进食减少。次日恢复食量，活动、大便均正常。观察7日未见死亡，第8日空腹12h称重，尸解未见主要脏器有异常。体重变化见表7。
表7 A-2小鼠急性毒性试验体重变化( X±SD)
增长率
性别 鼠数 给药前体重(g) 第8日体重(g)
(％)
♂ 10 20.0±0.82 27.6±1.55*** 38.23
♀ 10 19.6±0.84 24.9±1.61*** 27.01
与给药前比，***P＜0.01
由表7可见，小鼠灌服知母总酚，体重正常增长。
在小鼠急性毒性试验中，采用最大给药量法，知母总酚给药量2400mg/kg为临床人用量10mg/kg的约240倍。给药后观察7日，均未出现死亡及明显中毒反应，体重正常增长。
结论
1.知母总酚和多糖均具有降血糖作用，其中知母总酚的降糖作用尤为显著且与知母水煎液及消渴丸相当，提示知母总酚为知母降糖的主要有效部位。
2.知母总酚可明显降低STZ诱导的糖尿病小鼠血糖，表明知母总酚可通过减弱链脲菌素对胰岛细胞的损伤或改善受损伤的β细胞的功能，改善糖尿病的症状；
3.知母总酚可明显降低肾上腺素所致高血糖，肾上腺素能促进肝糖原和肌糖原的分解而引起血糖升高，而知母总酚可拮抗肾上腺素的升血糖作用，这提示知母总酚降血糖作用还可能与抑制肌体对糖原的分解利用有关。
4，5由本实验结果可知：知母总酚对多种原因引起的动物高血糖均有较好的降糖作用，且疗效与消渴丸相近。
6.急性毒性结果显示，知母总酚毒性小，用药安全。
如上所述，本发明的方法能够高效的提取知母总酚提取物，工艺简单，有效成分含量高。另外，所得到的产品在对于不同机制的糖尿病的降糖中均具有卓越的作用。
如上描述了本发明所公开的知母提取物制备方法和制得的产品及其用途。但需理解其中包含了本领域技术人员所理解的变化和改变。这些变化和改变也包含在权利要求所限定的本发明的范围内。