精浆中性Α－葡糖苷酶定量检测试剂、试剂盒及制备方法.pdf

本发明公开了一种精浆中性α－葡糖苷酶定量检测试剂，包括酸性抑制剂、糖苷酶抑制剂、质控液、底物、底物溶解液、终止液和标准品。通过配置底物，大大提高了反应速度，通过配置质控液并对质控液的检测，监察操作过程准确性。本发明还公开了采用上述精浆中性α－葡糖苷酶定量检测试剂制备的试剂盒及检测试剂的制备方法。

权利要求书
1、  精浆中性α-葡糖苷酶定量检测试剂，包括酸性抑制剂、糖苷酶抑制剂、终止液和标准品，其特征在于：还包括糖苷类底物，用以提高反应速度。

2、  根据权利要求1所述精浆中性α-葡糖苷酶定量检测试剂，其特征在于：
(1)酸性抑制剂：含十二烷基硫酸钠含量为5～15％的去离子水溶液；
(2)糖苷酶抑制剂：含罂粟精素含量为0.005～0.05％的磷酸钾缓冲液；
(3)底物：含4-甲基伞形酮-a-D葡萄糖苷0.5～5.0毫摩尔/升，D-果糖糖苷酶100～500U/升，防腐剂0.05～0.5％的磷酸钾缓冲液；
(4)终止液：含碳酸钠浓度为0.05～0.5摩尔/升的去离子水溶液；
(5)标准品：含对硝基酚(PNP)浓度不超过8×10-3毫摩尔/升、碳酸钠浓度0.05～0.5摩尔/升的去离子水溶液。

3、  根据权利要求2所述精浆中性α-葡糖苷酶定量检测试剂，其特征在于：所述底物是冻干粉，还包括底物溶解液，底物溶解液是含蔗糖0.5～5％、氯化钠10～100毫摩尔/升、水解蛋白0.05～0.5％的去离子水溶液。

4、  根据权利要求3所述精浆中性α-葡糖苷酶定量检测试剂，其特征在于：所述糖苷酶抑制剂是冻干粉、防腐剂优选叠氮钠、水解蛋白优选酪蛋白。

5、  根据权利要求1所述精浆中性α-葡糖苷酶定量检测试剂，其特征在于：还包括糖苷酶类质控液，通过对质控液的检测，监察操作过程的准确性。

6、  根据权利要求5所述精浆中性α-葡糖苷酶定量检测试剂，其特征在于：
(1)酸性抑制剂：含十二烷基硫酸钠含量为5～15％的去离子水溶液；
(2)糖苷酶抑制剂：含罂粟精素含量为0.005～0.05％的磷酸钾缓冲液；
(3)质控液：含α-葡糖苷酶0.002～0.05％、铵离子含量为0.05～0.5摩尔/升、低分子量氨基酸含量为0.1～1.0摩尔/升的pH4.5～7.5的缓冲液；
(4)底物：含4-甲基伞形酮-a-D葡萄糖苷0.5～5.0毫摩尔/升，D-果糖糖苷酶100～500U/升，防腐剂0.05～0.5％的磷酸钾缓冲液；
(5)底物溶解液：含蔗糖0.5～5％、氯化钠10～100毫摩尔/升、水解蛋白0.05～0.5％的蒸馏水溶液；
(6)终止液：含碳酸钠浓度为0.05～0.5摩尔/升的去离子水溶液；
(7)标准品：含对硝基酚(PNP)浓度不超过8×10-3毫摩尔/升、碳酸钠浓度0.05～0.5摩尔/升的去离子水溶液。

7、  根据权利要求6所述精浆中性α-葡糖苷酶定量检测试剂，其特征在于：糖苷酶抑制剂是冻干粉，含铵离子的物质优选氯化铵或硫酸铵，底物是冻干粉，防腐剂优选叠氮钠，水解蛋白优选酪蛋白，低分子量氨基酸优选甘氨酸。

8、  一种根据权利要求4所述精浆中性α-葡糖苷酶定量检测试剂制作的试剂盒，其特征在于：酸性抑制剂5～15ul，糖苷酶抑制剂2.5×10-4～2.5×10-3mg，底物：4-甲基伞形酮-a-D葡萄糖苷0.5×10-4～5.0×10-4毫摩尔，D-果糖糖苷酶0.01～0.05U，底物溶解液50～150ul，终止液500～1500ul，一个或多个不同浓度的去离子水溶液标准品，每一个标准品用量是在酶标仪上比色时吸光度不超过3.0的用量。

9、  根据权利要求8所述试剂盒，其特征在于：酸性抑制剂10ul，糖苷酶抑制剂9×10-4mg，4-甲基伞形酮-a-D葡萄糖苷1.85×10-4毫摩尔、D-果糖糖苷酶0.03U，底物溶解液100ul，终止液1000ul，至少一个标准品，每个标准品250ul。

10、  根据权利要求9所述试剂盒，其特征在于所述标准品是按如下方法制得的标准品5和一个以上的其它标准品：
1)制作标准品贮存液：含对硝基酚浓度为0.02～0.2毫摩尔/升的去离子水溶液；
2)标准品1：碳酸钠浓度不超过0.5摩尔/升的去离子水溶液；
3)标准品2：取5毫升标准贮存液，用碳酸钠浓度不超过0.5摩尔/升的去离子水溶液定容至1000毫升；
4)标准品3：取10毫升标准贮存液，用碳酸钠浓度不超过0.5摩尔/升的去离子水溶液定容至1000毫升；
5)标准品4：取20毫升标准贮存液，用碳酸钠浓度不超过0.5摩尔/升的去离子水溶液定容至1000毫升；
6)标准品5：取40毫升标准贮存液，用碳酸钠浓度不超过0.5摩尔/升的去离子水溶液定容至1000毫升。

11、  一种根据权利要求7所述精浆中性α-葡糖苷酶定量检测试剂制作的试剂盒，其特征在于：酸性抑制剂5～15ul，糖苷酶抑制剂2.5×10-4～2.5×10-3mg，质控液2～8ul，底物：4-甲基伞形酮-a-D葡萄糖苷0.5×10-4～5.0×10-4毫摩尔，D-果糖糖苷酶0.01～0.05U，底物溶解液50～150ul，终止液500～1500ul，一个或多个不同浓度的标准品，每一个标准品用量是在酶标仪上比色时吸光度不超过3.0的用量。

12、  根据权利要求11所述试剂盒，其特征在于：酸性抑制剂10ul，糖苷酶抑制剂9×10-4mg，质控液5ul，4-甲基伞形酮-a-D葡萄糖苷1.85×10-4毫摩尔、D-果糖糖苷酶0.03U，底物溶解液100ul，终止液1000ul，至少一个标准品，每个标准品250ul。

13、  根据权利要求12所述试剂盒，其特征在于所述标准品是按如下方法制得的标准品5和一个以上的其它标准品：
1)制作标准品贮存液：含对硝基酚浓度为0.02～0.2毫摩尔/升的去离子水溶液；
2)标准品1：碳酸钠浓度不超过0.5摩尔/升的去离子水溶液；
3)标准品2：取5毫升标准贮存液，用碳酸钠浓度不超过0.5摩尔/升的去离子水溶液定容至1000毫升；
4)标准品3：取10毫升标准贮存液，用碳酸钠浓度不超过0.5摩尔/升的去离子水溶液定容至1000毫升；
5)标准品4：取20毫升标准贮存液，用碳酸钠浓度不超过0.5摩尔/升的去离子水溶液定容至1000毫升；
6)标准品5：取40毫升标准贮存液，用碳酸钠浓度不超过0.5摩尔/升的去离子水溶液定容至1000毫升。

14、  精浆中性α-葡糖苷酶定量检测试剂的制备方法，其特征在于：
A、酸性抑制剂的制备
1)、将称量的十二烷基硫酸钠加入少量去离子水，温浴振荡溶解，
2)、再加入去离子水定容并室温保存；
B、糖苷酶抑制剂的制备
3)、将称量的罂粟精素溶于磷酸钾缓冲液中，
4)、分装冻干，置2-8℃保存；
C、底物的制备
5)、取4-甲基伞形酮-a-D葡萄糖苷、D-果糖糖苷酶、防腐剂溶于磷酸钾缓冲液中，
6)、分装冻干，2-8℃保存；
D、终止液的制备
7)、取称量的碳酸钠溶于去离子水内，置2-8℃保存；
E、质控液的制备
8)、将称量的α-葡糖苷酶溶于醋酸盐缓冲液中，
9)、加入有效量的氯化铵或硫酸铵等含铵离子的物质和低分子量氨基酸振荡溶后过滤，置2-8℃保存；
F、底物溶解液的制备
10)、将称量的蔗糖、氯化钠、水解蛋白溶于蒸馏水中，置2-8℃保存；
G、标准品的制备
11)、制作标准品贮存液：将对硝基酚加入去离子水溶液中，制得硝基酚浓度为0.02～0.2毫摩尔/升的去离子水溶液，
12)、制作标准品1：碳酸钠浓度0.05～0.5摩尔/升的去离子水溶液；
13)、将不同量的标准品贮存液加入标准品1中即可制得含对硝基酚浓度不超过8×10-3毫摩尔/升、碳酸钠浓度0.05～0.5摩尔/升的其它标准品去离子水溶液。

说明书精浆中性α-葡糖苷酶定量检测试剂、试剂盒及制备方法
技术领域
本发明属于生物化学酶试剂盒检测领域，具体适合于精浆中性α-葡糖苷酶定量检测。
背景技术
在男性不育临床与理论研究中，如何评价附睾的分泌功能是一项非常重要和艰巨的工作。早期的附睾分泌功能研究指标有左旋肉毒碱和甘油磷酸胆碱，继而又将α-葡糖苷酶纳入评价指标内。最新的研究成果表明，精浆中性α-葡糖苷酶是目前已知的最优秀的附睾分泌功能评价指标，其特异性优于左旋肉毒碱、甘油磷酸胆碱和α-葡糖苷酶。可用于无精子症、输精道梗阻、附睾功能受损等临床诊断与愈后监测。
中性α-葡糖苷酶定量检测方法学，最初由Cooper等人报道，其最大的技术特点是用抑制剂抑制了酸性α-葡糖苷酶的干扰，使检测结果更具临床意义。但由于检测方法学本身的原因，检测时间较长，初期方法学的检测时间长达4小时。近来为了缩短反应时间，在原方法学原理基础上加大标本反应量，使检测时间缩短至2小时。
中性α-葡糖苷酶定量检测是男子不育病因诊断和输精管结扎术评价工作中最为常用的检测指标之一，较长的检测时间不利于该项目广泛开展。因此进一步改进方法学显得特别重要。
另外，由于检测操作过程本身受到人为因素以及仪器设备的影响，不能监察操作过程的准确性.。
发明内容
本发明的目的在于克服上述现有技术的不足，提出一种能大大缩短检测时间的精浆中性α-葡糖苷酶定量检测试剂、试剂盒及制备方法。
进一步地，本发明的另一目的在于提出一种能监察操作过程准确性的精浆中性α-葡糖苷酶定量检测试剂、试剂盒。
实现上述目的地技术方案：
一种精浆中性α-葡糖苷酶定量检测试剂，包括酸性抑制剂、糖苷酶抑制剂、终止液和标准品，还包括糖苷类底物，用以提高反应速度。其中：
(1)酸性抑制剂：含十二烷基硫酸钠含量为5～15％的去离子水溶液；
(2)糖苷酶抑制剂：含罂粟精素含量为0.005～0.05％的磷酸钾缓冲液；
(3)底物：含4-甲基伞形酮-a-D葡萄糖苷0.5～5.0毫摩尔/升，D-果糖糖苷酶100～500U/升，防腐剂0.05～0.5％的磷酸钾缓冲液；
(4)终止液：含碳酸钠浓度为0.05～0.5摩尔/升的去离子水溶液；
(5)标准品：含对硝基酚(PNP)浓度不超过8×10-3毫摩尔/升、碳酸钠浓度0.05～0.5摩尔/升的去离子水溶液。
所述底物是冻干粉，还包括底物溶解液，底物溶解液是含蔗糖0.5～5％、氯化钠10～100毫摩尔/升、水解蛋白0.05～0.5％的蒸馏水溶液。
所述糖苷酶抑制剂是冻干粉、防腐剂优选叠氮钠、水解蛋白优选酪蛋白。
一种精浆中性α-葡糖苷酶定量检测试剂，包括酸性抑制剂、糖苷酶抑制剂、底物、终止液和标准品，还包括糖苷酶类质控液，用以根据对质控液的浓度测定值检测说明操作过程的可信度。其中：
(1)酸性抑制剂：含十二烷基硫酸钠含量为5～15％的去离子水溶液；
(2)糖苷酶抑制剂：含罂粟精素含量为0.005～0.05％的磷酸钾缓冲液；
(3)质控液：含α-葡糖苷酶0.002～0.05％、铵离子含量为0.05～0.5摩尔/升、低分子量氨基酸含量为0.1～1.0摩尔/升的pH4.5～7.5的缓冲液；
(4)底物：含4-甲基伞形酮-a-D葡萄糖苷0.5～5.0毫摩尔/升，D-果糖糖苷酶100～500U/升，防腐剂0.05～0.5％的磷酸钾缓冲液；
(5)底物溶解液：含蔗糖0.5～5％、氯化钠10～100毫摩尔/升、水解蛋白0.05～0.5％的蒸馏水溶液；
(6)终止液：含碳酸钠浓度为0.05～0.5摩尔/升的去离子水溶液；
(7)标准品：含对硝基酚(PNP)浓度不超过8×10-3毫摩尔/升、碳酸钠浓度0.05～0.5摩尔/升的去离子水溶液。
一种精浆中性α-葡糖苷酶定量检测试剂制作的试剂盒：酸性抑制剂5～15ul，糖苷酶抑制剂2.5×10-4～2.5×10-3mg，底物：4-甲基伞形酮-a-D葡萄糖苷0.5×10-4～5.0×10-4毫摩尔，D-果糖糖苷酶0.01～0.05U，底物溶解液50～150ul，终止液500～1500ul，一个或多个不同浓度的去离子水溶液标准品，每一个标准品用量是在酶标仪上吸光度不超过3.0的用量。
一种精浆中性α-葡糖苷酶定量检测试剂制作的试剂盒：酸性抑制剂10ul，糖苷酶抑制剂9×10-4mg，4-甲基伞形酮-a-D葡萄糖苷1.85×10-4毫摩尔、D-果糖糖苷酶0.03U，底物溶解液100ul，终止液1000ul，至少一个标准品，每个标准品250ul。所述标准品是按如下方法制得的标准品5和一个以上的其它标准品：
1)制作标准品贮存液：含对硝基酚浓度为0.02～0.2毫摩尔/升的去离子水溶液；
2)标准品1：碳酸钠浓度不超过0.5摩尔/升的去离子水溶液；
3)标准品2：取5毫升标准贮存液，用碳酸钠浓度不超过0.5摩尔/升的去离子水溶液定容至1000毫升；
4)标准品3：取10毫升标准贮存液，用碳酸钠浓度不超过0.5摩尔/升的去离子水溶液定容至1000毫升；
5)标准品4：取20毫升标准贮存液，用碳酸钠浓度不超过0.5摩尔/升的去离子水溶液定容至1000毫升；
6)标准品5：取40毫升标准贮存液，用碳酸钠浓度不超过0.5摩尔/升的去离子水溶液定容至1000毫升。
一种精浆中性α-葡糖苷酶定量检测试剂制作的试剂盒：酸性抑制剂5～15ul，糖苷酶抑制剂2.5×10-4～2.5×10-3mg，质控液2～8ul，底物：含4-甲基伞形酮-a-D葡萄糖苷0.5×10-4～5.0×10-4毫摩尔，D-果糖糖苷酶0.01～0.05U，底物溶解液50～150ul，终止液500～1500ul，一个或多个不同浓度的标准品，每一个标准品用量是在酶标仪上吸光度不超过3.0的用量。
一种精浆中性α-葡糖苷酶定量检测试剂制作的试剂盒：酸性抑制剂10ul，糖苷酶抑制剂9×10-4mg，质控液5ul，4-甲基伞形酮-a-D葡萄糖苷1.85×10-4毫摩尔、D-果糖糖苷酶0.03U，底物溶解液100ul，终止液1000ul，至少一个标准品，每个标准品250ul。所述标准品是按如下方法制得的标准品5和一个以上的其它标准品：
1)制作标准品贮存液：含对硝基酚浓度为0.02～0.2毫摩尔/升的去离子水溶液；
2)标准品1：碳酸钠浓度不超过0.5摩尔/升的去离子水溶液；
3)标准品2：取5毫升标准贮存液，用碳酸钠浓度不超过0.5摩尔/升的去离子水溶液定容至1000毫升；
4)标准品3：取10毫升标准贮存液，用碳酸钠浓度不超过0.5摩尔/升的去离子水溶液定容至1000毫升；
5)标准品4：取20毫升标准贮存液，用碳酸钠浓度不超过0.5摩尔/升的去离子水溶液定容至1000毫升；
6)标准品5：取40毫升标准贮存液，用碳酸钠浓度不超过0.5摩尔/升的去离子水溶液定容至1000毫升。
精浆中性α-葡糖苷酶定量检测试剂的制备方法，包括：
A、酸性抑制剂的制备
1)、将称量的十二烷基硫酸钠加入少量去离子水，温浴振荡溶解，
2)、再加入去离子水定容并室温保存；
B、糖苷酶抑制剂的制备
3)、将称量的罂粟精素溶于磷酸钾缓冲液中，
4)、分装冻干，置2-8℃保存；
C、底物的制备
5)、取4-甲基伞形酮-a-D葡萄糖苷、D-果糖糖苷酶、防腐剂溶于磷酸钾缓冲液中，
6)、分装冻干，2-8℃保存；
D、终止液的制备
7)、取称量的碳酸钠溶于去离子水内，置2-8℃保存；
E、质控液的制备
8)、将称量的α-葡糖苷酶溶于醋酸盐缓冲液中，
9)、加入有效量的氯化铵或硫酸铵等含铵离子的物质和低分子量氨基酸振荡溶后过滤，置2-8℃保存；
F、底物溶解液的制备
10)、将称量的蔗糖、氯化钠、水解蛋白溶于蒸馏水中，置2-8℃保存；
G、标准品的制备
11)、制作标准品贮存液：将对硝基酚加入去离子水溶液中，制得硝基酚浓度为0.02～0.2毫摩尔/升的去离子水溶液，
12)、制作标准品1：碳酸钠浓度0.05～0.5摩尔/升的去离子水溶液；
13)、将不同量的标准品贮存液加入标准品1中即可制得含对硝基酚浓度不超过8×10-3毫摩尔/升、碳酸钠浓度0.05～0.5摩尔/升的其它标准品去离子水溶液。
采用上述技术方案，结合下面将要详述的实施例，本发明突出的技术效果在于：1、通过配置底物，反应速度快，反应时间仅需25分钟。而原有检测试剂的检测时间长达4小时，即使加大标本反应量，检测时间也要2小时，检测速度大大提高。2、通过配置质控液，解决了标准品与样本不是同步反应的问题，如果质控液测定值处于试剂盒给定范围内，则说明操作可信度高。通过质控液监察操作过程的准确性。3、本发明试剂使用中性能稳定，贮存期长，4-8℃保存可稳定一年以上，完全适合于作为试剂盒使用。4、采用本发明不需要增加新的设备，和原方法学一样，采用标准曲线检测结果可自动从酶标仪输出。5、由于检测速度快，可定量检测精浆中性α-葡糖苷酶活性，对于无精子症、输精道梗阻、附睾功能受损等临床诊断与愈后监测有重要的指导意义。
具体实施方式
实施例一、一种精浆中性α-葡糖苷酶定量检测试剂，由下列成份组成：(1)酸性抑制剂：十二烷基硫酸钠含量为5～15g的去离子水溶液100毫升；(2)糖苷酶抑制剂：罂粟精素含量为5～50mg的磷酸钾缓冲液100毫升；(3)糖苷酶类质控液优选：含α-葡糖苷酶20～500mg、硫酸铵0.05～0.5摩尔/升、甘氨酸含量0.1～1.0摩尔的醋酸盐缓冲液1000毫升；(4)糖苷类底物优选：4-甲基伞形酮-a-D葡萄糖苷0.5～5.0毫摩尔、D-果糖糖苷酶100～500U、叠氮钠0.5～5g溶于1000毫升磷酸钾缓冲液中；(5)底物溶解液：蔗糖5～50克，氯化钠10～100毫摩尔，酪蛋白0.5～5克，溶于1000毫升的蒸馏水溶液；(6)终止液：碳酸钠0.05～0.5摩尔/升的去离子水溶液；(7)标准品：一个或多个含对硝基酚(PNP)浓度不超过8×10-3毫摩尔/升、碳酸钠浓度0.05～0.5摩尔/升的不同浓度的去离子水溶液标准品，每一个标准品用量是在酶标仪上比色时吸光度不超过3.0的用量。
糖苷酶抑制剂可以是溶液与可以是冻干粉，硫酸铵也可以用氯化铵或其它含铵离子的物质代替，叠氮钠也可用其它防腐剂代替，酪蛋白也可以是其它水解蛋白，甘氨酸也可用其它低分子量氨基酸代替。
实施例二、一种根据实施例一精浆中性α-葡糖苷酶定量检测试剂制作的试剂盒，其中：酸性抑制剂5～15ul，糖苷酶抑制剂2.5×10-4～2.5×10-3mg，质控液2～8ul，底物：4-甲基伞形酮-a-D葡萄糖苷0.5×10-4～5.0×10-4毫摩尔，D-果糖糖苷酶0.01～0.05U，底物溶解液50～150ul，终止液500～1500ul，一个或多个不同浓度的去离子水溶液标准品，每一个标准品用量是在酶标仪上吸光度不超过3.0的用量。
上述试剂盒优选的方案是：酸性抑制剂10ul，糖苷酶抑制剂9×10-4mg，4-甲基伞形酮-a-D葡萄糖苷1.85×10-4毫摩尔、D-果糖糖苷酶0.03U，底物溶解液100ul，终止液1000ul，标准品是按如下方法制得的标准品5和一个以上的其它标准品，每个标准品250ul：
1)制作标准品贮存液：含对硝基酚浓度为0.02～0.2毫摩尔/升的去离子水溶液；
2)标准品1：碳酸钠浓度不超过0.5摩尔/升的去离子水溶液；
3)标准品2：取5毫升标准贮存液，用碳酸钠浓度不超过0.5摩尔/升的去离子水溶液定容至1000毫升；
4)标准品3：取10毫升标准贮存液，用碳酸钠浓度不超过0.5摩尔/升的去离子水溶液定容至1000毫升；
5)标准品4：取20毫升标准贮存液，用碳酸钠浓度不超过0.5摩尔/升的去离子水溶液定容至1000毫升；
6)标准品5：取40毫升标准贮存液，用碳酸钠浓度不超过0.5摩尔/升的去离子水溶液定容至1000毫升。
实施例三、一种精浆中性α-葡糖苷酶定量检测试剂的制备方法，包括如下步骤：
A、酸性抑制剂的制备
1)、称取十二烷基硫酸钠5～15克置于烧杯内，加入80毫升去离子水，37℃温浴振荡溶解，
2)、移入100毫升装容量瓶内，用去离子水定容至100毫升，室温保存；
B、糖苷酶抑制剂的制备
3)、将5～50mg罂粟精素溶于100ml 0.2mmol/L磷酸钾缓冲液中，
4)、分装冻干，置4-8℃保存；
C、底物的制备
5)、称取0.5～5.0mmol4-甲基伞形酮-a-D葡萄糖苷，100～500U D-果糖糖苷酶，叠氮钠0.5～5g，溶于1000ml的pH6.5，0.2mol/L磷酸钾缓冲液中，
6)、分装冻干，4-8℃保存；
D、终止液的制备
7)、称取0.05～0.5mmol碳酸钠，溶于1000ml去离子水内，置4-8℃保存；
E、标准品贮存液的制备
8)、将0.02～0.2毫摩尔对硝基酚(PNP)置于烧杯内，加入800毫升0.1mol/lNa2CO3中，37℃温浴振荡溶解，
9)、溶解后用0.1mol/l Na2CO3定容至1000毫升，4-8℃保存；
F、质控液的制备
10)、称取20～500mg α-葡糖苷酶溶于1000ml pH6.0，0.1mol/L醋酸盐缓冲液中，
11)、加入0.05～0.5摩尔硫酸铵、0.1～1.0摩尔甘氨酸振荡溶后过滤，置4-8℃保存；
L、底物溶解液的制备
12)、称取蔗糖5～50克，氯化钠10～100毫摩尔，酪蛋白0.5～5克，溶于800毫升蒸馏水中，
13)、移入1000毫升装容量瓶内，用蒸馏水定容至1000毫升，置4-8℃保存。
实施例四、一种精浆中性α-葡糖苷酶定量检测试剂的制备方法，包括如下步骤：
A、酸性抑制剂的制备
1)、称取十二烷基硫酸钠10.0克置于烧杯内，加入80毫升去离子水，37℃温浴振荡溶解，
2)、移入100毫升装容量瓶内，用去离子水定容至100毫升，室温保存；
B、糖苷酶抑制剂的制备
3)、将18mg罂粟精素溶于100ml 0.2mmol/L磷酸钾缓冲液中，
4)、分装冻干。置4-8℃保存；
C、底物的制备
5)、称取1.85mmol4-甲基伞形酮-a-D葡萄糖苷，300U D-果糖糖苷酶，叠氮钠1g，溶于1000ml的pH6.5，0.2mol/L磷酸钾缓冲液中，
6)、分装冻干，4-8℃保存；
D、终止液的制备
7)、称取0.1mmol碳酸钠，溶于1000ml去离子水内，置4-8℃保存；
E、标准品贮存液的制备
8)、将0.1毫摩尔对硝基酚(PNP)置于烧杯内，加入800毫升0.1mol/l Na2CO3中，37℃温浴振荡溶解，
9)、移入1000毫升装容量瓶内，用0.1mol/l Na2CO3定容至1000毫升，4-8℃保存；
F、标准品的制备
10)标准品1：称取约0.1mmol碳酸钠，溶于1000ml去离子水内，置4-8℃保存；
11)标准品2：取5毫升标准贮存液，用0.1mol/l Na2CO3定容至1000毫升，置4-8℃保存；
12)标准品3：取10毫升标准贮存液，用0.1mol/l Na2CO3定容至1000毫升，置4-8℃保存；
13)标准品4：取20毫升标准贮存液，用0.1mol/l Na2CO3定容至1000毫升，置4-8℃保存；
14)标准品5：取40毫升标准贮存液，用0.1mol/l Na2CO3定容至1000毫升，置4-8℃保存；
G、质控液的制备
15)、称取100mg α-葡糖苷酶溶于1000ml pH6.0，0.1mol/L醋酸盐缓冲液中，
16)、加入0.16摩尔硫酸铵、0.5摩尔甘氨酸振荡溶后过滤，置4-8℃保存；
H、底物溶解液的制备
17)、称取蔗糖10克，氯化钠30毫摩尔，酪蛋白2克，溶于800毫升蒸馏水中，
18)、移入1000毫升装容量瓶内，用蒸馏水定容至1000毫升，置4-8℃保存。
实施例五、用上述各实施例试剂检测精浆中性α-葡糖苷酶活性，具体步骤为：
一、试剂准备
1、糖苷酶抑制剂冻干粉以120μl蒸馏水溶解
2、底物冻干粉以2.1ml底物溶解液溶解
二、样本准备
记录受检者一次射精的精液总量(ml)。精液液化后以3000g离心10分钟，保留精浆。
三、操作方法
每个待检标本需同时设测定管和对照管，标准对照管仅在比色时使用，具体方法见下表：
                 质控测定管    质控对照管   标本测定管   标本对照管
酸性抑制剂(ul)      ---           ---           10          10
蒸馏水(ul)          10            10            ---         ---
质控液(ul)          5             5             ---         ---
样本(ul)            ---           ---           5           5
糖苷酶抑制剂(ul)       ---            5        ---        5
                       37℃预温5min，底物同时预温5mm。
底物(ul)               100            100      100        100
                       37℃准确反应25min。
终止液(ul)             1000           1000     1000       1000
每管各取250ul，标准品250ul，在酶标仪上用波长405nm的滤光片比色。
四、比色与计算
标准管浓度对应的标本浓度值(umol/L)＝标准管实际浓度×8.92。
各标准管计算结果如下：
标准管实际浓度(umol/l)    输入酶标仪程序时标准管浓度(U/L)
         0                             0
         0.5                           4.46
         1                             8.92
         2                             17.84
         4                             35.68
各检测孔在酶标仪微孔板上的位置排列方式如下：

S代表标准孔，Q代表质控孔，R代表标本测定孔，B代表对照孔。标准对照孔(A02、B02、C02、D02和E02孔)不加任何试剂，却必须摆放空白微孔板作为标准管空白。每孔加样250ul。
标准品依次加入S1～S5孔，质控测定管加入Q孔，质控对照管加入QB孔，各标本测定管分别加入R管，各标本对照管则分别对应加入RB管。
以Bio-Tek ELx800酶标仪为例，程序设置主要参数如下：
MAPPING DIRECTION：DOWN；
BLANK MAP：P-DOWN；
ENTER NUMBER OF STANDARDS：05
ENTER NUMBER OF STANDARD REPLICATES：01
CONCN.OF STD1：0
CONCN.OF STD2：4.46
CONCN.OF STD3：8.92
CONCN.OF STD4：17.84
CONCN.OF STD5：35.68
按“平滑曲线”方式拟合标准曲线
酶标仪打印输出结果，即为检测标本真实浓度(U/L)。
五.结果评价
如果该质控液本次的测定值处于试剂盒给定的该质控液预先检测的标定值范围内，则说明操作过程可信度高，结果准确。
本发明通过引入质控液并与样本同步反应，达到了监察操作过程是否准确的目的。
六、结果报告
标本最终检测结果以“精浆中性α-葡糖苷酶总活性”方式报告，即
总活性＝标本浓度(U/L)×一次射精的精液体积(ml)＝mU/一次射精
七、临床适用性
一、作为附睾特异性的分泌指标，可代替精浆左旋肉毒碱、甘油磷酸胆碱和α-葡糖苷酶等项目的检测。
二、结合激素和睾丸其他指标，可鉴别诊断生精功能障碍所致无精症与梗阻性无精症。
三、结合精浆果糖的检测，可判断梗阻性无精症的梗阻部位。