用于全血mRNA的高通量定量的装置和方法 发明背景
【发明领域】
本发明涉及全血mRNA的高通量分离和定量。更具体的说，本发明涉及使用附着于固定了寡聚物(dT)的多孔板的白细胞滤器的联合体来分离和扩增mRNA的方法和装置。
相关领域的描述
分子生物学领域的研究已经揭示了可以根据对细胞核糖核酸(RNA)的研究来推导细胞的遗传起源和功能活性。该信息可用于临床实践，用于诊断感染、用于检测表达癌基因的细胞的存在、用于检测家族性疾病、用于监测宿主防御机制的状态、以及用于测定HLA分型或其它鉴定指标。RNA存在三种不同的功能形式：核糖体RNA(rRNA)、转运RNA(tRNA)、和信使RNA(mRNA)。尽管稳定的rRNA和tRNA涉及翻译中的催化过程，然而mRNA分子携带遗传信息。总RNA中只有大约1-5％是mRNA，大约15％是tRNA，而大约80％是rRNA。
mRNA是重要的诊断工具，特别是在用于定量观测基因的上调和下调时。人外周血是mRNA分析的极好临床来源。例如，血液中特定嵌合mRNA的检测指示异常细胞的存在，并且用于慢性髓细胞性白血病(CML)的分子诊断(Kawasaki E.S.、Clark S.S.、Coyne M.Y.、Smith S.D.、ChamplinR.、Witte O.N.、和McCormick F.P.，1988，Diagnosis of chronic myeloidand acute lymphocytic leukemias by detection of leukemia-specificmRNA sequences amplified in vitro，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，85：5698-5702；Pachmann K.、Zhao S.、Schenk T.、Kantarjian H.、El-Naggar A.K.、Siciliano M.J.、Guo J.Q.、Arlinghaus R.B.、和AndreeffM.，2001，Expression of bcr-able mRNA individual chronic myelogenousleukaemia cells as determined by in situ amplification，Br.J.Haematol.，112：749-759)。还能够通过测量癌特异mRNA而在血液中检测到微转移癌细胞，诸如对结肠癌检测癌胚抗原(CEA)、对前列腺癌检测前列腺特异抗原(PSA)、对甲状腺癌检测甲状腺球蛋白(Wingo S.T.、RingelM.D.、Anderson J.S.、Patel A.D.、Lukes Y.D.、Djuh Y.Y.、Solomon B.、Nicholson D.、Balducci-Silano P.L.、Levine M.A.、Francis G.L.、和Tuttle R.M.，1999，Quantitative reverse transcription-PCRmeasurement of thyroglobulin mRNA in peripheral blood of healthysubjects，Clin.Chem.，45：785-89)、以及对黑素瘤检测酪氨酸酶(PelkeyT.J.、Frierson H.F.Jr.、和Bruns D.E.，1996，Molecular andimmunological detection of circulating tumor cells andmicrometastasis from solid tumors，Clin.Chem.，42：1369-1381)。此外，由于这些癌特异mRNA地水平能够随着治疗而变化，因此对特定mRNA的定量提供了治疗监测过程中的有用指标。
由于与白细胞(每微升大约5000个白细胞)相比血液中含有大量的无核红细胞(每微升大约5百万个红细胞)，因此常常由全血分离粒细胞或淋巴细胞作为mRNA分析的第一步。然而，由于在不同样品中回收白细胞特定子集的不一致性，因此需要对每份样品测定分离白细胞的数目，并将结果表述成每个白细胞的mRNA数量，而非每微升血液的mRNA数量。此外，mRNA数量可能在漫长的分离过程中发生变化。尽管没有办法由血液分离癌细胞，然而基因扩增技术能够鉴定并定量特定mRNA水平，甚至是来自不同基因集合的mRNA，使得在能够获得基因特异引物和探针时全血成为mRNA分析的理想材料。
由全血分离纯mRNA是非常困难的，因为全血中含有大量的RNA酶(来自粒细胞)和无核红细胞。尽管多种RNA提取方法可用于全血(de VriesT.J.、Fourkour A.、Punt C.J.、Ruiter D.J.、和van Muijen G.N.，2000，Analysis of melanoma cells in peripheral blood by reversetranscription-polymerase chain reaction for tyrosinase and MART-1after mononuclear cell collection with cell preparation tubes：acomparison with the whole blood guanidinium isothiocyanate RNAisolation method，Melanoma Research，10：119-126；Johansson M.、Pisa E.K.、Tormanen V.、Arstrand K.、和Kagedal Bl.，2000，Quantitativeanalysis of tyrosinase transcripts in blood，Clin.Chem.，46：921-927；Wingo S.T.、Ringel M.D.、Anderson J.S.、Patel A.D.、LukesY.D.、Djuh Y.Y.、Solomon B.、Nicholson D.、Balducci-Silano P.L.、Levine M.A.、Francis G.L.、和Tuttle R.M.，1999，Quantitative reversetranscription-PCR measurement of thyroglobulin mRNA in peripheralblood of healthy subjects，Clin.Chem.，45：785-89)，然而测定流程劳动密集，需要数轮离心，而且涉及对消除核酸酶活性至关重要的小心操作。
因此，需要快速且简单的方法和装置，用于对来自全血的大量mRNA进行分离和定量。具体而言，需要高通量的全血衍生mRNA处理技术，以及对基因扩增的可重复回收和无缝处理(seamless process)。
发明概述
本发明公开了高效的高通量方法和装置，用于直接由全血对mRNA进行分离和定量，而且回收是可重复的，其中使用附着于固定了寡聚物(dT)的多孔板的白细胞滤器的联合体。
本发明的一个方面包括用于对全血mRNA进行高通量定量的方法，包括下列步骤：(a)采集全血；(b)通过过滤由全血除去红细胞和血液成分而在滤膜上保留白细胞；(c)将白细胞进行细胞裂解而生成包含mRNA的裂解物；(d)将裂解物转移到固定了寡聚物(dT)的板上以捕捉mRNA；和(e)对mRNA进行定量。
在该方法的一个优选实施方案中，在采集白细胞之前将抗凝剂施用于全血。可以将数层滤膜叠在一起以提高白细胞捕获量。为了由白细胞释放mRNA，使用裂解缓冲液裂解滤膜上捕获的白细胞。可以通过离心、真空抽吸、正压、或用乙醇清洗随后真空抽吸而将裂解物转移到固定了寡聚物(dT)的板上。通过生成cDNA及PCR扩增cDNA而对mRNA进行定量。
本发明的另一个方面包括用于对全血mRNA进行高通量定量的装置，其中所属装置包括：(a)多孔板，包括：多个加样孔；所述孔下面的白细胞捕捉滤器；和所述滤器下面的mRNA捕捉区，它包含固定的寡聚物(dT)；和(b)真空箱，适于接受滤板而在板与箱之间形成密封。在该装置的一个优选实施方案中，白细胞是在叠在一起的多层滤膜上捕获的。在该装置的另一个优选实施方案中，真空箱适于接受真空源。在该装置的另一个优选实施方案中，将多孔支持物插入真空箱与多孔板之间。
本发明的另一个方面包括试剂盒，其包括：用于对全血mRNA进行高通量定量的装置、肝素、低渗缓冲液、和裂解缓冲液。
本发明的另一个方面包括用于对全血mRNA进行高通量定量的完全自动化系统，其包括：用于将血样、低渗缓冲液、和裂解缓冲液施加到装置中的机械；自动化真空抽吸器和离心机、以及自动化PCR仪。
附图简述
图1是高通量mRNA装置的部件分解图。
图2描绘了高通量mRNA装置的多孔板，其包括白细胞滤器和固定了寡聚物(dT)的滤孔。
图3的图显示了滤板对新鲜和冷冻血样的白细胞捕捉效率。
图4的图显示了清洗血样次数对mRNA定量的影响。
图5的图显示了在细胞裂解之前对滤板的最终处理对mRNA定量的影响。
图6的图显示了裂解缓冲液如何抑制RNA酶。
图7的图显示了用于mRNA定量的逆转录酶最佳浓度。
图8的图显示了为了捕捉mRNA用于PCR的cDNA最佳值。
图9的图显示了本发明的杂交动力学。
图10的图显示了每孔所用全血体积与mRNA定量之间的线性关联。
优选实施方案的详述
本发明能够分析较大体积的未做任何准备的全血，提供了分析专门由白细胞生成的mRNA的有效方法，消除rRNA和tRNA，提供了一致的mRNA回收，而且易于适应自动化。本发明提供了灵敏的定量系统，其包括：使用实时PCR的绝对定量，且可重复性极好，变化系数的范围为20-25％。
此外，本发明适用于多种疾病对象(表1)。
表1：临床对象 刺激 疾病 候选基因 (-) 白血病 易位基因 癌症(诊断、监测、筛选) 来自微转移癌细胞的癌特异基因 HIV/CMV(诊断、监测、血库) 来自受感染WBC的病毒衍生mRNA 体内 灵敏度 抗白血病药物 凋亡 免疫抑制剂 细胞因子 抗癌药物对WBC的副作用 持家基因 体外 灵敏度 抗病毒药物灵敏度 来自受感染WBC的病毒衍生mRNA 辐射灵敏度 DNA修复基因 变应原刺激 变态反应基因 移植排斥 由供体细胞介导的细胞因子
本发明不限于任何具体的机械构造。然而，图1和2显示了执行本发明的高通量mRNA定量方法的优选结构。真空箱10构成该结构的基础。真空箱可以由强度足以承受真空抽吸的任何材料制成；但是，优选一次性使用的塑料。真空箱适于接受真空源以进行真空抽吸12。滤栓(filter plug)14置于真空箱的真空抽吸适配器(adapter)中。真空箱10优选具有凸缘16以配合多孔滤板40，或者任选的多孔支持物20。任选在真空箱上部提供多孔支持物20以支持多孔滤板40。优选由基于硅的橡胶或其它软塑料制成的密封衬垫30置于多孔支持物上。密封衬垫的上面是多孔滤板40，它包括多个加样孔46、加样孔下面的多个白细胞捕捉滤器42、和滤器下面的mRNA捕捉区44。固定的寡聚物(dT)包含于mRNA捕捉区的孔内。
一个优选实施方案涉及对全血mRNA的简单、可重复、和高通量的定量方法。快速方案将采血后mRNA的二次诱导或降解降至最低，而且96孔滤板和显微滴定板的使用能够同时操作96份样品。流程中的最少操作提供了最小的样品间差异，变化系数(CV)小于30％，甚至在使用PCR作为定量手段时。
在一个实施方案中，该方法涉及真空箱的制备。在一个优选实施方案中，向真空箱中加入血液封装物诸如聚丙烯酸聚合物基质(Red Z，Safetec)使血液凝固。然后将多孔支持物置于真空箱中。然后将由基于硅的橡胶或其它软塑料制成的密封衬垫置于多孔板支持物上。将滤栓(X-6953，60μFilter Plug HDPE，Porex Products Groups)置于真空箱的真空抽吸器适配器中。
在这个实施方案中，该方法涉及滤板的制备。可以使用玻璃纤维膜或白细胞滤膜来捕捉白细胞。为了简化测定法，使用玻璃纤维膜或白细胞滤膜制成多孔滤板，从而能够同时处理多份血样。用于捕捉白细胞的滤器的实例公开于美国专利号4,925,572和4,880,548中，将其公开书收入本文作为参考。白细胞对滤器表面的吸附通常认为是白细胞排除的机制。因为指定重量的纤维的表面积与纤维的直径成反比，所以预计较细的纤维将具有较大的容量，而且，如果所用纤维的直径较小，那么实现期望功效所需要的纤维的数量(以重量计)将较少。包括聚酯类、聚酰胺类、和丙烯酸树脂在内的许多常用纤维能够进行辐射接枝，因为在接枝所需要的水平它们对射线的降解具有适当抵抗力，而且在它们的结构中有单体能够进行反应。PBT已经成为本发明产品开发中所使用的主要树脂，而且也是实施例中所使用的树脂。然而，应当注意，可以找到能够纤维化且聚集成纤维垫或纤维网的其它树脂，它们的纤维细至1.5微米或更细，而且在必要时将它们的临界润湿表面张力调至最佳范围后，这些产品可能非常适合于构造效率相同但仍有较少白细胞损耗的装置。类似的，经过适当处理的玻璃纤维可能可用于制造有效装置。使用基于PBT的滤器时CD4 mRNA的吸附效率可高达基于玻璃纤维的滤器的4倍。将滤板置于真空箱中。在另一个优选实施方案中，将多层滤膜叠在一起以提高全血的白细胞捕获量。在一个优选实施方案中，将滤板置于板支持物和密封衬垫上。在另一个优选实施方案中，将滤板用塑料胶带(Bio-Rad 223-9444)密封，切割胶带以允许对期望数目的孔进行操作。在另一个优选实施方案中，用低渗缓冲液(200μl，5mM Tris pH7.4)清洗将要加入样品的每个孔。
该方法优选涉及采集血液，将血液加到多孔滤板中，并除去红细胞和其它非白细胞成分。在一个优选实施方案中，可以将全血吸入含抗凝剂的血液采集管中，它提高了白细胞过滤效率。抗凝剂肝素在提高白细胞过滤效率方面特别有效。在一个优选实施方案中，可以将血样冷冻，这消除了破坏mRNA的一些RNA酶。可以用低渗缓冲液清洗孔。一旦将血液加到期望数目的滤板孔中，将血液穿过滤膜过滤。可以通过本领域技术人员知道的任何技术来进行过滤，诸如离心、真空抽吸、或正压。
在一个特别优选的实施方案中，在将血样加到滤板孔中之后进行真空抽吸(6cmHg)。将每个孔用低渗缓冲液清洗数次(12次，200μl/次，5mMTris pH7.4)。在另一个优选实施方案中，用乙醇清洗装有样品的每个孔(1次，200μl/次，100％乙醇)，这使滤膜干燥并显著提高真空抽吸过程中的白细胞捕捉效率。在另一个优选实施方案中，然后施加真空(20cmHg，大于2分钟)。
该方法涉及细胞裂解和mRNA与mRNA捕捉区中固定的寡聚物(dT)的杂交。为了由捕获的白细胞释放mRNA，将裂解缓冲液加到滤板孔中(40μl/孔)，并进行保温(室温，20分钟)。在一个优选实施方案中，将多孔滤板在塑料袋中密封并离心(IEC MultiRF，2000rpm，4℃，1分钟)。然后再次加入裂解缓冲液(20μl/孔)，随后离心(IEC MultiRF，3000rpm，4℃，5分钟)。然后由离心机中取出多孔滤板，并保温(室温，2小时)。
该方法涉及对mRNA的定量，在一个优选实施方案中，需要由mRNA合成cDNA并通过PCR扩增cDNA。在一个优选实施方案中，用裂解缓冲液(150μl/孔，3次，手工)和清洗缓冲液(150μl/孔，3次，手工或BioTek#G4)清洗多孔滤板。然后向多孔滤板中加入cDNA合成缓冲液(40μl/孔，手工或I&J #6)。可以将Axymat(Amgen AM-96-PCR-RD)置于多孔滤板上，然后将它们置于加热块(37℃，VWR)上并保温(大于90分钟)。然后可以将多孔滤板离心(2000rpm，4℃，1分钟)。将PCR引物加到384孔PCR板中，并将cDNA由多孔滤板转移到384孔PCR板中。将PCR板离心(2000rpm，4℃，1分钟)，并开始实时PCR(TaqMan/SYBER)。
本发明的另一个优选实施方案涉及用于对全血mRNA进行高通量定量的装置。该装置包括多孔滤板，其包括：多个加样孔、加样孔下面的白细胞捕捉滤器、和滤器下面的mRNA捕捉区，它在mRNA捕捉区的孔中包含固定的寡聚物(dT)。为了提高收集白细胞的效率，可以将数层滤膜叠在一起。将多孔板安置于真空箱上，后者适于接受板并在多孔板与真空箱之间形成密封。在装置的一个优选实施方案中，真空箱适于接受真空源以进行真空抽吸。在另一个优选实施方案中，将多孔支持物置于真空箱中，位于多孔滤板的下面。在装置的另一个优选实施方案中，将可以由诸如基于硅的橡胶等软塑料制成的密封衬垫插入多孔支持物与多孔滤板之间。
另一个优选实施方案涉及用于对全血mRNA进行高通量定量的试剂盒。该试剂盒包括：用于对全血mRNA进行高通量定量的装置；含肝素的血液采集管；低渗缓冲液；和裂解缓冲液。
另一个优选实施方案涉及用于对全血mRNA进行高通量定量的完全自动化系统，其包括：用于将血样、低渗缓冲液、和裂解缓冲液施加到装置中的机械；自动化真空抽吸器和离心机、以及自动化PCR仪。
实施例
测试了本发明方法的多个方案，并用于对全血β-肌动蛋白mRNA和CD4mRNA的定量。
测试了三种抗凝剂：ACD、EDTA、和肝素，其中肝素导致最高百分比的白细胞保持。尽管Leukosorb膜已经在输血中用于ACD血液，然而甚至在同时使用四层膜时，仍有大约15-40％的白细胞穿膜。测试了EDTA血液；发现容量和白细胞保持与ACD相似。然而，最值得注意的是，肝素血液中100％的白细胞被捕获在Leukosorb膜上。100％的由肝素血液捕获白细胞显示了本发明mRNA定量的可靠性。这些数据指示肝素血液的使用最适于mRNA的精确定量，而ACD血液可用于需要较大体积血液和较少定量结果的应用。
比较了使用冷冻与新鲜血样得到的结果。如图3所示，由新鲜血液渗漏细胞回收的CD4 mRNA多于冷冻样品的渗漏细胞。
与基于PBT的滤膜的保持值相比，还检查了玻璃纤维滤器的全血保持效率。如表2所示，玻璃纤维膜只接受40μl全血，甚至在用低渗缓冲液(50mM Tris pH7.4)清洗滤膜以胀裂红细胞时。然而，如表2所示，Leukosorb滤器接受的全血量显著多于玻璃纤维滤器。
表2：由全血扩增β-肌动蛋白mRNA膜抗凝剂*1 最大血 液体积 μl/孔 WBC保持 (％) 受试者 (n) 测试血 液体积 μl/孔x10-5ng(CV*5，％)CT*3(CV*4，％)玻璃纤维A、E、H 40 100 #1(9) #2(9) 20(A)*2 20(A)4.84±2.80(57.9)4.02±2.52(62.7)38.0±0.876(2.31)38.4±0.994(2.59)LeukotrapA、E 3000 60-85 #1(9) #2(9) 1000(A) 1000(A)169±112(66.0)100±72.1(72.0)33.1±1.24(3.75)30.6±1.42(4.64)H 200 100 #1(9) 100(H)18.7±4.03(21.6)39.2±0.414(1.01) #2(9) 100(H)15.7±3.67(23.4)37.8±0.432(1.06) #3(9) 100(H)15.8±3.91(24.7)37.7±0.379(1.01) #4(9) 100(H)15.3±4.39(28.7)37.7±0.429(1.14) #5(9) 100(H)13.5±3.31(24.5)37.9±0.455(1.20) #6(9) 100(H)20.1±4.79(23.8)37.3±0.365(0.98)
A：ACD；E：EDTA；H：肝素
(A、H)表示实验中所使用的抗凝剂
CT：极限循环(threshold cycle)
CV：变化系数
进行了不同次数的低渗缓冲液清洗以除去红细胞和其它血液成分。如图4所示，用低渗缓冲液清洗样品至少3次后捕获的CD4 mRNA量多于不进行清洗的两倍。图4还显示了用低渗缓冲液清洗血液12次导致捕获的mRNA最多。另外，在最终CD4 mRNA定量方面比较了通过对血液抽真空、离心、和乙醇清洗及随后抽真空来收集白细胞的多种方法。图5显示了尽管真空抽吸的CD4 mRNA定量优于离心，然而在真空抽吸之前用乙醇清洗血样生成的mRNA最多。
一旦在玻璃纤维或Leukosorb膜上捕获白细胞，进行不同次数的低渗缓冲液清洗以除去红细胞和其它血液成分。为了由捕获的白细胞释放mRNA，将裂解缓冲液(RNAture)加到滤板上(40μl/孔)，并将板于室温保温20分钟。在一个优选实施方案中，裂解缓冲液中包含扩增引物。图6显示了裂解缓冲液在抑制RNA酶中发挥重要作用；嗜曙红细胞充满RNA酶，它们被裂解缓冲液灭活。然后将多孔滤板在塑料袋中密封并离心(IECMultiRF，2000rpm，4℃，1分钟)。然后再次加入裂解缓冲液(20μl/孔)，随后离心(IEC MultiRF，3000rpm，4℃，5分钟)。然后由离心机中取出多孔滤板，并于室温保温2小时，使得多聚物(A)+RNA尾与固定的寡聚物(dT)杂交。然后用150μl裂解缓冲液清洗多孔滤板3次以消除残余的核糖核酸酶，随后用150μl清洗缓冲液(BioTek #G4)清洗3次以消除裂解缓冲液，后者包含cDNA合成的一些抑制剂。
最后一次清洗后，由多孔滤板完全清除清洗缓冲液，并向每个孔中加入40μl预先混合的cDNA缓冲液以合成cDNA。cDNA缓冲液的组成如下：5x第一条链缓冲液(Promega M531A，10mM dNTP(Promega储液，20x))、引物(5μM，#24)、RNA酶抑制剂(Promega N211A，40U/μl)、M-MLV逆转录酶(Promega M170A，200U/μl)、和DEPC水。图7显示了用于mRNA定量的MMLV最佳浓度是0.25单位/孔。
将Axymat(Amgen AM-96-PCR-RD)置于多孔滤板上，然后将它们置于加热块(37℃，VWR)上并保温(大于90分钟)。然后将多孔滤板离心(2000rpm，4℃，1分钟)。将PCR引物加到384孔PCR板中，并将cDNA由多孔滤板转移到384孔PCR板中。图8显示了用于PCR的cDNA最佳值是大约2μl/孔。将PCR板离心(2000rpm，4℃，1分钟)，并开始实时PCR(TaqMan/SYBER)。本发明的方法具有高mRNA特异性；TaqMan qPCR对CD4mRNA的扩增导致无法检测的DNA污染(小于10拷贝/孔)。
如图9所示，本发明导致mRNA定量的变化系数较低。两个小时的杂交导致变化系数小于13％，比较而言，mRNA定量的传统变化系数是大约300％。此外，如图10所示，线性结果显示mRNA捕获量与每孔所用全血体积成正比，使得本发明成为mRNA定量的可靠且可重复方法。