抗菌化合物B－11及其在制备抗菌药物上的应用.pdf

本发明公开了一种具有通式(I)的抗菌化合物B－11。该化合物在制备抗菌药物上的应用及含有该化合物的药物组合物。该化合物及其药理上容许的酯衍生物、醚衍生物、氨基甲酰基的N－烷基衍生物、其药理上容许的盐等，具有优良强大广谱的抗菌活性，对钩端螺旋体以及其它G－细菌，G+细菌有强大的杀灭作用，可用于治疗或预防感染症。

权利要求书
1.  具有下述通式(I)的抗菌化合物B-11：

其中，R1表示氢原子、甲基或钠离子；R2表示氢原子、羟基或甲基；R3表示对甲基苯基、叔丁基，或咪唑基；R4表示氢原子、甲基或羟基保护基。。

2.  根据权利要求1所述的抗菌化合物B-11，其特征在于，R4为甲基。

3.  根据权利要求1所述的抗菌化合物B-11，其特征在于，R3为对甲基苯基。

4.  根据权利要求1所述的抗菌化合物B-11，其特征在于，R3为对甲基苯基，R4为甲基。

5.  权利要求1-4任何一项所述抗菌化合物B-11在制备抗菌药物上的应用。

6.  含有权利要求1-4任何一项所述的抗菌化合物B-11的药物组合物。

说明书抗菌化合物B-11及其在制备抗菌药物上的应用
技术领域
本发明涉及一种化合物，尤其是一种抗菌化合物；本发明还涉及该抗菌化合物在在制备抗菌药物上的应用。
背景技术
在上个世纪40年代，大量的抗生素的发现使得抗生素作为抗菌药物被广泛的应用于临床，然而，这些抗生素所作用的靶位点非常的有限，病原菌对抗生素交叉耐药性的出现使得很多的靶位点变得不敏感，使得病源菌的耐药性越来越严重。所以人们开始寻找更多的新的靶位点来设计能够封闭靶位点的化合物分子和一些新颖的以及其它抗菌途径的化合物来作为新的抗菌药物。对微生物基因组的研究人们已经发现了许多潜在的药物作用靶位点(Corinne J.Cramer.N-Alkyl Urea Hydroxamic Acids as a New Class of Peptide deformylase Inhibitorswith Antibacterial Activity.Antimicrobial Agents and Chemotherapy，Sept.2002，p.2752-2764.)。
肽键去甲基化酶Peptide deformylase(PDF)，是细菌中蛋白质合成以及成熟起着至关重要的酶，是至今为止几个重要的可以被用来作为抗菌化合物药物分子设计的靶位点之一。在细菌中，蛋白质的合成起始于N-甲酰甲硫氨酸(N-formylmethionine)，所以所有新合成的蛋白质都带有N端的甲基。PDF可以从绝大多数的蛋白质中裂解掉N端的甲基，许多这些蛋白质还要进一步的经历去掉N端蛋氨酸以形成成熟蛋白质的过程。作为生命代谢所必须的活性蛋白，PDF在所有细菌中都存在。而另一方面，在真核细胞的细胞质中蛋白质的合成并不需要由N端的甲基化氨基酸所起始，并且PDF在哺乳动物的线粒体中也没有表现出这种作用。因此，PDF抑制剂向我们展示了一个广谱的抗菌制剂(Patricia M.Robin.In Vitro Activity of a New Antibiotic，NVP-PDF386(VRC4887)，against Chamydia pneymoniae.Antimicrobial Agents andChemotherapy，Apr.2003，p.1447-1448.)(3)。
Meinnel，和Blanquet(J.Bateriology，1993)所介绍的方法包括用一些硫酸铵沉淀来纯化这种酶蛋白，会照成酶蛋白分子的损伤以及分子空间结构的改变，目前的实验通过改造Meinnel，和Blanquet用的方法，通过一个DE-52的离子交换树脂来纯化细胞裂解初提物来获得高活性的酶蛋白(Jasonwaggonwer.Purification of Escherichia coli Peptide Deformylase.Chemistry andBiochemistry-Summer Research-1997.)。
PDF是一种结构特异的金属酶蛋白，它可以利用Fe2+作为辅基水解氨基化合物。由于Fe2+活性中心对环境中的氧以及氧化物的敏感性，天然的PDF是非常的不稳定并难以进行操作。然而用Ni2+或Co2+来替代Fe2+，PDF可以获得高度的稳定性，并可以保持酶的所有活性以及对底物作用的专一性。因此所有的关于PDF的化学性质、结构性质以及抑制剂的研究都是将Ni2+或Co2+来替代Fe2+后来完成的(Xubo Hu.Structure-Based Design of a Macrocyclic Inhibitor forPeptide Deformylase.Journal of Medicinal Chenistry.Volume 46，Number18，August28，2003)。
发明内容
本发明的目的在于提供了一种抗菌化合物，及该抗菌化合物在制备抗菌药物上的应用。
本发明的上述目的是通过如下技术方案来实现的：
本发明公开了一种具有下述通式(I)的化合物，

其中，R1表示氢原子、甲基或钠离子；R2表示氢原子、羟基或甲基；R3表示对甲基苯基、叔丁基，或咪唑基；R4表示氢原子、甲基或羟基保护基。
本发明还公开了上述化合物在制备抗菌药物方面的应用以及含有上述化合物的药物组合物。
式(I)化合物可与有机酸和无机酸形成可药用酸加成盐。式I化合物的酸加成盐的实例有与下列酸形成的盐：无机酸，例如氢卤酸如盐酸、氢溴酸和氢碘酸，硫酸、硝酸、磷酸等，有机磺酸例如烷基磺酸和芳香磺酸例如甲磺酸、对甲苯磺酸、苯磺酸等，以及有机羧酸例如乙酸、酒石酸、马来酸、柠檬酸、苯甲酸、水杨酸、抗坏血酸等。
式(I)化合物的药理上容许的酯衍生物、醚衍生物、氨基甲酰基的N-烷基衍生物及其可药用酸加成盐可通过本领域已知的方法制得。
本发明的产品可用做药物，例如经肠或非胃肠道给药用药物制剂形式的药物。本发明地产品可例如以片剂、包衣片剂、糖衣丸、硬和软明胶胶囊、溶剂、乳剂或混悬液的形式经口给药，以例如栓剂的形式直肠给药，以例如注射溶液的形式非胃肠道给药。
药物制剂的制备可以这样进行：按照本领域技术人员熟知的方式，将本发明物质，如果需要，与其它有治疗价值的物质一起，以及合适的无毒、惰性、在治疗上相容的固体或液体载体物质和，如果需要的话，常用药物辅剂制成各种给药剂型。
无机载体物质和有机载体物质都适合用作这样的载体。因此，乳糖、玉米淀粉或其衍生物、滑石、硬脂酸或其盐可用作例如片剂、包衣片剂、糖衣丸和硬明胶胶囊的载体。适用于软明胶胶囊的载体是例如植物油、蜡、脂肪以及半固体和液体多元醇(根据活性物质的性质，载体并不是必须的)。适于制备溶液剂和糖浆剂的载体物质是例如水、多元醇、蔗糖、转化糖和葡萄糖。适于制备注射液的载体材料是例如水、醇、多元醇、甘油和植物油、适于栓剂的载体物质是例如天然或硬化油、蜡、脂肪和半液体或液体多元醇。
药物辅助剂是常用的防腐剂、增溶剂、稳定剂、润湿剂、乳化剂、甜料、矫味剂、用于改变渗透压的盐、缓冲剂、包衣剂和抗氧化剂。
本发明的物质可以经口、直肠和非胃肠道给药可用于宿主、尤其是恒温动物宿主的治疗例如人类医疗。对于成人，可采用的日剂量为约0.2g～约2g本发明的上述化合物。
本发明的上述化合物可作为肽键去甲基化酶(Peptide deformylase，PDF)的抑制剂，从而阻断细菌中蛋白质合成过程，起到抗菌的效果。具有优良强大广谱的抗菌活性，对钩端螺旋体以及其它G-细菌，G+细菌有强大的杀灭作用，可用于治疗或预防感染症。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步描述。
实施例1
制备2-(N-对甲苯基-N-对甲苯磺酰氨基)乙酰肼亚甲基苯甲酸
本实施例按照下述步骤制备获得2-(N-对甲苯基-N-对甲苯磺酰氨基)乙酰肼亚甲基苯甲酸，所有步骤都在搅拌的条件下完成，其中：RT表示室温。

实施例2
2-(N-对甲苯基-N-对甲苯磺酰氨基)乙酰肼亚甲基苯甲酸的抗菌性能
试验菌与菌液制备
试验菌
细菌：
1问号状钩端螺旋体黄疸出血型-赖株。
2金黄色葡萄球菌(ATCC 6538)，大肠杆菌(8099)，表皮葡萄球菌，枯草芽孢杆菌(B921)。
菌液制备：
1问号状钩端螺旋体黄疸出血型-赖株，取连续在液体EMJH培养基第3代以上的菌液，按照1/10的接种量，接种于新鲜的EMJH液体培养基中，培养24h，OD600在0.10，菌数1×108。
2金黄色葡萄球菌，大肠杆菌取菌株第3～14代的营养琼脂培养基斜面新鲜培养物(18～24h)，用5mL0.03mol/L磷酸盐缓冲液(以下简称PBS)洗下菌苔，使菌悬浮均匀后用上述PBS稀释至所需浓度。
抗菌化合物的配制
将实施例1制备获得的2-(N-对甲苯基-N-对甲苯磺酰氨基)乙酰肼亚甲基苯甲酸溶解在(二甲基亚砜)DMSO中，配制成20mg/ml，0.2um微空滤膜过滤。
抗菌谱的测定方法
选择不同细菌作为试验菌，测其抑菌圈的大小(纸片法，纸片直径5mm，加样量5ml)。
选择钩体菌作为试验菌，测定其溶液中的OD值。
用抗生素卡那霉素、壮观霉素、新霉素作为对照。
操作步骤
抗菌作用的测定：
1问号状钩端螺旋体黄疸出血型-赖株取菌液0.1ml均匀的涂布在含有琼脂0.6％的EMJH培养基上，28℃培养24h，菌体微微开始生长，加入纸片(直径5mm)，在纸片上加入抗菌液5ul(100ug)，28℃培养3～5天观察抗菌作用。将钩体以1/100接种，分别加入化合物以及抗生素致100ug/ml，3～5天测OD600直。
2金黄色葡萄球菌，大肠杆菌取0.1ml107菌数菌液均匀涂布于LB平板上，风干后在培养基中加入纸片(直径为5mm)。30℃条件下培养至培养基表面长出薄薄的一层菌落，向纸片中加入抗菌液5μl(100ug)，培养过夜，观察抗菌作用。最低抑菌浓度的测定：分步稀释法，制备EMJH固体平板，分别含有化合物40，20，10，5，2.5，1.25，0.625ug/ml，将问号状钩端螺旋体黄疸出血型-赖株菌液0.1ml107菌数均匀涂布平板，，28℃培养3～5天观察抑菌情况，从而确定化合物对其最低抑菌浓度。
热稳定性的测定：分别取1ml样品于试管中，在37、60、80、100、121℃下保持30min和1h，冷却至室温，以未经处理的样品作对照。
酸碱稳定性的测定：在试管中加入1ml样品，用1mol/L氢氧化钠或1mol/L盐酸将样品溶液分别调至pH3，5，7，9，11，室温保持24h后再将各管的pH调回至约pH7.0，以末调pH的样品作对照检测抑菌活性。
化合物抗菌谱的测定结果(如表2-1所示)
表2-1  指示菌(细菌)  抑菌圈直径(mm)  拮抗能力  革兰氏阳性  菌 金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)  0 表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)  0 枯草芽孢杆菌(Bacillius subtilis)  0  革兰氏阴性  菌 大肠杆菌(Escherichia coli)  0 问号状钩端螺旋体(leptospira interrogans)  16  +++
PS：纸片直径为5mm；抑菌圈直径8-10mm为+，11-15mm为++，16到20mm为+++，21到25为++++，大于26为+++++，-表示无抗菌作用
化合物最低抑菌浓度结果(如表2-2所示)
表2-2  指示菌(细菌)  最低抑菌浓度(ug/ml)  革兰氏阳性  菌 金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus) 表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis) 枯草芽孢杆菌(Bacillius subtilis)  革兰氏阴性  菌 大肠杆菌(Escherichia coli) 问号状钩端螺旋体(leptospira interrogans)  50
对问号状钩端螺旋体(leptospira interrogans)化合物于不同抗生素比较(如表2-3所示)
表2-3  名称  浓度(ug/ml)  OD600(24h)  OD600(48h)  OD600(72h)  kanamycin  50  0.026  0.012  0.035  Spectomycin  50  0.019  0.011  0.031  neomycin  50  0.024  0.019  0.021  化合物  50  0.024  0.026  0.064  对照菌体  0.057  0.106  0.140  DMSO  0.051  0.100  0.184
对照菌体按1/100接种量，DMSO为化合物对照。
化合物热稳定性的测定：
化合物在37～60℃条件下30min活力不变，在80℃条件下30min活力下降5％，在100℃条件下30min活力下降30％，121℃条件下30min活力下降90％。
化合物酸碱稳定性的测定：
化合物在pH5～9条件下稳定，在pH3条件下24h后活力下降80％，在pH11条件下24h活力下降90％。
实施例3
2-(N-对氯苯基-N-对氯苯磺酰氨基)乙酰肼亚甲基苯甲酸的抗菌活性：
测定方法同实施例2，结果(如表3-1所示)：
                                                            表3-1  指示菌(细菌)  抑菌圈直径(mm)  拮抗能力  革兰氏阳性菌  金黄色葡萄球菌  (Staphylococcus aureus)  表皮葡萄球菌  (Staphylococcus epidermidis)  枯草芽孢杆菌  (Bacillius subtilis)  革兰氏阴性菌  大肠杆菌  (Escherichia coli)  问号状钩端螺旋体  (leptospira interrogans)  18  +++
其中，纸片直径为5mm；抑菌圈直径8-10mm为+，11-15mm为++，16到20mm为+++，21到25为++++，大于26为+++++，-表示无抗菌作用
化合物最低抑菌浓度结果(如表3-2所示)
                                                                   表3-2  指示菌(细菌)  最低抑菌浓度(ug/ml)  革兰氏阳性菌  金黄色葡萄球菌  (Staphylococcus aureus)  表皮葡萄球菌  (Staphylococcus epidermidis)
  枯草芽孢杆菌  (Bacillius subtilis)  革兰氏阴性菌  大肠杆菌  (Escherichia coli)  问号状钩端螺旋体  (leptospira interrogans)  40
对问号状钩端螺旋体(leptospira interrogans)化合物于不同抗生素比较(如表3-3所示)
                                                                表3-3  名称  浓度(ug/ml)  OD600(24h)  OD600(48h)  OD600(72h)  kanamycin  50  0.026  0.012  0.035  Spectomycin  50  0.019  0.011  0.031  neomycin  50  0.024  0.019  0.021  化合物  50  0.002  0.001  0.058  对照菌体  0.057  0.106  0.140  DMSO  0.051  0.100  0.184
对照菌体按1/100接种量，DMSO为化合物对照。
实施例4
片剂
2-(N-对甲苯基-N-对甲苯磺酰氨基)乙酰肼亚甲基苯甲酸    100mg
                                        玉米淀粉     15mg
                                        滑石粉       3mg
                                        硬脂酸镁     2mg
                                        总重量       120mg
实施例5
注射溶液：
2-(N-对甲苯基-N-对甲苯磺酰氨基)乙酰肼亚甲基苯甲酸    5mg
丙二醇                                               0.5ml
双重蒸馏无菌水                                       加至1.0ml