取代的喹啉2甲醛苯腙类化合物及其制备方法和用途.pdf

本发明涉及一类取代喹啉-2-甲醛-苯腙类化合物及其制备方法和用途。具体涉及新型的4-酰基-喹啉-2-甲醛-苯腙类化合物及其制备方法以及该类化合物在制备由登革病毒引起的登革热及登革出血骨痛热等的治疗药物中的应用。该类化合物的结构通式如式1所示。此类化合物可作为登革病毒NS2B-NS3蛋白酶抑制剂，从而阻止登革病毒在宿主体内的进一步增殖。

权利要求书
1.  一类如式1所示的取代的喹啉-2-甲醛-苯腙类化合物，

其中：
R1选自H、卤素和C1-C4烷氧基；
X不存在或者为N；
当X为N时，R2为其中m和n分别独立地为0～2的整数；当X不存在时，R2为其中o为1～4的整数；
R3、R4和R5分别独立地选自H、卤素、C1-C4烷基、C1-C4烷氧基、羧基C1-C6烷氧基、羧
基C1-C6烷基、羧基、氰基、硝基、羟甲基、三氟甲基、三氟甲氧基、羟基、巯基和氨磺酰基。

2.  根据权利要求1所述的如式1所示的取代的喹啉-2-甲醛-苯腙类化合物，其特征在于，为化合物IA，

其中：
R1为H；
m和n分别独立地选自0～2的整数；
R3和R4的定义与权利要求1相同。

3.  根据权利要求1所述的如式1所示的取代喹啉-2-甲醛-苯腙类化合物，其特征在于，为化合物IB，

其中：
R1为H；
o为1～4的整数；
R3和R5的定义与权利要求1相同。

4.  根据权利要求1或2所述的如式1所示的取代的喹啉-2-甲醛-苯腙类化合物，其特征在于，具体为：



5.  根据权利要求1或3所述的如式1所示的取代的喹啉-2-甲醛-苯腙类化合物，其特征在于，具体为：


6.  一种制备取代的喹啉-2-甲醛-苯腙类化合物的方法，其特征在于，所述制备方法选自以下两种方法中的任意一种：
方法一：

1)将R1取代的靛红投入到氢氧化钾溶液中，于50-60℃搅拌10-15小时，滴加丙酮，反应3-8小时至完全，将反应液冷却至室温，用酸调节pH至酸性，析出固体，抽滤，干燥，得到中间体II，即R1取代的2-甲基-喹啉-4-甲酸；
2)将中间体II投入到无水乙醇中，加入酸催化剂，于60-80℃搅拌10-20小时，蒸除溶剂，得到中间体III，即R1取代的2-甲基-喹啉-4-甲酸乙酯；
3)将中间体III投入到二氧六环溶液中，加入氧化剂二氧化硒，于100-110℃搅拌1-2小时，蒸除溶剂二氧六环，用有机溶剂萃取，干燥，蒸除溶剂，残余固体经硅胶柱层析分离，得到中间体IV，即R1取代的2-甲酰基-喹啉-4-甲酸乙酯；
4)将中间体IV与R3取代的苯肼投入到无水乙醇中，加入催化量的冰醋酸，于60-80℃搅拌2-5小时，抽滤，乙醇洗，得到中间体V，即R1取代的2-R3取代苯肼基甲叉基-喹啉-4-甲酸乙酯；
5)将中间体V与水合肼于120-140℃下混合搅拌10-20小时，倒入水中，析出固体，抽滤，水洗，得到中间体VI，即R1取代的2-R3取代苯肼基甲叉基-喹啉-4-甲酰肼；
6)将中间体VI与R4取代的苯基饱和或不饱和烃醛投入到无水乙醇中，加入催化量的冰醋酸，于60-80℃搅拌2-5小时，抽滤，乙醇洗，得到化合物IA，即4-取代肼甲酰基-喹啉-2-甲醛-苯腙类化合物；
其中，R1、R3、R4、m和n的定义与权利要求1相同；和
方法二：

1)以R1取代的靛红为原料，以上述方法一中的第1)步类似的方法制备中间体II，即
R1取代的2-甲基-喹啉-4-甲酸；
2)将中间体II以上述方法一中的第3)步类似的方法制备中间体VII，即R1取代的
2-甲酰基-喹啉-4-甲酸；
3)将中间体VII投入到二氯甲烷中，加入EDCI和HOBt，于0℃搅拌一小时，再加入R5取代的苯基烷烃胺和三乙胺，反应过夜，然后加水萃取，干燥，蒸除溶剂，残余固体经硅胶柱层析分离，得到中间体VIII，即N-R5取代苯烷基-2-甲酰基-喹啉-4-甲酰胺；
4)以上述方法一中的第4)步类似的方法，制备得到化合物IB，即4-取代氨甲酰基-喹啉-2-甲醛-苯腙类化合物；
其中，R1、R3、R5和o的定义与权利要求1相同。

7.  一种药物组合物，其特征在于，该药物组合物包含治疗有效量的一种或多种权利要求1所述的如式1所示的取代的喹啉-2-甲醛-苯腙类化合物以及药学上可接受的载体。

8.  权利要求1所述的如式1所示的取代的喹啉-2-甲醛-苯腙类化合物在制备登革病毒NS2B-NS3蛋白酶抑制剂的药物中的用途。

9.  权利要求1所述的如式1所示的取代的喹啉-2-甲醛-苯腙类化合物在制备预防或治疗登革病毒引起的包括登革热、登革出血热和登革休克综合征的药物中的用途。

说明书取代的喹啉-2-甲醛-苯腙类化合物及其制备方法和用途
技术领域
[0001]本发明涉及药物化学和药物治疗学领域，更具体涉及取代的喹啉-2-甲醛-苯腙类化合物及其制备方法。该类化合物可用于治疗登革病毒(DV，Denguevirus)引起的疾病。
背景技术
[0002]登革病毒是黄病毒科(flaviviridae)黄病毒属(flavivirus)登革亚组的重要成员。它是单股RNA病毒，具感染性，与碱性衣壳蛋白c构成病毒的核衣壳。自然界中存在的登革病毒可分为4个血清型，分别为DEN-1、DEN-2、DEN-3和DEN-4，不同血清型间存在抗原交叉反应。可引起较轻微的登革热(DF，Denguefever)和极其严重的登革出血骨痛热/登革休克综合征(DHF/DSS，Denguehemorrhagicfever/Dengueshocksyndrome)。其传播媒介为埃及伊蚊和白纹伊蚊，易感人群是儿童。
[0003]据报道，登革热广泛流行于热带和亚热带的100多个国家和地区，全球每年约有
0.5～1亿DF和25～50万DHF患者，其中约有5000人由于DHF/DSS而死亡。我国的广东、海南、台湾等省都曾有过DF的发生或大流行，它是我国发病率最高的虫媒病毒性疾病之一，而且DHF和DSS有着很高的死亡率，故DV传播所造成的危害已成为一个严重的公共卫生问题，该问题将随着气候变暖和全球化的发展而变得越来越严重。
[0004]目前对登革病毒的热门研究方向包括登革病毒感染机制研究(细胞水平研究和病毒水平研究)，登革病毒感染诊断方法，登革疫苗的研究，动物模型的构建，以及抗登革药物的研究。到现在为止，仍然没有可靠的诊断方法，也没有安全有效的登革疫苗或特效抗登革病毒药物。临床上主要采取对症治疗和支持疗法。现有的抗病毒药物虽然体外试验抗DV有效，但体内试验效果皆不明显。在这种情况下，亟待研发具有显著治疗作用的抗登革病毒药物。
[0005]登革热病毒的复制是通过其11kb的RNA基因组编码一个多聚蛋白，在病毒和寄主蛋白酶的作用下，将该多聚蛋白酶分解成具有不同功能的蛋白，包括三个结构蛋白(C，prM和E)和七个非结构蛋白(NS1，NS2A，NS2B，NS3，NS4A，NS4B，NS5)。NS3蛋白是这十种蛋白中第二大的病毒蛋白，拥有四种不同的酶活性：丝氨酸蛋白酶、RNA解旋酶、NTP蛋白酶和RNA三磷酸酶。NS3的蛋白酶活性和解旋酶活性对病毒复制过程十分重要，这使得NS3蛋白成为一个潜在的抗登革病毒靶标。进一步研究表明，NS2B蛋白作为NS3蛋白酶的辅助因子，对NS3蛋白酶发挥酶活性起至关重要的作用，只有在两者形成二聚体复合物后，才能激活NS3蛋白酶。
[0006]近年来，“计算机辅助药物设计”(Computer-AidedDrugDesign，CADD)已成为现代药物研究与开发的一个重要方法和工具，被广泛地应用于先导化合物的发现与优化。其原理是通过大量计算，运用计算模拟、分子对接和相似性分析等多种方法在寻找、设计和优化成药性高的可以与某一特定疾病靶标蛋白结合的化学结构，为进一步的分子、细胞、动物和临床研究提供高效可靠的小分子先导化合物。
[0007] 综上所述，以登革病毒NS2B-NS3蛋白酶为靶标，结合CADD和各种水平的生物活性测试试验，设计并合成的小分子化合物，对开发抗登革药物具有重要的现实意义。
[0008]本发明综合运用CADD和酶抑制活性实验，发现了一个取代喹啉-2-甲醛-苯腙类化合物具有抑制登革病毒NS2B-NS3蛋白酶的活性。本发明进一步运用合理药物设计方法针对此化合物进行结构修饰获得了一类结构全新的取代喹啉-2-甲醛-苯腙类化合物，并测试此类化合物在体外酶水平实验测试中抑制登革病毒NS2B-NS3蛋白酶的活性，结果证明本申请化合物具有较强的登革病毒NS2B-NS3蛋白酶抑制活性。并且本发明进一步在登革病毒亚复制子(Replicon)感染细胞水平实验中，发现本发明化合物具有明显的抗登革病毒活性。
发明内容
[0009]本发明以登革病毒NS2B-NS3蛋白酶为靶标设计了一类取代的喹啉-2-甲醛-苯腙类化合物，发明了其制备方法，并测定了该类化合物抑制登革病毒NS2B-NS3蛋白酶活性和抗登革病毒(Replicon)的能力。
[0010] 本发明的一个目的是提供靶向登革病毒NS2B-NS3蛋白酶的、具有抗登革病毒复制作用的新型取代的喹啉-2-甲醛-苯腙类化合物，其结构通式如式1所示。
[0011] 本发明的另一个目的是提供取代的喹啉-2-甲醛-苯腙类化合物的制备方法。[0012] 本发明的再一个目的是提供作为登革病毒NS2B-NS3蛋白酶抑制剂的取代的喹啉-2-甲醛-苯腙类化合物在制备预防或治疗登革病毒导致的相关疾病方面的药物组合物中的应用。
[0013] 本发明还提供包含治疗有效量的一种或多种上述取代的喹啉-2-甲醛-苯腙类化合物以及药学上可接受的载体的药物组合物。
[0014] 本发明所涉及的取代的喹啉-2-甲醛-苯腙类化合物可作为登革病毒NS2B-NS3蛋白酶的小分子抑制剂，通过抑制NS2B-NS3蛋白酶活性而抑制登革病毒的复制，从而阻断登革病毒的生命周期。因此可开发成为新的抗登革病毒药物，可用于预防或治疗登革病毒引起的各类疾病，如登革热(denguefever，DF)，登革出血热(denguehemorrhagicfever，DHF)和登革休克综合征(dengueshocksyndrome，DSS)。
[0015] 根据本发明的一个目的，本发明提供具有如下通式1结构的取代的喹啉-2-甲醛-苯腙类化合物：
[0016]

[0017] 其中：
[0018]R1选自H、卤素和C1-C4烷氧基；
[0019]X不存在或者为N；
[0020]当X为N时，R2为其中m和n分别独立地选自0～2
的整数；
[0021]当X不存在时，R2为其中o为1～4的整数；
[0022]R3、R4和R5分别独立地选自H、卤素、C1-C4烷基、C1-C4烷氧基、羧基C1-C6烷氧基、羧基C1-C6烷基、羧基、氰基、硝基、羟甲基、三氟甲基、三氟甲氧基、羟基、巯基和氨磺酰基。
[0023]进一步地，本发明式1化合物的第一个优选实施方案是化合物IA，
[0024]

[0025]其中：
[0026]R1为H；
[0027]m和n分别独立地选自0～2的整数；
[0028]R3和R4定义与上述相同。
[0029]本发明式1化合物的第二个优选实施方案是化合物IB，
[0030]

[0031]其中：
[0032]R1为H；
[0033]o为1～4的整数；
[0034]R3和R5的定义与上述相同。
[0035]进一步优选地，上述通式1化合物具体为：
[0036]

[0037]

[0038]

[0039]

[0040] 本发明还提供通式1结构的取代喹啉-2-甲醛-苯腙类化合物(IA～IB)及其中间体II～VIII的制备方法，具体合成策略分别如下。
[0041]IA的合成：
[0042]

[0043] 1)将R1取代的靛红投入到氢氧化钾溶液中，于50-60℃搅拌10-15小时，滴加丙酮，反应3-8小时至完全，将反应液冷却至室温，用适量的酸(盐酸、硫酸)调节pH至酸性，析出固体，抽滤，干燥，得到R1取代的2-甲基-喹啉-4-甲酸(中间体II)。
[0044]2)将中间体II投入到无水乙醇中，加入适量的酸催化剂(如浓硫酸、浓盐酸和冰醋酸)，于60-80℃搅拌10-20小时，蒸除溶剂，得到R1取代的2-甲基-喹啉-4-甲酸乙酯(中间体III)。
[0045]3)将中间体III投入到二氧六环溶液中，加入氧化剂二氧化硒，于100-110℃搅拌
1-2小时，蒸除溶剂二氧六环，用有机溶剂(如乙醚)萃取，干燥，蒸除溶剂，残余固体经硅胶柱层析分离，得到R1取代的2-甲酰基-喹啉-4-甲酸乙酯(中间体IV)。
[0046]4)将中间体IV与R3取代的苯肼投入到无水乙醇中，加入催化量的冰醋酸，于
60-80℃搅拌2-5小时，抽滤，乙醇洗，得到R1取代的2-R3取代苯肼基甲叉基-喹啉-4-甲酸乙酯(中间体V)。
[0047] 5)将中间体V与水合肼于120-140℃混合搅拌10-20小时，倒入水中，析出固体，抽滤，水洗，得到R1取代的2-R3取代苯肼基甲叉基-喹啉-4-甲酰肼(中间体VI)。
[0048]6)将中间体VI与R4取代的苯基饱和或不饱和烃醛投入到无水乙醇中，加入催化量的冰醋酸，于60-80℃搅拌2-5小时，抽滤，乙醇洗，得到化合物IA，即4-取代肼甲酰基-喹啉-2-甲醛-苯腙类化合物。
[0049]其中，R1、R3、R4、m和n的定义同上。
[0050]IB的合成：
[0051]

[0052] 1)以R1取代的靛红为原料，以上述的IA的合成中的第1)步类似的方法制备R1取代的2-甲基-喹啉-4-甲酸(中间体II)；
[0053] 2)将中间体II以上述IA的合成中的第3)步类似的方法制备R1取代的2-甲酰基-喹啉-4-甲酸(中间体VII)；
[0054]3)将中间体VII投入到二氯甲烷中，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDCI)和1-羟基苯并三唑(HOBt)，于0℃搅拌一小时。再加入R5取代的苯基烷烃胺和三乙胺，反应过夜。加水萃取，干燥，蒸除溶剂，残余固体经硅胶柱层析分离，得到N-R5取代苯烷基-2-甲酰基-喹啉-4-甲酰胺(中间体VIII)。
[0055] 4)以上述IA的合成中的第4)步类似的方法，制备得到化合物IB，即4-取代氨甲酰基-喹啉-2-甲醛-苯腙类化合物。
[0056]其中，R1、R3、R5和o的定义同上。
[0057]本发明部分化合物能有效抑制NS2B-NS3蛋白酶的活性，并且其能作为NS2B-NS3酶抑制剂，具有抑制病毒复制的能力，可发展为抗登革病毒的预防及治疗药物。该化合物对NS2B-NS3蛋白酶半数有效抑制浓度(IC50)的测定结果见附图及表1，抗登革病毒(replicon)活性结果的IC50值见表2。
附图说明
[0058] 图1为化合物IA-1对NS2B-NS3酶活抑制的量效曲线图。[0059] 图2为化合物IA-2对NS2B-NS3酶活抑制的量效曲线图。[0060] 图3为化合物IA-4对NS2B-NS3酶活抑制的量效曲线图。[0061] 图4为化合物IA-5对NS2B-NS3酶活抑制的量效曲线图。[0062] 图5为化合物IA-6对NS2B-NS3酶活抑制的量效曲线图。[0063] 图6为化合物IA-9对NS2B-NS3酶活抑制的量效曲线图。[0064] 图7为化合物IA-11对NS2B-NS3酶活抑制的量效曲线图。[0065] 图8为化合物IA-13对NS2B-NS3酶活抑制的量效曲线图。
[0066] 图9为化合物IB-8对NS2B-NS3酶活抑制的量效曲线图。
具体实施方式
[0067]在以下的实施例中将进一步举例说明本发明。这些实施例仅用于说明本发明，但不以任何方式限制本发明。实施例中的所有参数以及其余的说明，除另有说明外，都是以质量(克)为单位。
[0068] 制备实施例
[0069] 实验材料及仪器：
[0070] pET28载体购自Novagen，大肠杆菌BL21购自Novagen，表达NS2B-NS3蛋白用的cDNA由ChristianD.Klein馈赠。IPTG购自上海生工生物工程有限公司，Dabcyl-KQRRGRIE-Edans购自吉尔生化上海有限公司，DMSO、NaCl等本发明实施例中所涉及的常规药品均购自上海生工生物工程有限公司。
[0071] 仪器：SpectraMaxFlexStation3荧光分光光度计购自MolecularDevices，化学荧光酶标仪购自MolecularDevices。
[0072] 实施例12-甲基-喹啉-4-甲酸(中间体II)的制备
[0073]

[0074] 氮气保护下，将1.0克靛红投入到氢氧化钾溶液中(氢氧化钾：2.67克，水：5毫升)，于50℃回流反应15小时，滴加5ml丙酮，反应3小时至完全，将反应液冷却至室温，用浓盐酸调节pH＝7，生成少量氯化钾固体，抽滤除去。再将母液pH调节至3，析出大量乳白色固体，抽滤，水洗，干燥，得到中间体II为白色固体，收率50％。Mp248-250℃；
1HNMR(DMSO，400MHz)：δ2.72(s，3H)，7.64(t，1H)，7.78(t，1H)，7.84(s，1H)，8.02(d，1H)，
8.63(d，1H).
[0075] 实施例22-甲基-喹啉-4-甲酸乙酯(中间体III)的制备
[0076]

[0077]将1.0克2-甲基-4-喹啉甲酸(中间体II)投入到30毫升乙醇中，滴加2毫升浓硫酸，于80℃混合搅拌18小时，蒸除溶剂，得到0.86克2-甲基-4-喹啉甲酸乙酯(中间体III)，为白色固体，收率80％。1HNMR(CDCl，400MHz)δ1.50(t，3H)，2.83(s，3H)，4.53(q，
2H)，7.61(t，1H)，7.76(t，1H)，7.82(s，1H)，8.10(d，1H)，8.71(d，1H)。
[0078] 实施例32-甲酰基-喹啉-4-甲酸乙酯(中间体IV)的制备
[0079]

[0080] 将0.50克2-甲基-4-喹啉甲酸乙酯(中间体III)投入到10毫升二氧六环溶液中，加入1.30克二氧化硒，回流反应4小时。反应结束后，蒸除二氧六环，用乙酸乙酯和水萃取，酯层用水洗，盐水洗，干燥，浓缩，柱层析得到2-甲酰基-4-喹啉甲酸乙酯(中间体VI)，产率99％。1HNMR(CDCl3，400MHz)：δ1.52(t，3H)，4.56(q，2H)，7.83(t，1H)，7.91(t，1H)，
8.35(d，1H)，8.54(s，1H)，8.90(d，1H)，10.29(s，1H).
[0081] 实施例44-乙氧羰基-喹啉-2-甲醛-(4-氨磺酰基)苯腙(中间体V)的制备
[0082]

[0083] 将34毫克2-甲酰基-4-喹啉甲酸乙酯(中间体IV)与35毫克4-磺酰胺基苯肼分别投入到10毫升无水乙醇中，加入3滴冰醋酸，于80℃搅拌2小时，抽滤，乙醇洗，得到50毫克4-乙氧羰基-喹啉-2-甲醛-(4-氨磺酰基)苯腙(中间体V)，为黄色固体，收率75％。1HNMR(DMSO，400MHz)δ1.45(t，3H)，4.52(q，2H)，7.17(s，2H)，7.29(d，2H)，
7.70(t，1H)，7.76(d，2H)，7.85(t，1H)，8.09(d，1H)，8.15(s，1H)，8.48(s，1H)，8.52(d，1H)，
11.42(s，1H)。
[0084] 实施例54-肼甲酰基-喹啉-2-甲醛-(4-氨磺酰基)苯腙(中间体VI)的制备
[0085]

[0086]将25毫克4-乙氧羰基-喹啉-2-甲醛-(4-氨磺酰基)苯腙(中间体V)与2.5毫升水合肼于120℃混合搅拌20小时，倒入水中，析出固体，抽滤，水洗，干燥，得到4-肼甲酰基-喹啉-2-甲醛-(4-氨磺酰基)苯腙(中间体VI)，收率90％，为黄色固体。1HNMR(DMSO，
400MHz)δ4.73(s，2H)，7.21(s，2H)，7.55(d，2H)，7.62(s，1H)，7.72-7.80(m，4H)，7.92(t，
1H)，8.17(d，1H)，8.43(d，1H)，10.00(s，1H)，14.77(s，1H)。
[0087] 实施例64-(3-羟基苯甲叉基)肼甲酰基-喹啉-2-甲醛-(4-氨磺酰基)苯腙
(化合物IA-1)的制备
[0088]

[0089] 将30毫克4-肼甲酰基-喹啉-2-甲醛-(4-氨磺酰基)苯腙(中间体VI)与20毫克3-羟基苯甲醛分别投入到5毫升无水乙醇中，加入2滴冰醋酸，于80℃搅拌2小时，抽滤，乙醇洗，得到4-(3-羟基苯甲叉基)肼甲酰基-喹啉-2-甲醛-(4-氨磺酰基)苯腙
(化合物I-1)，收率70％，为黄色固体。Mp＞300℃；1HNMR(DMSO，400MHz)δ7.15-7.17(m，
3H)，7.29(d，2H)，7.35(d，2H)，7.66-7.85(m，4H)，8.06-8.15(m，2H)，8.17(s，1H)，8.29(s，
1H)，8.32(s，1H)，9.69(s，1H)，11.39(s，1H)，12.24(s，1H)；MS(ESI)m/z489.2[M+1]+。[0090] 实施例74-(苯丙叉基)肼甲酰基-喹啉-2-甲醛-(4-氨磺酰基)苯腙(化合物IA-2)的制备
[0091]

[0092]除了将3-羟基苯甲醛替换成苯丙醛之外，其余所需原料、试剂及制备方法同实施例6，得化合物I-2，黄色固体26毫克，收率60％。Mp＞300℃；1HNMR(DMSO，400MHz)δ2.63-2.66(m，2H)，2.87(t，2H)，7.24-7.33(m，7H)，7.56(d，2H)，7.70-7.80(m，5H)，
7.93-7.98(m，2H)，8.12(d，1H)，8.47(d，1H)，11.96(s，1H)，14.77(s，1H)；MS(ESI)m/z
501.2[M+1]+。
[0093] 实施例84-(苯乙叉基)肼甲酰基-喹啉-2-甲醛-(4-氨磺酰基)苯腙(化合物IA-3)的制备
[0094]

[0095] 除了将3-羟基苯甲醛替换成苯乙醛之外，其余所需原料、试剂及制备方法同实施例6，制得化合物I-3，黄色固体42毫克，收率57％。Mp＞300℃；1HNMR(DMSO，
400MHz)δ3.69(d，2H)，7.21(s，2H)，7.27-7.40(m，5H)，7.55(d，2H)，7.62(s，1H)，
7.72-7.84(m，5H)，7.92-7.95(m，2H)，8.45(t，1H)，11.98(s，1H)，14.75(s，1H)；MS(ESI)m/z
487.2[M+1]+。
[0096] 实施例94-(苯丙烯叉基)肼甲酰基-喹啉-2-甲醛-(4-氨磺酰基)苯腙(化合物IA-4)的制备
[0097]

[0098] 除了将3-羟基苯甲醛替换成苯丙烯醛之外，其余所需原料、试剂及制备方法同实施例6，制得化合物I-4，黄色固体54毫克，收率57％。Mp＞300℃；1HNMR(DMSO，
400MHz)δ7.14(d，1H)，7.22(s，2H)，7.27(t，1H)，7.38(t，1H)，7.42(t，1H)，7.57(d，2H)，
7.66(t，2H)，7.73-7.85(m，4H)，7.91-8.00(m，2H)，8.16(t，1H)，8.47(t，1H)，12.19(s，1H)，
14.77(s，1H)；MS(ESI)m/z499.2[M+1]+。
[0099] 实施例104-(苯丙叉基)肼甲酰基-喹啉-2-甲醛-(3-氯)苯腙(化合物IA-5)
的制备
[0100]

[0101] 除了将4-磺酰胺基苯肼替换成3-氯苯肼，将3-羟基苯甲醛替换成苯丙醛之外，其余所需原料、试剂及制备方法同实施例4，5和6，制得化合物IA-5，黄色固体43毫克，收率49％。Mp＞300℃；1HNMR(DMSO，400MHz)δ2.62-2.67(m，2H)，2.88(t，2H)，7.14(d，1H)，
7.22-7.29(m，7H)，7.63(t，1H)，7.73(t，1H)，7.79(t，1H)，8.03-8.08(m，4H)，8.19(s，1H)，
11.17(s，1H)，11.90(s，1H)；MS(ESI)m/z456.2[M+1]+。
[0102] 实施例114-(苯乙叉基)肼甲酰基-喹啉-2-甲醛-(3-氯)苯腙(化合物IA-6)
的制备
[0103]

[0104]除了将4-磺酰胺基苯肼替换成3-氯苯肼，将3-羟基苯甲醛替换成苯乙醛之外，其余所需原料、试剂及制备方法同实施例4，5和6，制得化合物IA-6，黄色固体48毫克，收率69％。Mp＞300℃；1HNMR(DMSO，400MHz)δ3.69(d，2H)，6.88(d，1H)，7.14(d，
1H)，7.25-7.40(m，7H)，7.63(t，1H)，7.77-7.82(m，2H)，8.03-8.08(m，3H)，8.22(s，1H)，
11.16(s，1H)，11.95(s，1H)；MS(ESI)m/z442.2[M+1]+。
[0105] 实施例124-(苯丙烯叉基)肼甲酰基-喹啉-2-甲醛-(3-氯)苯腙(化合物
IA-7)的制备
[0106]

[0107] 除了将4-磺酰胺基苯肼替换成3-氯苯肼，将3-羟基苯甲醛替换成苯丙烯醛之外，其余所需原料、试剂及制备方法同实施例4，5和6，制得化合物IA-7，黄色固体43毫克，收率62％。Mp＞300℃；1HNMR(DMSO，400MHz)δ6.88(d，1H)，7.13-7.37(m，7H)，7.42(t，
1H)，7.49(d，1H)，7.66(d，2H)，7.82(t，1H)，8.05-8.11(m，3H)，8.17-8.18(m，1H)，8.28(s，
1H)，11.18(s，1H)，12.17(s，1H)；MS(ESI)m/z454.2[M+1]+。
[0108] 实施例134-(苯丙叉基)肼甲酰基-喹啉-2-甲醛-(3-溴)苯腙(化合物IA-8)
的制备
[0109]

[0110] 除了将4-磺酰胺基苯肼替换成3-溴苯肼，将3-羟基苯甲醛替换成苯丙醛之外，其余所需原料、试剂及制备方法同实施例4，5和6，制得化合物IA-8，黄色固体25毫克，收率78％。Mp＞300℃；1HNMR(DMSO，400MHz)δ2.62-2.67(m，2H)，2.88(t，2H)，7.02(d，1H)，
7.18-7.33(m，7H)，7.63(t，1H)，7.73(t，1H)，7.81(t，1H)，8.02-8.08(m，4H)，8.18(s，1H)，
11.15(s，1H)，11.91(s，1H)；MS(ESI)m/z500.2[M+1]+。
[0111] 实施例144-(苯乙叉基)肼甲酰基-喹啉-2-甲醛-(3-溴)苯腙(化合物IA-9)
的制备
[0112]

[0113] 除了将4-磺酰胺基苯肼替换成3-溴苯肼，将3-羟基苯甲醛替换成苯乙醛之外，其余所需原料、试剂及制备方法同实施例4，5和6，制得化合物IA-9，黄色固体35毫克，收率71％。Mp＞300℃；1HNMR(DMSO，400MHz)δ3.69(d，2H)，7.02(t，1H)，7.18-7.40(m，8H)，
7.63(t，1H)，7.77-7.83(m，2H)，8.03-8.07(m，3H)，8.21(s，1H)，11.14(s，1H)，11.95(s，
1H)；MS(ESI)m/z486.1[M+1]+。
[0114] 实施例154-(苯丙叉基)肼甲酰基-喹啉-2-甲醛-(3-三氟甲基)苯腙(化合物IA-10)的制备
[0115]

[0116] 除了将4-磺酰胺基苯肼替换成3-三氟甲基苯肼，将3-羟基苯甲醛替换成苯丙醛之外，其余所需原料、试剂及制备方法同实施例4，5和6，制得化合物IA-10，黄色固体
65毫克，收率43％。Mp＞300℃；1HNMR(DMSO，400MHz)δ2.62-2.67(m，2H)，2.88(t，2H)，
7.18-7.24(m，2H)，7.29-7.34(m，3H)，7.42-7.53(m，4H)，7.64(t，1H)，7.72(t，1H)，7.82(t，
1H)，8.03-8.06(m，2H)，8.12(s，1H)，8.19(s，1H)，11.31(s，1H)，11.93(s，1H)；MS(ESI)m/z
490.2[M+1]+。
[0117] 实施例164-(苯乙叉基)肼甲酰基-喹啉-2-甲醛-(3-三氟甲基)苯腙(化合物IA-11)的制备
[0118]

[0119]除了将4-磺酰胺基苯肼替换成3-三氟甲基苯肼，将3-羟基苯甲醛替换成苯乙醛之外，其余所需原料、试剂及制备方法同实施例4，5和6，制得化合物IA-11，黄色固体80毫克，收率66％。Mp＞300℃；1HNMR(DMSO，400MHz)δ3.69(d，2H)，7.17(d，2H)，7.31-7.38(m，
4H)，7.44(s，1H)，7.51-7.54(m，2H)，7.64(t，1H)，7.77-7.83(m，2H)，8.04-8.08(m，2H)，
8.11(s，1H)，8.22(s，1H)，11.29(s，1H)，11.97(s，1H)；MS(ESI)m/z476.2[M+1]+。
[0120] 实施例174-(苯丙烯叉基)肼甲酰基-喹啉-2-甲醛-(3-三氟甲基)苯腙(化合物IA-12)的制备
[0121]

[0122]除了将4-磺酰胺基苯肼替换成3-三氟甲基苯肼之外，将3-羟基苯甲醛替换成苯丙烯醛之外，其余所需原料、试剂及制备方法同实施例4，5和6，制得化合物IA-12，黄色固体87毫克，收率49％。Mp＞300℃；1HNMR(DMSO，400MHz)δ7.13(t，2H)，7.40-7.58(m，6H)，
7.66(d，2H)，7.76-7.85(m，2H)，8.06-8.18(m，5H)，8.28(s，1H)，11.32(s，1H)，12.19(s，
1H)；MS(ESI)m/z488.2[M+1]+。
[0123]实施例184-(苯丙烯叉基)肼甲酰基-喹啉-2-甲醛-(3-硝基)苯腙(化合物
IA-13)的制备
[0124]

[0125] 除了将4-磺酰胺基苯肼替换成3-硝基苯肼之外，将3-羟基苯甲醛替换成苯丙烯醛之外，其余所需原料、试剂及制备方法同实施例4，5和6，制得化合物IA-13，黄色固体
27毫克，收率39％。Mp＞300℃；1HNMR(DMSO，400MHz)δ7.13(t，1H)，7.25-7.43(m，8H)，
7.62-7.82(m，5H)，8.05-8.19(m，3H)，8.46(t，1H)，11.35(s，1H)，12.24(s，1H)；MS(ESI)m/
z465.2[M+1]+。
[0126] 实施例192-甲酰基-喹啉-4-甲酸(中间体VII)的制备
[0127]

[0128]将2-甲基-喹啉-4-甲酸乙酯(中间体III)替换成2-甲基-喹啉-4-甲酸(中间体II)，其余所需原料、试剂及制备方法同实施例3，得2-甲酰基-喹啉-4-甲酸(中间体VII)，为黄色固体223毫克，收率56％。1HNMR(DMSO，400MHz)δ7.93(t，1H)，8.00(t，1H)，
8.32(s，1H)，8.33(d，1H)，8.82(d，1H)，10.16(s，1H)。
[0129] 实施例20N-苯丙基-2-甲酰基-喹啉-4-甲酰胺(中间体VIII)的制备
[0130]

[0131] 氮气保护下，将75毫克2-甲酰基-喹啉-4-甲酸(中间体VII)投入二氯甲烷中，加入216毫克EDCI和203毫克HOBt，反应液于0℃搅拌一小时。再加入0.08毫升苯丙胺和0.4毫升三乙胺，反应过夜。加水萃取，有机相依次用稀盐酸、水、盐水洗，干燥，浓缩，残余固体经硅胶柱层析分离，得到N-苯丙基-2-甲酰基-喹啉-4-甲酰胺(中间体VIII)，收率70％。1HNMR(CDCl，400MHz)：δ2.07(t，2H)，2.79(t，2H)，3.62(t，2H)，7.23-7.32(m，
5H)，7.77(t，1H)，7.88(t，1H)，7.96(s，1H)，8.29(d，1H)，8.36(d，1H)，10.23(s，1H).
[0132]实施例214-(苯丙基)氨甲酰基-喹啉-2-甲醛-(4-氨磺酰基)苯腙(化合物
IB-1)的制备
[0133]

[0134]除了将2-甲酰基-喹啉-4-甲酸乙酯(中间体IV)替换成N-苯丙基-2-甲酰基-喹啉-4-甲酰胺(中间体VIII)之外，其余所需原料、试剂及制备方法同实施例4，得标题化合物，黄色固体50毫克，收率81％。Mp＞300℃；1HNMR(DMSO，400MHz)δ1.93(t，2H)，
2.73(t，2H)，3.40-3.44(m，2H)，7.20-7.39(m，7H)，7.70(t，1H)，7.75(d，2H)，7.88(t，1H)，
8.11(t，2H)，8.24(d，2H)，9.01(t，1H)，11.81(s，1H)；MS(ESI)m/z488.2[M+1]+。
[0135]实施例224-(苯丙基)氨甲酰基-喹啉-2-甲醛-(3-溴)苯腙(化合物IB-2)
的制备
[0136]

[0137]除了将2-甲酰基-喹啉-4-甲酸乙酯(中间体IV)替换成N-苯丙基-2-甲酰基-喹啉-4-甲酰胺(中间体VIII)，将4-氨磺酰基苯肼替换成3-溴苯肼之外，其余所需原料、试剂及制备方法同实施例4，得标题化合物，黄色固体28毫克，收率51％。Mp
＞300℃；1HNMR(DMSO，400MHz)δ1.93(t，2H)，2.72(t，2H)，3.40-3.45(m，2H)，7.11(d，
1H)，7.20-7.33(m，7H)，7.54(s，1H)，7.74(t，1H)，7.94(t，1H)，8.14(d，1H)，8.20(d，1H)，
8.31(s，2H)，9.10(t，1H)，12.10(s，1H)；MS(ESI)m/z487.2[M+1]+。
[0138]实施例234-(苯丙基)氨甲酰基-喹啉-2-甲醛-(3-氯)苯腙(化合物IB-3)
的制备
[0139]

[0140]除了将2-甲酰基-喹啉-4-甲酸乙酯(中间体IV)替换成N-苯丙基-2-甲酰基-喹啉-4-甲酰胺(中间体VIII)，将4-氨磺酰基苯肼替换成3-氯苯肼之外，其余所需原料、试剂及制备方法同实施例4，得标题化合物，黄色固体30毫克，收率94％。Mp
＞300℃；1HNMR(DMSO，400MHz)δ1.91(m，2H)，2.73(t，2H)，3.40-3.45(m，2H)，6.97(d，
1H)，7.20-7.35(m，6H)，7.40(s，1H)，7.73(t，1H)，7.92(t，1H)，8.13(d，1H)，8.18(d，1H)，
8.29(d，2H)，9.08(t，1H)，11.98(s，1H)；MS(ESI)m/z443.2[M+1]+。
[0141]实施例244-(苯丙基)氨甲酰基-喹啉-2-甲醛-(3-羧基)苯腙(化合物IB-4)
的制备
[0142]

[0143]除了将2-甲酰基-喹啉-4-甲酸乙酯(中间体IV)替换成N-苯丙基-2-甲酰基-喹啉-4-甲酰胺(中间体VIII)，将4-氨磺酰基苯肼替换成3-羧基苯肼之外，其余所需原料、试剂及制备方法同实施例4，得标题化合物，黄色固体20毫克，收率90％。Mp＞
300℃；1HNMR(DMSO，400MHz)δ1.92(t，2H)，2.72(t，2H)，3.38-3.43(m，2H)，7.21-7.50(m，
8H)，7.62(t，1H)，7.72(s，1H)，7.79(t，1H)，8.01-8.09(m，4H)，8.95(t，1H)，11.18(s，1H)；
MS(ESI)m/z453.2[M+1]+。
[0144]实施例254-(苯丁基)氨甲酰基-喹啉-2-甲醛-(4-氨磺酰基)苯腙(化合物
IB-5)的制备
[0145]

[0146]除了将苯丙胺替换成苯丁胺之外，其余所需原料、试剂及制备方法同实施例20和4，得标题化合物，黄色固体56毫克，收率87％。Mp＞300℃；1HNMR(DMSO，400MHz)δ1.63-1.73(m，4H)，2.67(t，2H)，3.41-3.45(m，2H)，7.18-7.31(m，5H)，7.39(d，2H)，
7.69(t，1H)，7.76(d，2H)，7.90(t，1H)，8.07(d，1H)，8.15(d，1H)，8.22(s，1H)，8.30(s，1H)，
8.99(t，1H)，11.98(s，1H)；MS(ESI)m/z502.3[M+1]+。
[0147]实施例264-(苯丁基)氨甲酰基-喹啉-2-甲醛-(3-氯)苯腙(化合物IB-6)
的制备
[0148]

[0149] 除了将苯丙胺替换成苯丁胺，将4-氨磺酰基苯肼替换成3-氯苯肼之外，其余所需原料、试剂及制备方法同实施例20和4，得标题化合物，黄色固体76毫克，收率89％。Mp＞
300℃；1HNMR(DMSO，400MHz)δ1.64-1.71(m，4H)，2.67(t，2H)，3.41-3.46(m，2H)，7.01(d，
1H)，7.15-7.36(m，7H)，7.44(s，1H)，7.74(t，1H)，7.97(t，1H)，8.10(d，1H)，8.24(d，1H)，
8.34(s，1H)，8.37(s，1H)，9.11(t，1H)，12.35(s，1H)；MS(ESI)m/z457.3[M+1]+。
[0150]实施例274-(苯丁基)氨甲酰基-喹啉-2-甲醛-(3-溴)苯腙(化合物IB-7)
的制备
[0151]

[0152] 除了将苯丙胺替换成苯丁胺，将4-氨磺酰基苯肼替换成3-溴苯肼之外，其余所需原料、试剂及制备方法同实施例20和4，得标题化合物，黄色固体88毫克，收率79％。Mp＞
300℃；1HNMR(DMSO，400MHz)δ1.63-1.70(m，4H)，2.67(t，2H)，3.41(t，2H)，7.17-7.28(m，
5H)，7.38-7.48(m，3H)，7.59(t，1H)，7.73(s，1H)，7.78(t，1H)，8.01-8.08(m，4H)，8.93(t，
1H)，11.21(s，1H)；MS(ESI)m/z501.3[M+1]+。
[0153]实施例284-(苯丁基)氨甲酰基-喹啉-2-甲醛-(3-羧基)苯腙(化合物IB-8)
的制备
[0154]

[0155] 除了将苯丙胺替换成苯丁胺，将4-氨磺酰基苯肼替换成3-羧基苯肼之外，其余所需原料、试剂及制备方法同实施例20和4，得标题化合物，黄色固体68毫克，收率
79％。Mp＞300℃；1HNMR(DMSO，400MHz)δ1.62-1.71(m，4H)，2.67(t，2H)，3.42-3.44(m，
2H)，7.11-7.28(m，8H)，7.54(s，1H)，7.72(t，1H)，7.94(t，1H)，8.09(d，1H)，8.19(d，1H)，
8.28(s，2H)，9.07(t，1H)，12.09(s，1H)；MS(ESI)m/z467.4[M+1]+。
[0156]实验实施例生物学活性的测试
[0157]实施例1本发明部分化合物对NS2B-NS3蛋白酶半数有效抑制浓度(IC50)的测定
[0158](1)NS2B-NS3蛋白酶的表达与纯化
[0159]将含有NS2B-Gly-NS3pro181基因的pET28载体(购自Novagen)转入大肠杆菌BL21(DE3)(购自Novagen)中，37℃培养至OD600＝0.6-1.0时，加入0.1-1.0mM异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)(购自上海生工生物工程有限公司)诱导2-6小时后，4℃下5000rpm离心10分钟收菌。加入35mL细胞裂解液重悬菌体，冰浴上超声破碎30分钟。
4℃，12000rpm离心30分钟收集上清液，通过Ni-NTA镍亲和柱(HisTrapTMHP5ml；购自GEHealthcare)纯化目标蛋白，先用缓冲液A(10-30mM咪唑，50-200mMNaCl，20mMTris/HCl，pH7.0-9.0)将杂蛋白洗脱掉，然后使用缓冲液B(200-400mM咪唑，50-200mMNaCl，
20mMTris-HCl，pH7.0-9.0)梯度洗脱将目标蛋白洗脱下来，并将目标蛋白透析除盐至
20mMTris-HCl、pH7.0-9.0的溶液中，蛋白纯度通过SDS-PAGE电泳(Mini-PROTEANTetraSystem：购自BIO-RAD)检测超过90％。利用280nm紫外吸收法(GeneQuant100，购自GEHealthcare)测定蛋白质浓度。
[0160] (2)本发明化合物对NS2B-NS3蛋白酶抑制活性的测定
[0161] 向50-200μL的缓冲液(50mMTris-C1，0.5-1mMCHAPS，10-20％甘油，pH
7.0-9.0)体系中加入NS2B-NS3蛋白(终浓度0.05-0.1μM)和溶于DMSO(二甲基亚砜)的待测化合物溶液(终浓度为20-60μM)，室温下孵育15分钟后加入一个8肽(4-[4-(二甲基氨基)苯偶氮]苯甲酰-赖-谷-精-精-甘-精-异-谷-5-(2-氨乙基氨)-1-萘磺酸，Dabcyl-KQRRGRIE-Edans，购自吉尔生化上海有限公司)荧光底物(最终浓度5-15μM)。酶反应动力学在SpectraMaxFlexStation3(MolecularDevice，US.)荧光分光光度计中连续测30分钟，激发波长340nm，发射波长480nm，选取前10分钟的荧光变化值计算反应初速率，单位为RFU/min。根据不同浓度化合物存在条件下，NS2B-NS3蛋白酶酶切荧光底物的反应初速度，与未加化合物抑制剂的1％DMSO的反应初速度进行比较，计算得到各浓度下的抑制率。即含1％DMSO条件下的酶活性为100％，抑制百分率为100％减去不同浓度抑制剂下酶的相对活性乘以100％。以下列公式计算待测化合物在50μM下抑制百分率：[0162] 计算公式为：抑制百分率＝(对照组值-实验组值)/对照组值×100％
[0163] (3)本发明化合物对NS2B-NS3蛋白酶半数有效抑制浓度(IC50)的测定
[0164] 选取50μM抑制率在50％以上的化合物测IC50，选择合适的化合物浓度梯度
(待测化合物浓度范围为：0.4～500μM)。酶反应动力学在SpectraMaxFlexStation
3(MolecularDevice，U.S.)荧光分光光度计中连续测30min，激发波长340nm，发射波长
480nm，选取前10min的荧光变化值计算反应初速率，单位为RFU/min。根据不同浓度化合物存在条件下，NS2B-NS3蛋白酶酶切荧光底物的反应速度，与未加化合物抑制剂1％DMSO的反应速度进行比较，计算得到各浓度下的抑制率。即含1％DMSO条件下的酶活性为100％，抑制百分率为100％减去不同浓度抑制剂下酶的相对活性乘以100％。根据Logistic公式用IC50值在GraphPadPrism5中计算得到待测化合物对NS2B-NS3蛋白酶活性抑制的IC50值。公式如下：
[0165]
[0166] 上述公式中，A0指加1％DMSO时的酶活性，A(I)指化合物在I浓度下的酶活性，I
指待测化合物的浓度，p指μ因子。
[0167] 表1为部分取代喹啉-2-甲醛-苯腙类化合物对NS2B-NS3酶活抑制IC50值。
[0168] 表1
[0169]
[0170]由表1可以看出，本发明的具有结构通式1的部分取代喹啉-2-甲醛-苯腙类化
合物具有微摩级的NS2B-NS3蛋白酶抑制活性，说明本发明的化合物为NS2B-NS3蛋白酶抑制剂。
[0171]化合物IA-1、IA-2、IA-4、IA-5、IA-6、IA-9、IA-11、IA-13和IB-8对NS2B-NS3酶活抑制的量效曲线图见图1～图9。由量效曲线图可以看出，该类化合物对NS2B-NS3酶的抑制活性具有较好的浓度依赖性。
[0172]实施例2本发明部分化合物抗登革病毒(Replicon)活性(IC50)的测定
[0173](1)登革复制子转染细胞培养
[0174]转染了本实验室构建的登革病毒的亚复制子的细胞株(Denguevirusreplicon)，在细胞培养中能稳定复制登革病毒。登革病毒亚复制子(replicon)转染细胞在含10％胎牛血清(hyclone产品)和嘌呤霉素(sigma-aldrich公司)的DMEM培养基(Gibico公司)中培养，以1∶3～1∶5的比例，3-4天一次规律传代。将转染细胞接种于96孔板中，37℃，5％CO2培养24小时。
[0175](2)本发明部分化合物抗登革病毒(Replicon)活性(IC50)的测定
[0176] 在抗病毒药物的干预下，检测细胞中登革复制子的含量，参照未加药对照组的含量，化学荧光酶标仪检测相对发光强度，可以反映化合物的抗登革病毒活性。在上述登革病毒亚复制子细胞中依次加入100μM、25μM、6.25μM、1.56μM、0.391μM、0.098μM浓度的待测化合物样品，每个浓度设复孔，并设无样品对照孔，继续培养72小时。将细胞裂解，加入荧光素酶底物，应用Bright-GloTM明亮萤光素酶检测系统(Bright-GloTMLuciferaseAssaySystem)，在荧光酶标仪上，读取相对发光强度(RLU)，按下列公式，计算出每个浓度下待测化合物的抗登革病毒活性的抑制率。根据实验结果计算出IC50值(50％inhibitoryconcentration)，即指具有50％抑制效应时的化合物浓度。
[0177]

[0178]表2为部分取代喹啉-2-甲醛-苯腙类化合物的抗登革病毒活性的IC50值。
[0179]表2
[0180]
[0181]由表2可以看出，本发明的具有结构通式1的部分职代喹啉-2-甲醛-苯腙类化
合物具有微摩级的抗登革病毒(Replicon)复制抑制活性，说明本发明的化合物可以发展为抗登革病毒药物。
[0182]产业上利用的可能性
[0183]本发明的取代喹啉-2-甲醛-苯腙类化合物的制备方法具有反应条件温和、原料丰富易得、操作及后处理简单等优点，且本发明的化合物毒性很低。
[0184]本发明的取代喹啉-2-甲醛-苯腙类化合物在NS2B-NS3蛋白酶抑制试验和抗登革病毒亚复制子实验中均显示了阳性结果。应证了其药理作用机制。因此，本发明的化合物作为NS2B-NS3酶抑制剂，具有抑制病毒复制的能力，可发展为抗登革病毒的预防及治疗药物。