土党参多糖、衍生物及其制备方法和应用 技术领域：本发明涉及一种土党参多糖、衍生物及其制备方法和应用；属于药品及保健食品的技术领域。
背景技术：多糖为公认的具有调节机体免疫功能的大分子物质，其作用表现为多途径、多环节、多靶点性。研究表明活性多糖不是单独作用于免疫系统，具有调节神经-内分泌-免疫调节网络(NIM)的平衡。在神经、内分泌与免疫系统之间有一个多种神经递质、激素和免疫活性物质构成的完整调节环路，三者相互影响，共同维持体内环境的恒定，其中免疫系统则是这种整体调节的重要组成部分。
中药活性多糖(Polysacharides)对机体特异性免疫与非特异性免疫、细胞免疫与体液免疫都有广泛的影响，促进和恢复机体免疫机能作用极其明显。多糖作为生物效应调节剂(BRM)，主要对机体的网状内皮系统(RES)、巨噬细胞(MΦ)、淋巴细胞、白细胞、NK细胞、补体系统以及RNA、DNA、蛋白质的合成和体内的cAMP、cGMP的含量高低产生影响，最终可以促进抗体的生成，使淋巴因子及干扰素的诱生增强，从而达到抗菌、抗病毒、抗寄生虫、抗肿瘤、抗辐射、抗衰老等作用效果(聂伟，张永祥，多糖的免疫调节作用及其作用机制研究进展，中国药理学通报，1999，15(6)：484～7；李杰，张楚菁，中药多糖的免疫调节及抗肿瘤近年研究概述，天津药学，2003，15(6)：62-4)。
已经分离到的天然多糖有100多种，但应用于临床的只有几种，对质量稳定、疗效确切、毒性和不良反应小的多糖地开发，特别是作为药物来应用，意义重大。根据糖类生物学特性的研究结果，有人曾预言，多糖药物有可能对治疗老年痴呆症有效(Thomas.WR，CurrentOpinioninBiotechnology，1998，9：74-79)。神经生长因子是最有希望发展成为抗老年痴呆症的药物，从中药中寻找具有神经生长因子作用的多糖，具有发展成为预防和治疗老年痴呆症药物的潜力。
中药活性多糖对神经细胞有作用的研究报道很少，已有专利报道夹竹桃花多糖具有神经生长因作用(中国专利，申请号：99125746，公开号CN 1301774，发明名称：夹竹桃多糖及其衍生物、制备方法及其应用)；另外，南沙参多糖可改善东莨菪碱所致大鼠学习记忆障碍(张春梅，李新芳，南沙参多糖可改善东莨菪碱所致大鼠学习记忆障碍的研究，中国药理与临床，1002，17(6)：19-21)。
发明内容：我们在开展民族药中具有神经营养作用的物质研究时从众多植物中筛选出黔产药食兼用植物土党参(金钱豹属植物金钱豹，Campanumoeajavanica Bl.)多糖具有神经生长因子作用，即对神经细胞具有促生长和分化作用，能修复神经细胞损的功能。
为此，本发明是为了达到以下目的：
1)提供一种具有神经生长因子作用的土党参多糖及其衍生物。
2)提供这种土党参多糖的制备方法和途径，它是由土党参的块根中提取、分离、纯化而得。
3)提供土党参多糖的衍生物的制备方法：土党参多糖经硫酸化和羧甲基化而得。
4)提供土党参多糖在药物中的应用：预防和治疗老年痴呆症、中风、儿童智力低下、记忆功能障碍和减退等疾病。
5)提供土党参多糖在保健食品中的应用：改善记忆功能障碍，促进或提高学习记忆，作为脑保护剂。
本发明是这样构成的：土党参多糖及衍生物的制备方法：从药食兼用植物土党参中提取、分离和精制得到的粗多糖，以及组成它的CPJ-1和CPJ-2两种纯多糖物质。具体的制备方法是，由土党参的块根提取分离土党参多糖，其步骤如下：a.粗多糖的提取制备：将土党参的块根用酒精回流除杂、石油醚脱脂后，经蒸馏水热提，提取物除去蛋白、脱色后再醇沉后可得土党参粗多糖。b.多糖的纯化和精制：将步骤a中提取制备得到的粗多糖经DEAE纤维素柱层析以及SepharoseCL-6B和Sephadex G-25凝胶柱层析后得土党参多糖的纯物质CPJ-1和CPJ-2。本发明中，将得到的土党参多糖进行磺酸化和羧甲基化，从而得到土党参多糖的衍生物。
所述土党参多糖及其衍生物对神经细胞有明显的促生长、分化作用和能明显修复损伤的神经细胞功能。
所述土党参多糖及其衍生物的应用：将土党参多糖及其衍生物制备成适宜的给药剂型，应用在制备预防和治疗神经退行性疾病如老年痴呆症、学习记忆障碍、儿童智力低下、中风等疾病的药物中。
所述土党参多糖及其衍生物的应用还可以是：将土党参多糖及其衍生物应用在制备改善记忆功能障碍，促进或提高学习记忆，作为脑保护剂的保健食品中。
本发明中：(1)具有神经生长因子作用的土党参多糖及其衍生物，包括土党参粗多糖、纯多糖组份及其硫酸化和羧甲基化物。
(2)土党参多糖的制备方法和途径。从土党参(桔梗科金钱豹属植物金钱豹Campanumoeajavanica Bl.)的块根提取、除蛋白、脱色后再醇沉后可得土党参粗多糖，再对粗多糖经分离、DEAE纤维素柱层析以及SepharoseCL-6B和Sephadex G-25凝胶柱层析分离纯化克的纯多糖组份。
(3)将土党参多糖经硫酸化和羧甲基化后可得其相应衍生物。
(4)将土党参多糖及其衍生物应用在预防和治疗老年痴呆症、中风、儿童智力低下、记忆功能障碍和减退等疾病的药物中。其服用方式可以是口服、静脉注射、输液等，可以是片剂、胶囊、粉针、注射液、大输液等适宜的给药剂型，其中也可使用惰性辅加剂和赋形剂。其他应用方法可以是现行的常规方法。
(5)土党参多糖及其衍生物在保健食品中的应用：改善记忆功能障碍，促进或提高学习记忆，作为脑保护剂。其服用方式可以是口服或其他现行的方法。
为了达到更佳的效果，本发明优选如下技术方案：
一、土党参多糖的制备方法
土党参多糖来源于黔产金钱豹属植物金钱豹(也可以是其它产地)的块根，其制备步骤如下：
1、提取和分离：将土党参的块根用酒精回流除杂、石油醚脱脂后，经蒸馏水热提，过滤，浓缩，除蛋白、脱色后再经醇沉，可得土党参出多糖(详见图1)。
2、多糖的纯化和精制：将步骤1中提取制备得到的粗多糖进行二乙氨基乙基纤维素(DEAE)柱层析，先经蒸馏水洗脱，再经0.1mol/LNaCl溶液洗脱。蒸馏水洗脱部分经浓缩、透析、醇沉后过滤得粉末A；NaCl溶液洗脱部分经浓缩、透析、醇沉后过滤得粉末B。粉末A和粉末B经SepharoseCL-6B和Sephadex G-25凝胶柱层析后分别得到土党参多糖纯组份，命名为CJP-1和CJP-2(详见图2)。
二、多糖组份的纯度、理化性质、光谱分析、气相色谱分析和分子量
多糖组份CJP-1和CJP-2经常规方法如全甲基化，全水解，分子量测定，核磁共振，红外光谱等化学和光谱方法证明为多糖结构。
(1)多糖组份纯度的确证：
将上述获得的土党参多糖组份CJP-1和CJP-2以0.2mol/LNaCl溶液为流动相，流速为0.52ml/min经Sepharose CL-6B凝胶柱层析进行纯度分析，测得多糖组份CJP-1和CJP-2均为单一对成峰，故CJP-1和CJP-2为单一纯品。
(2)土党参多糖组份的理化性质
CJP-1为白色结晶，坚硬，易吸潮。不易溶于冷水，易溶于热水，不溶于高浓度乙醇、丙酮、正丁醇等有机溶剂，完全溶解后水溶液呈透明状。碘—碘化钾反应呈阴性，说明不含淀粉，硫酸苯酚反应呈阳性，表示有糖存在。
CJP-2为白色粉末状固体，易吸潮，不易溶于冷水，极易溶于热水，不溶于高浓度乙醇、丙酮、正丁醇等有机溶剂；完全溶解后水溶液呈半透明状，碘—碘化钾反应呈阴性，说明无淀粉存在，硫酸苯酚反应呈阳性，表示有糖存在。
(3)紫外光谱和红外光谱分析
紫外光谱分析，水溶液在200～400nm区间进行扫描；红外光谱分析，取样品1mg，KBr压片，在450～4000cm-1区间进行红外扫描。
结果：红外光谱显示，两种土党参多糖CJP-1、CJP-2分别在3386cm-1、3395cm-1出现的宽峰为OH的伸缩振动，在1030cm-1、1032cm-1处出现吸收峰为C-O伸缩振动；在2929cm-1和2927cm-1处出现的吸收峰为C-H吸收峰，在874cm-1和818cm-1处均有特征吸收，说明存在甘露糖苷；紫外光谱显示190～400nm紫外区两种多糖均未见明显的吸收峰。
(4)气相色谱分析
将多糖经三氟醋酸水解法水解后，用硼氢化钠还原，吡啶和醋酐乙酰化后进行气相色谱测定。
结果：通过标准单糖气相色谱图的保留时间可知：CJP-1单糖组成为半乳糖、甘露糖、葡萄糖，它们的摩尔比为1∶3.1∶6.4；CJP-2单糖组成为木糖、鼠李糖、阿拉伯糖、甘露糖、半乳糖、葡萄糖，它们的摩尔比为1∶1.6∶3.7∶1.7∶6.4∶14.0。
(5)多糖组份分子量的测定
色谱柱为AgilentPLaquagel-OHMIXED8μm，7.5×300mm，流动相为0.2mol/L的醋酸盐缓冲液，流速为1.0ml/min，多糖分子量标准为Pullulan系列。通过标准品的保留时间对已知标准分子量的对数作图得到的标准曲线。对土党参多糖的分保留时间的测定，从标准曲线可求得相应分子量，即CJP-1为3923，CJP-2为7215。
三、土党参多糖衍生物的制备
1、土党参多糖的硫酸化：在室温条件下，无水吡啶中，单一纯多糖与氯磺酸反应后，经碱中和，透析、冻干可得硫酸化土党参多糖。
2、土党参多糖的羧甲基化：在NaOH水溶液中，单一纯多糖与氯乙酸反应后，经酸中和，透析、冻干可得硫酸化土党参多糖。
四、土党参粗多糖、多糖纯组份CJP-1和CJP-2的神经生长因子活性
对通过本发明的技术方法获得的土党参多糖进行生物活性测试。
(1)方法：
取传5代以上PC12细胞，经胰蛋白酶消化分散后，制成2×105个细胞/ml密度的细胞悬液，接种于涂有小牛皮胶的35mm塑料培养皿中，每皿2ml，置于36℃、含10％CO2的培养箱内进行培养。培养液由85％DMEM、5％胎牛马血清、10％马血清、谷氨酰胺0.10g/L组成。并按实验分为对照组和药物组(药物浓度20μg/ml、10μg/ml和5μg/ml)各组。培养第8天。取出培养的各组PC12细胞，在倒置相差显微镜下分别观察PC12细胞的生长和分化情况(±表示对PC12细胞有弱的促分化作用，+表示明显促分化作用，++表示显著促分化作用，+++表示非常明显促分化作用，-表示无作用)。
(2)结果：通过对神经细胞(PC12细胞)的促分化作用活性研究发现，依据本发明提供的技术获得的土党参粗多糖具有一定的促PC12细胞分化作用，当经粗多糖进一步纯化，制备得到的纯多糖组份CJP-l和CJP-2对PC12细胞有显著的促生长、分化作用，能促进神经突轴的生长，在浓度10μg/ml时即能诱导神经节的延伸(图3)。此作用与神经生长因子的作用类似，至少相当于神经生长因子。(结果见表1)。
表1对PC12细胞促分化作用观察组别 药物浓度(μg/ml) 促分化作用 备注NGF组 20ng/ml +++实验例1 20 ± 粗多糖 10 - 5 -实验例2 20 + CJP-1 15 + 10 + 5 ±实验例3 20 + CJP-2 15 + 10 ± 5 -
通过一系列实验证明：本发明提供的土党参多糖对神经细胞具有神经生长因子作用，也可对H2O2等化学物质引起的神经细胞损伤具有保护和修复作用。本发明提供的土党参多糖可应用在制备预防和治疗神经退行性疾病如老年痴呆症、学习记忆障碍、儿童智力低下、中风等疾病的药物和在改善记忆功能障碍，促进或提高学习记忆，作为脑保护剂的保健食品中。土党参多糖还可作为阳性对照物(试剂)用于神经细胞的生长、分化和损伤修复相关的实验中。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
1)本发明提供的土党参多糖和衍生物为新的、未报道过的活性多糖。
2)本发明提供的提取、分离、纯化土党参多糖的工艺，可以根据需要选择黔产原料或其它地方产的原料，很方便地制备所需要的多糖产品。
3)本发明提供的土党参多糖精制方法，切实可行，操着简单易行，适于扩大规模，易于实现产业化的目的。
4)本发明提供的土党参多糖，对神经细胞(PC12细胞)具有神经生长因子作用，此研究结果尚未见报道。土党参多糖可应用在制备预防和治疗神经退行性疾病如老年痴呆症、学习记忆障碍、儿童智力低下、中风等疾病的药物和在改善记忆功能障碍，促进或提高学习记忆，作为脑保护剂的保健食品中。
附图说明：附图1：土党参粗多糖制备工艺流程图；附图2：土党参纯组份CJP-1和CJP-2的制备工艺流程图；附图3：土党参纯组份CJP-1和CJP-2的促PC12细胞的分化作用示意图。
具体实施方式：
本发明的实施例1：土党参粗多糖的制备
将以95％乙醇加热回流后的土党参粉渣60℃干燥2h，称取200g置圆底烧瓶中，加石油醚500ml，60～90℃回流1h以脱脂，过滤，石油醚回收。滤渣除尽溶剂，然后过滤，药渣加蒸馏水1000ml浸1h后，90℃温浸提取40min，过滤，再用500ml蒸馏水70℃温浸60min，过滤，合并滤液，减压浓缩至150ml，用Sevag法萃取以除去蛋白质。加1％活性碳脱色2次，抽滤，滤液加95％乙醇使含醇量达80％，冰箱静置过夜。过滤，残渣先后用95％乙醇，无水乙醇、乙醚、丙酮依次多次洗涤，60℃烘干，即得精制土党参多糖(50g)。
本发明的实施例2：纯多糖组份CJP-1的制备
取粗多糖5.0g，溶于120ml蒸馏水中，进行DEAE纤维素柱层析，流速1ml/min，先以蒸馏水进行洗脱，直至无洗脱峰为止。然后以1mol/LNaCl为上限溶液进行梯度洗脱至无洗脱峰出现为止。洗脱液以苯酚硫酸试剂显色后测吸光度。依吸光度对洗脱液体积作图，得到洗脱曲线。共出现2个主峰，分别收集单一峰，浓缩后透析、用无水乙醇沉淀，离心干燥后得白色粉末状的1JP-1和CJP-2较纯品。
取500mg较纯品CJP-1，进行Sepharose CL-6B凝胶柱层析(上样体积30ml，流速0.52ml/min)，以0.2mol/LNaCl溶液进行洗脱，自动收集仪收集，得纯品CJP-1(苯酚硫酸法检测，得一对称单峰)。
本发明的实施例3：纯多糖组份CJP-2的制备
依据实施例2中的方法得到较纯品CJP-2，取200mg较纯品CJP-2，进行SepharoseCL-6B凝胶柱层析(上样体积15ml，流速0.52ml/min)，以0.2mol/LNaCl溶液进行洗脱，自动收集仪收集，得纯品CJP-2(苯酚硫酸法检测，得一对称单峰)。
本发明的实施例4：将土党参多糖或其衍生物配以常规的、适当的辅料，制备成片剂、胶囊、粉针、注射液或大输液制剂等适宜的给药剂型，应用在预防和治疗老年痴呆症、中风、儿童智力低下、记忆功能障碍和减退等疾病的治疗、预防中。
本发明的实施例5： 取土党参多糖或其衍生物，作为食品添加剂，形成改善记忆功能障碍、促进或提高学习记忆的保健食品，达到保护脑功能的作用。