多功能抗癌重组腺病毒.pdf

本发明提供了一种重组腺病毒，其特征在于该病毒同时灭活能够与细胞内功能性肿瘤抑制基因p53结合的病毒蛋白和能够抑制细胞凋亡的病毒蛋白，并携带一组由外源性启动子驱动的外源性基因。这种重组腺病毒能够在P53功能缺陷型和/或P53功能正常型的肿瘤细胞内大量复制繁殖，产生细胞致病效应(CPE)，并能在肿瘤细胞内高效表达外源性抗肿瘤蛋白，最终杀死肿瘤细胞，而对P53功能正常型的非肿瘤细胞基本无杀伤作用。

1.  一种重组腺病毒，其特征在于该病毒同时灭活能够与细胞内功能性肿瘤抑制基因p53结合的病毒蛋白和能够抑制细胞凋亡的病毒蛋白，并携带一组由外源性启动子驱动的外源性基因。

2.  权利要求1中所述的重组腺病毒，其特征在于其中所述病毒被灭活的病毒蛋白为E1B 19K蛋白和E1B 55K蛋白。

3.  权利要求1中所述的重组腺病毒，其中所述外源性启动子为外源性病毒类启动子。

4.  权利要求1或2中所述的重组腺病毒，其特征在于其中所述病毒可在P53功能缺陷型和/或P53功能正常型肿瘤细胞内大量复制繁殖，产生细胞致病效应(CPE)，高效表达外源性蛋白，并杀死肿瘤细胞，而对P53功能正常型的非肿瘤细胞基本无杀伤作用。

5.  权利要求1或2中所述的重组腺病毒，其特征在于其中所述病毒通过缺失突变灭活该病毒的E1B 19K和E1B 55K蛋白，缺失部分包括E1B启动子序列，E1B 19k基因序列和E1B 55K基因序列。

6.  权利要求5中所述的重组腺病毒，其中所述病毒通过缺失突变灭活该病毒的E1B 19K和E1B 55K蛋白，缺失部分包括nt 1651至2591的DNA序列。

7.  权利要求1或2中所述的重组腺病毒，其中所述外源性基因所编码的蛋白为细胞因子，细胞自杀基因产物，细胞周期调控蛋白，细胞凋亡诱导蛋白。

8.  权利要求1～7中任意一项所述的重组腺病毒，其中所述病毒含有E3基因。

9.  药物组合物，该组合物含有杀死肿瘤细胞有效量的权利要求1～8中任意一项所述的重组腺病毒和化疗药物。

多功能抗癌重组腺病毒
技术领域
本发明属于抗癌领域，描述一种多功能抗癌重组腺病毒。这种重组腺病毒能选择性地在P53功能缺陷型和/或P53功能正常型的肿瘤细胞内复制、繁殖，高效表达外源性抗肿瘤蛋白，并杀死肿瘤细胞，而在非肿瘤细胞内基本上是非复制型的。本发明还提出了应用这种重组腺病毒治疗、预防肿瘤的方法。
背景技术
恶性肿瘤是严重危害人类健康与生命的常见多发病。全世界每年癌症的新发病人数超过1000万(癌症患者人数超过4000万)。癌症已超过心脑血管疾病而成为人类致死的第一位原因。目前对恶性肿瘤的常规治疗仍以手术，放疗及化疗为主，这种常规治疗对极大多数肿瘤的治疗效果很不理想。而对极大多数化疗药物而言，其治疗指数仍较低，即其治疗剂量与毒性剂量较为接近。故化疗的治疗方案通常伴有明显的毒性作用，包括危及生命的骨髓抑制，脱发等。因此选择性的杀伤肿瘤细胞而不影响正常细胞的治疗方案对肿瘤治疗非常重要。
肿瘤基因治疗是近年兴起的治疗恶性肿瘤方案的一种新方法。基因转染方法可分为病毒法与非病毒法两种。病毒法通常采用逆转录病毒，腺病毒，腺相关病毒，单纯疮疹病毒及痘病毒。逆转录病毒在体外具有较高的转染率，但病毒滴度偏底，在体内转染率较低，而且只能感染分裂期的细胞，同时具有整合至染色体内，存在癌变的可能性的缺点。非病毒法包括脂质体及基因枪等方法，其转染基因表达时间较短，转染率较低。
腺病毒是目前肿瘤基因治疗中最常见的病毒载体，已广泛地应用于人体的基因治疗方案中，它在体内及体外均能有效转染分裂及静止细胞，无致癌性，并且有容易生产及纯化的特点。腺病毒可以感染呼吸道，眼，胃肠道和膀胱，目前已鉴定出47个血清型。根据其血凝作用，对培养细胞的转化和G+C百分比，可将人腺病毒分为7个类型。腺病毒基因组含有11个基因，其中E1区在早期基因合成中是非常重要的。研究表明腺病毒E1A蛋白具有抗肿瘤作用，它能抑制原癌基因如HER-2/neu，P27/kipi，P21/waf1/cip1，P15/INK41等的转录，还能将肿瘤细胞变化为上皮类细胞，并防止肿瘤细胞转移。E1A基因还能增加肿瘤细胞对DNA损伤制剂，如化疗，放疗的敏感性，并能诱导肿瘤细胞产生依赖或非依赖p53状况的细胞凋亡效应。E1B 19K蛋白是一类超强的细胞凋亡抑制剂，能抑制Bax，Bak，Nbk/Bik，Fas，肿瘤坏死因子受体，腺病毒E1A，P53和TNF等所诱导的细胞凋亡效应，还能降低腺病毒E1A蛋白在细胞内的表达量。E1B 55k蛋白可结合P53肿瘤抑制蛋白，螯合或灭活P53蛋白。正常情况下，腺病毒主要在细胞内有效复制，E1B区基因编码合成55K蛋白可与宿主细胞中的P53蛋白结合，并使其失活从而阻止细胞凋亡的发生，使腺病毒得以复制。
美国专利5677178，Bischoff，J.R等，科学(Science)，274卷，373-376页(1996)及Heise，C等，自然医学(Nature Medicine)3卷，639-645页(1997)报道了应用E1B 55K突变腺病毒(d11520)，也称ONYX 015对肿瘤细胞的选择性杀伤作用为一类新型的抗肿瘤疗法。腺病毒E1B区基因编码合成55K蛋白可与宿主细胞中的P53蛋白结合，使其失活而阻止细胞凋亡的发生，并使病毒得以复制。由于d11520或ONYX 015缺失功能性55kd蛋白，因此该腺病毒突变体能在p53功能缺陷型的肿瘤细胞内自我复制，繁殖，导致肿瘤细胞裂解或凋亡。而在正常细胞中却不能自我复制，因此正常细胞与组织并不受影响。
目前ONYX-015在美国已进入III期临床，并取得了一定疗效。然而作为一类抗肿瘤新药，ONYX-015存在着以下几个问题：第一，ONYX-015的抗肿瘤效果不够理想。由于ONYX-015缺乏E1B 55K蛋白，从而极大地降低了腺病毒在肿瘤细胞内的复制能力，它在肿瘤细胞内的复制能力只有野生型腺病毒的10％左右，它对浅部肿瘤如头颈癌有一定疗效，而对深部肿瘤如肝癌，胰腺癌疗效不佳。第二，ONYX-015对P53基因突变型的肿瘤有一定杀伤效力，但对p53基因正常型的肿瘤疗效不佳。目前已知50％左右的肿瘤是p53基因缺陷型，另外50％左右的肿瘤是p53基因正常型，由此可预测，ONYX-015对大约50％左右的肿瘤没有疗效。第三，ONYX-015的临床结果表明单独使用ONYX-015很难治愈肿瘤，ONYX-015必须与化疗药物联用，才能有较好的抗肿瘤疗效。但联合用药会增加化疗药物的毒副反应，如骨髓抑制、脱发等，给病人增加许多不必要痛苦。因此发展新一代的重组腺病毒，具有超强的、多功能抗癌效应，并对P53基因缺陷型或p53基因正常型的肿瘤均有较强的杀伤力是非常必要的。
发明内容
本发明提供了一种多功能抗癌重组腺病毒，其特征在于该病毒同时灭活能够与细胞内功能性肿瘤抑制蛋白p53结合的E1B 55K病毒蛋白和能够抑制细胞凋亡的E1B 19K病毒蛋白，并任选地携带一组由外源性启动子所驱动的外源性基因。这种重组腺病毒能在P53功能缺陷型或P53功能正常型的肿瘤细胞内大量复制繁殖，产生细胞致病效应(CPE)，并在肿瘤细胞内高效表达外源性蛋白，最终杀死肿瘤细胞，而对P53功能正常型的非肿瘤细胞基本无杀伤作用。
这种重组腺病毒优选地通过缺失突变灭活该病毒的E1B 19K蛋白和E1B 55K蛋白，缺失突变部分包括E1B启动子序列，E1B 19k基因序列和E1B 55K基因序列。这种重组腺病毒也能通过定点突变，和/或插入突变，和/或移码突变灭活E1B 19K和E1B 55K蛋白。
另一方面，这种重组腺病毒携带的外源性基因所编码的蛋白优选地为细胞因子，包括但不限于粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)；美国专利5393870或5391485；白介素2，美国专利4738927或5641665；白介素7，美国专利4965195或5328988；白介素12，美国专利5457038；α-肿瘤坏死因子，美国专利677063或5773582；γ-干扰素，美国专利4727138或4762791，或为细胞自杀基因产物，包括但不限于单纯疱疹病毒胸苷激酶基因(HSV-TK)和胞嘧啶脱氨基酶基因(cytocine deaminase，CD)，美国专利编号5358866和5677178，或为细胞周期调控蛋白，包括但不限于p16，Arapet等，癌症研究，55：1351-1354，1995，细胞凋亡诱导蛋白，包括但不限于肿瘤抑制蛋白P53，Casey等，原癌基因，6：1791-1797，1991。
外源性基因优选地由外源性病毒类启动子，例如CMV早期启动子，SV40早期启动子所驱动，外源性基因优选地插入到腺病毒E1B部位，例如E1B基因缺失突变，和/或定点突变，和/或插入突变，和/或移码突变部位。外源性基因也可插入到腺病毒E1A部位，和/或腺病毒E2部位，和/或腺病毒E3部位，和/或腺病毒E4部位。
另一方面，这种重组腺病毒含有E3基因。E3基因产物能增加腺病毒进入宿主体内的最高耐受剂量，并降低病毒对宿主所产生的毒副反应。
本发明还提供了另一种多功能抗癌重组腺病毒，其特征在于这种重组腺病毒同时灭活能够与细胞内功能性肿瘤抑制蛋白p53结合的E1B55K病毒蛋白和能够抑制细胞凋亡的E1B 19K病毒蛋白，并携带两组外源性基因，在两组外源性基因之间由内部核糖体进入位点(IRES)有效连接，因此两组外源性基因能被共转录成一条mRNA链，并由内部核糖体进入位点控制第二组外源性基因的翻译。本发明所提供的重组腺病毒能够在P53功能缺陷型和/或P53功能正常型的肿瘤细胞内大量复制繁殖，产生细胞致病效应(CPE)，并能在肿瘤细胞内高效表达外源性蛋白，最终杀死肿瘤细胞，而对P53功能正常型的非肿瘤细胞基本无杀伤作用。另外，这种腺病毒携带的E3基因能增加腺病毒进入宿主体内的最大耐受剂量，降低病毒对宿主所产生的毒副反应。因此，此新型重组腺病毒的抗癌效应和安全性均优于现有技术改进的重组腺病毒。
本发明所述的重组腺病毒优选地通过缺失突变灭活该病毒的E1B19K蛋白和E1B 55K蛋白，缺失部分包括E1B启动子序列，E1B 19K基因序列和E1B 55K基因序列，缺失部分也可为E1B 19K基因序列和E1B55K基因序列，但保留E1B启动子序列。重组腺病毒也可通过定点突变，和/或插入突变，和/或移码突变灭活该病毒地E1B 19K蛋白和E1B 55K蛋白。
另一方面，本发明所述重组腺病毒所携带的两组外源性基因，它们所编码的蛋白优选地为一个细胞因子与一个自杀基因产物，包括但不限于粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)，美国专利5393870或5391485；白介素2，美国专利4738927或5641665；白介素7，美国专利4965195或5328988，白介素12，美国专利5457038，α-肿瘤坏死因子，美国专利677063或5773582，γ-干扰素，美国专利4727138或4762791，单纯疱疹病毒胸苷激酶基因产物(HSV-TK)和胞嘧啶脱氨基酶基因产物(cytocine deaminase，CD)，美国专利5358866和5677178，或为两个细胞因子，或为两个细胞自杀基因产物。重组腺病毒所携带的两组外源性基因所编码的蛋白也可为一个细胞因子与一个细胞周期调控蛋白，或为一个细胞因子与一个细胞凋亡诱导蛋白。
本发明所述重组腺病毒所携带的两组外源性基因，其中第一组外源性基因由外源性启动子，或内源性腺病毒启动子所驱动，优选的外源性启动子为病毒类启动子，例如CMV早期启动子，SV40启动子；外源性基因也可由组织特异性启动子，例如前列腺特殊抗原启动子(美国专利5648478)驱动；优选的内源性腺病毒启动子为内源性E1B启动子。第二组外源性基因由内部核糖体进入位点控制翻译，并在第二组外源性基因下游任选地含有外源性聚腺苷酸结构。
另一方面，本发明所述的重组腺病毒，其中所述内部核糖体进入位点序列有效连接两组外源性基因，并控制第二组外源性基因的翻译。内部核糖体进入位点序列优选地选自脑心肌炎病毒(EMCV)，和/或微管内皮生长因子(VEGF)，和/或免疫球蛋白链结合蛋白(BiP)，和/或纤维细胞生长因子2(fibroblast growth factor2)，和/或丙型肝炎病毒(HCV)基因组。
另一方面，本发明所述的重组腺病毒，其中所述外源性基因可优选地插入到腺病毒E1B部位，例如E1B基因缺失突变，和/或定点突变，和/或插入突变，和/或移码突变部位，外源性基因也可插入到腺病毒E1A部位，和/或腺病毒E2部位，和/或腺病毒E3部位，和/或腺病毒E4部位。
另一方面，本发明所述的重组腺病毒含有E3基因。E3基因产物能增加腺病毒进入宿主体内的最大耐受剂量，并降低病毒对宿主所产生的毒副反应。
本发明还提供了另一种多功能抗癌重组腺病毒，其特征在于该病毒灭活能够与细胞内功能性肿瘤抑制蛋白p53结合的E1B 55K病毒蛋白，并携带两组外源性基因，在两组外源性基因之间由内部核糖体进入位点(IRES)有效连接，因此两组外源性基因能被共转录成一条mRNA链，并由内部核糖体进入位点控制第二组外源性基因的翻译。本发明所提供的这种重组腺病毒能在P53功能缺陷型的肿瘤细胞内大量复制繁殖，高效表达外源性蛋白，并杀死肿瘤细胞，而对P53功能正常型的非肿瘤细胞基本无杀伤作用。
本发明所述的这种重组腺病毒优选地通过缺失突变灭活E1B 55K蛋白，重组腺病毒也可通过定点突变，和/或插入突变，和/或移码突变灭活E1B 55K蛋白。
另一方面，这种重组腺病毒所携带的两组外源性基因，它们所编码的蛋白优选地为一个细胞因子与一个自杀基因产物，包括但不限于粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)，美国专利5393870或5391485，白介素2，美国专利4738927或5641665，白介素7，美国专利4965195或5328988，白介素12，美国专利5457038，α-肿瘤坏死因子，美国专利677063或5773582，γ-干扰素，美国专利4727138或4762791，单纯疱疹病毒胸苷激酶基因(HSV-TK)和胞嘧啶脱氨基酶基因(cytocinedeaminase，CD)，美国专利5358866和5677178，或为两个细胞因子，或为两个细胞自杀基因产物。重组腺病毒所携带的两组外源性基因所编码的蛋白也可为一个细胞因子与一个细胞周期调控蛋白，或为一个细胞因子与一个细胞凋亡诱导蛋白。第一组外源性基因由外源性启动子，或内源性腺病毒启动子所驱动，第二组外源性基因由内部核糖体进入位点控制翻译，并在第二组外源性基因下游任选地含有外源性聚腺苷酸结构。
另一方面，这种重组腺病毒所携带的外源性基因，其中第一组外源性基因优选地由外源性病毒类启动子，如CMV早期启动子，SV40启动子驱动，也可由组织特异性启动子，如前列腺特殊抗原启动子，美国专利5648478，或由内源性腺病毒E1B启动子驱动。
另一方面，这种重组腺病毒，其中所述内部核糖体进入位点有效连接两组外源性基因，并控制第二组外源性基因的翻译。内部核糖体进入位点序列选自脑心肌炎病毒(EMCV)，和/或微管内皮生长因子(VEGF)，和/或免疫球蛋白链结合蛋白(BiP)，和/或纤维细胞生长因子2(fibroblastgrowth factor2)，和/或丙型肝炎病毒(HCV)基因组。
另一方面，这种重组腺病毒，其中所述外源性基因可插入到腺病毒E1B部位，例如E1B基因缺失突变，和/或定点突变，和/或插入突变，和/或移码突变部位。外源性基因也可插入到腺病毒E1A部位，和/或腺病毒E2部位，和/或腺病毒E3部位，和/或腺病毒E4部位。
另一方面，这种重组腺病毒含有E3基因。E3基因产物能增加腺病毒进入宿主体内的最大耐受剂量，并降低病毒对宿主所产生的毒副反应。
本发明的另一目的是提供选择性杀死肿瘤细胞的方法。该方法包括在感染的条件下，  将杀死肿瘤有效量的重组腺病毒与含有肿瘤细胞的细胞种群接触，由此产生感染的细胞群，并在感染的细胞种群内高效表达外源性抗肿瘤蛋白，最终杀死感染的肿瘤细胞。所述病毒不能编码E1B19K蛋白和/或E1B 55K蛋白，并可进一步包含一组，两组，或两组以上的外源性基因。
另一方面，本发明提供含有该重组腺病毒和化疗药物的药物组合物。
附图说明
图1示出了重组腺病毒E1区基因图谱，其中，1.野生型腺病毒；2.重组腺病毒Δ1651；3.重组腺病毒Δ1714；4.重组腺病毒Δ1651/GM-CSF；5.重组腺病毒Δ1714/GM-CSF；6.重组腺病毒Δ1651/TK；7.重组腺病毒Δ1714/TK；8.重组腺病毒Δ1651/GM-CSF/TK；9.重组腺病毒Δ1714/GM-CSF/TK；10.重组腺病毒Δ2251/GM-CSF/TK。
图2是重组腺病毒高效GM-CSF。
图3示出了药物前体GCV能加强重组腺病毒对肝癌细胞的致病效应。
图4示出了重缓腺病毒在疥列腺癌动物模型中的药效实验。
图5示出了药物前体GCV和重组腺病毒和药效实验。
具体实施方式
本发明使用的专用术语名称以及下述细胞培养、分子遗传学和分子病毒学的实验室步骤，都是本领域中为人熟知和常用的。核酸重组、多核苷酸合成、病毒毒株的构建、生产与增殖(包括能够反式互补重组缺陷型病毒原种的细胞株)、细胞培养等均按照标准技术进行。一般技术及步骤均按照本领域的常规方法，并参照综合性参考文献分子克隆：实验手册，第二版，Sambrook等编著(1989)冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约；病毒学，第二版，Fields BN与Knipe DM编著(1990)RAVEN出版社，纽约。酶切反应，DNA纯化步骤及克隆等均根据生产厂家的说明书进行。
除非有另外不同的定义，本文所使用的技术和科学术语与本发明所属领域一般技术人员通常所理解的一样，任何与本文描述相似或相同的方法及材料均可用于本发明的实施例或实验。本文对以下术语予以定义，并对本发明中的优选方法和材料加以描述。
重组腺病毒这一术语指经人类DNA重组技术有意修饰后所产生的新的腺病毒基因组。本发明中的重组腺病毒优选地选自人类腺病毒2型或者5型。最优选的腺病毒选自人类腺病毒5型，也包括腺病毒2型和5型的嵌合体。
多功能抗癌重组腺病毒这一术语指这种重组腺病毒具有两种或两种以上的抗癌功能。例如本发明中的重组腺病毒除了腺病毒本身对肿瘤细胞的直接溶癌作用外，重组腺病毒所携带的一组，或两组，或两组以上的外源性抗肿瘤基因，能选择性地在肿瘤细胞内高效表达，进一步加强了腺病毒的抗肿瘤效果。本发明中的重组腺病毒所携带的外源性基因所编码的蛋白优选地为细胞因子和细胞自杀基因产物。
外源性基因这一术语是指一段不同于腺病毒基因组的多核苷酸序列。外源性基因可以编码，也可不编码蛋白质。本发明中的外源性基因所编码的蛋白质通常具有抗肿瘤效应，优选的外源性基因所编码的蛋白为免疫细胞因子，细胞自杀基因产物，细胞周期调控蛋白或细胞凋亡诱导蛋白。
有效地连接这一术语指多核苷酸元件以功能性关系连接。例如，一个启动子或增强子如果影响某一段基因序列的转录，它就是有效地与这段基因序列相连接。有效地连接所指的DNA序列通常是邻接连接的。然而，增强子通常与启动子相隔几千个碱基对而发挥功能，因此某些核苷酸元件虽不邻接，但可以是有效地连接。
内部核糖体进入位点(internal ribosome entry site or IRES)这一术语是指一段多核苷酸序列，它能够促使内部核糖体进入到蛋白质启始密码ATG位点，并引导帽独立的蛋白翻译过程。参照Jackson RJ等生物研究趋势(Trends Biochem Sci)，15(12)：477～83，1990和Jackson RJ等RNA 1(10)：985～1000，1995。本发明中的内部核糖体进入位点序列包括任何能够促进内部核糖体进入到蛋白质启始密码ATG，并引导帽独立的蛋白翻译的多核苷酸序列。本发明中的内部核糖体进入位点优选地选自脑心肌炎病毒(EMCV)，微管内皮生长因子(VEGF)，免疫球蛋白重链结合蛋白(Bip)，纤维细胞生长因子2，和丙型肝炎病毒(HCV)。
P53功能正常型这一术语是指细胞内由P53基因编码的多肽水平基本正常。P53多肽能够结合野生型腺病毒2或5的E1B 55K蛋白。P53功能缺陷型是指通过突变，或通过P53表达量的减少或完全消失而导致细胞内功能型P53蛋白的缺失。另外，P53蛋白功能型缺陷也可以通过P53基因以外的遗传物质的改变，如通过P53亚细胞加工或定位异常的突变而导致P53功能的缺陷。
E1B启动子序列是指腺病毒基因组从1636至1701的多核苷酸序列，其中包括SP1结和位点和TATA盒序列。腺病毒E1B 19K和E1B 55K序列是指腺病毒基因组从1715至3509的多核苷酸序列。
灭活E1B 55K蛋白是指通过DNA重组技术修饰后使E1B 55K蛋白失去了与P53蛋白结合或灭活P53基因转录活性的能力。灭活E1B 55K蛋白可以通过缺失突变消除E1B 55K蛋白与P53蛋白的结合位点，也可通过定点突变、或插入突变、或移码突变灭活E1B 55K蛋白活性。在本发明的优选实施方案中，重组腺病毒通过缺失突变切除腺病毒基因组2251至3509的多核苷酸序列以灭活E1B 55K蛋白。
同时灭活E1B 19K蛋白和E1B 55K蛋白是指通过DNA重组技术修饰后使腺病毒的E1B 55K蛋白失去了与P53蛋白结合或灭活P53基因转录活性的能力，同时也使E1B 19K蛋白失去了能够抑制细胞凋亡的能力。重组腺病毒可以通过缺失突变，和/或定点突变，和/或插入突变，和/或移码突变灭活E1B 55K蛋白和E1B 19K蛋白活性。在本发明的优选实施方法中，重组腺病毒通过缺失突变切除腺病毒基因组1651至2591多核苷酸序列，包括E1B启动子序列，E1B 19K基因序列和5`端E1B 55K基因序列，并插入多核苷酸GGTTAATTCCGCTCGAACGG序列，以灭活E1B 19K蛋白和E1B 55K蛋白。在本发明的另一实施方案中，重组腺病毒通过缺失腺病毒基因组1714至2591多核苷酸序列，包括E1B 19K基因序列和5`端E1B 55K基因序列，并插入多核苷酸GGTTAATTAACCGCTCGAGCGG序列，以灭活E1B 19K蛋白和E1B55K蛋白。
外源性启动子是指一段不同于腺病毒基因组的DNA序列，这种DNA序列能调控与其有效连接的另一段基因组的转录与翻译。本发明中的外源性启动子包括但不限于病毒类启动子，如CMV早期启动子，SV40启动子，细胞内启动子，如α-延长因子启动子，组织特异性启动子，如平滑肌特异性启动子，胰脏特异性启动子，Palmite等(1987)细胞50：435；肝脏特异性启动子Rovet等(1992)生物化学杂志(J.Biol.Chem)，267：20765，Lemaigne等(1993)生物化学杂志(J.Biol.Chem)，268：19896，前列腺特异性启动子(美国专利5,698,443)；肿瘤特异性启动子，如甲胎蛋白启动子，胳氨酸酶启动子。肿瘤特异性启动子在肿瘤细胞内呈激活状态，而在非肿瘤细胞内呈非激活状态。可诱导型启动子是指在化学刺激或温度改变等外来刺激情况下，启动子呈激活状态，并能调控与其功能性相连的基因组的转录与翻译。参照Yoshida和Hamada(1997)生化与生物物理研究通讯(Biochem Biophys Res Comm)，230：426～430；Iida等(1996)病毒学杂志(J Virol)，70(9)：6054～6059；Hwang等(1997)病毒学杂志(J Virol)，71(9)：7128～7131；Lee等(1997)分子细胞生物学(Mol Cell Biol)17(9)：5097～5105。可诱导型启动子包括X光诱导型启动子如XRE启动子[Boothman等放射学研究(Radiation Reseach)138(增订刊1)：S68～71]，UV诱导型启动子[Gamier和Cole，(1998)分子微生物学(Mol Microbiol)，2：607～614]。本发明优选的外源型启动子为病毒类启动子如CMV早期启动子，或组织特异启动子，如前列腺特异性启动子。
内源性腺病毒启动子是指一段来源于腺病毒基因组的DNA序列，它能调控与其有效连接的另一组DNA序列的转录与翻译。内源性腺病毒启动子包括早期启动子E1A启动子、E1B启动子、E3启动子、E4启动子和主要晚期启动子。本发明优选的内源性腺病毒启动子是内源性E1B启动子。
多功能抗癌重组腺病毒的构建
本发明提供了一种多功能抗癌重组腺病毒，这种腺病毒同时灭活能够与细胞内功能性肿瘤抑制蛋白p53结合的E1B 55K病毒蛋白和能够抑制细胞凋亡的E1B 19K病毒蛋白，但携带两组编码抗肿瘤蛋白的外源性基因，并通过内部核糖体进入位点(IRES)有效地连接，因此这两组外源性基因能被共转录成一条mRNA链，并由内部核糖体进入位点控制第二组外源性基因的翻译。
在本发明的优选实施方案中，重组腺病毒通过缺失突变灭活E1B19K蛋白和E1B 55K蛋白。缺失部分包括E1B启动子序列，E1B 19K基因序列和E1B 55K基因序列，并在E1B基因缺失突变部位插入新的酶切位点。通过新的酶切位点，该重组腺病毒能携带一组，或两组，或两组以上的外源性基因。
为了获得上述重组腺病毒，首先优选地以pXC-1质粒(从MicrobixBiosystems公司购得)作为启始材料，构建缺失E1B基因的腺病毒左端质粒。有关质粒pXC-1的资料可以参照由Microbix Biosytems出版的“Gene Transfer with Adenovirus Vectors”一文。除了质粒pXC-1外，任何从pXC-1衍生出来的腺病毒左端质粒，或任何含有腺病毒5’端反向末端重复序列(ITR)、腺病毒包装信号，E1A增强子、启动子、和聚腺苷酸信号以及来自于腺病毒基因组的一段DNA片段所组成的腺病毒载体均可用于构建本发明所述的重组腺病毒。
为了构建缺失E1B 19K基因和55K基因的腺病毒左端质粒，采用PCR方法从质粒pXC-1上优选地切除nt1651至2591的DNA序列。并在缺失突变部位插入新的酶切位点PacI和XhoI，获得新的质粒pXC-Δ1651。质粒pXC-Δ1651缺失内源性E1B启动子序列，并同时灭活E1B19K蛋白和E1B 55K蛋白。E1B基因缺失部分也可包括nt1636至3509之间的任意一段DNA序列，并通过此缺失突变同时灭活腺病毒E1B 19K蛋白和E1B 55K蛋白。
质粒pXC-Δ1651能携带一组，或两组，或两组以上的外源性基因。优选外源性基因所编码的抗肿瘤蛋白为免疫细胞因子，例如粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)，美国专利5393870或5391485，白介素2，美国专利4738927或5641665，白介素7，美国专利4965195或5328988，白介素12，美国专利5457038，α-肿瘤坏死因子，美国专利677063或5773582，γ-干扰素，美国专利4727138或4762791；细胞自杀基因产物，例如单纯疱疹病毒胸苷激酶基因(HSV-TK)和胞嘧啶脱氨基酶基因(cytocine deaminase，CD)，美国专利5358866和5677178；细胞周期调控蛋白，例如P16，Arapet等，癌症研究，55：1351-1354，1995；细胞凋亡诱导蛋白，例如肿瘤抑制蛋白P53，Casey等，原癌基因，6：1791-1797，1991。优选的两组外源性基因所编码的蛋白分别为一个细胞因子与一个自杀基因产物，两个细胞因子，两个细胞自杀基因产物，一个细胞因子与一个细胞周期调控蛋白，一个细胞因子与一个细胞凋亡诱导蛋白，或上述蛋白的任意组合。
用于控制上述外源性基因转录和表达的启动子为外源性启动子，优选地为外源性病毒类启动子，如CMV早期启动子。然而组织特异性启动子如前列腺特殊抗原启动子也可用于控制外源性基因的转录与表达。
上述重组腺病毒载体所携带的两组或两组以上外源性基因优选地通过内部核糖体进入位点有效地连接。内部核糖体进入位点是一段特殊的DNA序列，它能通过启始密码(通常为AUG)，启动一段含有双基因或多基因(编码两组或多组蛋白质)的RNA转录体的翻译过程。因此通过内部核糖体进入位点有效连接的两组或多组基因组能被共转录成一条mRNA链，并通过内部核糖体进入位点控制双基因或多组基因的翻译。本发明所述的重组腺病毒，其中所包含的内部核糖体进入位点优选地选自脑心肌炎病毒(EMCV)，微管内皮生长因子(VEGF)，免疫球蛋白链结合蛋白(BiP)，纤维细胞生长因子2(fibroblast growth factor2)和丙型肝炎病毒(HCV)基因组。
在本发明的另一实施方案中，重组腺病毒通过缺失突变同时灭活E1B 19K蛋白和E1B 55K蛋白。缺失部分为E1B 19K基因序列和E1B 55K基因序列，但保留E1B启动子序列，并在E1B基因缺失突变部位插入新的酶切位点。通过新的酶切位点，该病毒能任选地携带一组，或两组，或两组以上的外源性基因。
为了获得上述重组腺病毒，优选地以质粒pXC-1作为启始材料，构建缺失E1B 19K和55K基因的腺病毒左端质粒pXC-Δ1714。pXC-Δ1714缺失nt1714-2591的DNA序列，缺失部分为E1B 19K基因序列和E1B 55K基因序列，但保留E1B启动子序列，并在E1B基因缺失突变部位插入新的酶切位点PacI和XhoI。质粒pXC-Δ1714还能携带一组，或两组，或两组以上的外源性基因。优选外源性基因所编码的抗肿瘤蛋白为免疫细胞因子，例如粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)，美国专利5393870或5391485，白介素2，美国专利4738927或5641665，白介素7，美国专利4965195或5328988，白介素12，美国专利5457038，α-肿瘤坏死因子，美国专利677063或5773582，γ-干扰素，美国专利4727138或4762791，细胞自杀基因产物，例如单纯疱疹病毒胸苷激酶基因(HSV-TK)和胞嘧啶脱氨基酶基因(cytocine deaminase，CD)，美国专利5358866和5677178，细胞周期调控蛋白，例如P16，Arapet等，癌症研究，55：1351-1354，1995，细胞凋亡诱导蛋白，例如肿瘤抑制蛋白P53，Casey等，原癌基因，6：1791-1797，1991。优选的两组外源性基因所编码的蛋白分别为一个细胞因子与一个自杀基因产物，两个细胞因子，两个细胞自杀基因产物，一个细胞因子与一个细胞周期调控蛋白，一个细胞因子与一个细胞凋亡诱导蛋白，或上述蛋白的任意组合。
用于控制上述外源性基因转录与表达的启动子为外源性启动子，优选地启动子为外源性病毒类启动子，例如CMV早期启动子。然而组织特异性启动子，例如前列腺特殊抗原启动子，或内源性腺病毒启动子，如内源性E1B启动子可用于控制上述重组腺病毒携带的两组，或两组以上外源性基因的转录与表达。在外源性基因之间由内部核糖体进入位点序列(IRES)有效连接，内部核糖体进入位点优选地选自脑心肌炎病毒(EMCV)，微管内皮生长因子(VEGF)，免疫球蛋白链结合蛋白(BiP)，纤维细胞生长因子2(fibroblast growth factor2)和丙型肝炎病毒(HCV)基因组。
内源性E1B启动子位于腺病毒基因组nt1636至1701，含有与SP1具有高度亲和力的结合位点和TATA盒。E1B启动子能调控至少4条mRNA的转录，包括22S、14.5S、14S和13S，其中22S和13S编码两组最主要的E1B蛋白—E1B 19K蛋白和E1B 55K蛋白。由于E1B启动子调控腺病毒早期蛋白的合成，当腺病毒进入感染晚期时，E1B启动子的活性被抑制，主要晚期启动子的活性被激活，晚期蛋白如腺病毒壳蛋白和其他结构蛋白的表达量大幅增加。在本发明的一个优选实施方案中，腺病毒内源性E1B启动子序列，E1B 19K基因和E1B 55K基因被切除，由外源性超强启动子如CMV早期启动子调控的外源性基因被插入到E1B基因缺失突变部分，这样在CMV早期启动子调控下，外源性基因能在肿瘤细胞内持续高效地表达抗肿瘤蛋白，极大地了加强抗肿瘤效应。在本发明的另一个实施方案中，腺病毒的内源性E1B启动子序列被保留，E1B 19K基因和E1B 55K基因被切除，外源性基因被插入到E1B基因缺失突变部位，并由外源性病毒类启动子如CMV早期启动子调控外源性基因的转录与表达。然而，由于E1B启动子序列与CMV早期启动子序列相邻连接，两者之间有可能互相作用而影响或降低外源性基因的转录与表达。外源性抗肿瘤蛋白基因也可由内源性E1B启动子调控，然而当腺病毒进入感染晚期时，E1B启动子的活性被仰制，外源性抗肿瘤蛋白的表达量会明显降低从而影响其抗肿瘤效应。
内部核糖体进入位点能将两组或两组以上编码蛋白的基因组有效连接，通过内部核糖体进入位点将这些基因组共转录成一条mRNA链，并在翻译水平上控制基因组所编码蛋白的表达。目前已知肿瘤的发生、演变过程是一个十分复杂的过程，需要多种因素，通过多种途径同时作用才能将正常细胞转化为肿细胞。单一疗法，如化疗，或放疗很难治愈肿瘤。而许多抗癌药物具有协同抗肿瘤效应，联合用药已成为肿瘤治疗的一种趋势。目前已知许多抗肿瘤蛋白具有协同抗肿瘤效应，在本发明的一个优选实施方案中，重组腺病毒所携带的两组或两组以上抗肿瘤蛋白基因通过内部核糖体进入位点有效连接，因此，两组或两组以上抗肿瘤蛋白能同时在同一肿瘤细胞内高效、持续表达，加上重组腺病毒本身的直接溶癌作用，这样可极大地加强了抗肿瘤效应。
外源性基因表达盒包括外源性启动子序列和外源性基因序列(包含一组，或两组，或两组以上的外源性基因，通过内部核糖体进入位点有效相连)，并任选地含有外源性聚腺苷酸信号，可优选地连接到腺病毒E1B部位，例如E1B基因缺失突变，或定点突变，或移码突变部位。然而外源性基因表达盒也能插入到腺病毒E1A部位，或E3部位，或E4部位。
优选的外源性抗肿瘤基因为粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)基因，或HSV-TK基因。它们分别通过PacI位点被插入到pXC-Δ1651或pXC-Δ1714腺病毒载体上，获得新的、含有外源性基因的腺病毒左端载体pXC-Δ1651/GM-CSF，pXC-Δ1714/GM-CSF，pXC-Δ1651/TK或pXC-Δ1714/TK。优选的两组外源性抗肿瘤基因为粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)与TK基因。它们通过内部核糖体进入位点序列有效连接，并被分别插入到pXC-Δ1651或pXC-Δ1714腺病毒左端载体，获得新的、含有两组外源性基因的腺病毒左端载体pXC-Δ1651/GM-CSF/TK和pXC-Δ1714/GM-CSF/TK。
本发明还提供了另一种多功能抗癌重组腺病毒，这种腺病毒灭活能够与细胞内功能性肿瘤抑制蛋白p53结合的E1B 55K病毒蛋白，但携带两组编码抗肿瘤蛋白的外源性基因，并由内部核糖体进入位点(IRES)有效连接这两组外源性基因，因此两组外源性基因能被共转录成一条mRNA链，并由内部核糖体进入位点控制第二组外源性基因的翻译。
在本发明的优选实施方案中，这种重组腺病毒通过缺失突变灭活E1B 55K蛋白。缺失部分为nt2251至3509 DNA序列，并在E1B 55K基因缺失突变部位插入新的酶切位点。通过此新的酶切位点，该重组腺病毒能携带两组，或两组以上编码抗肿瘤蛋白的外源性基因。
为了获得上述重组腺病毒，优选地以质粒pXC-1作为启始材料，通过PCR技术构建缺失E1B 55K基因的腺病毒左端质粒pXC-Δ2251，pXC-Δ2251缺失nt 2251至3509的DNA序列，并在E1B 55K基因缺失突变部位插入新的酶切位点PacI和XhoI。质粒pXC-Δ2251能携带两组，或两组以上的外源性基因。优选的两组外源性基因所编码的蛋白分别为一个细胞因子与一个自杀基因产物，两个细胞因子，两个细胞自杀基因产物，一个细胞因子与一个细胞周期调控蛋白，一个细胞因子与一个细胞凋亡诱导蛋白，或上述蛋白的任意组合。用于控制上述外源性基因转录与表达的优选启动子为外源性病毒类启动子，例如CMV早期启动子。然而组织特异性启动子，例如前列腺特殊抗原启动子也可用于控制上述外源性基因的转录与表达。在外源性基因之间优选地由内部核糖体进入位点序列(IRES)有效相连。因此外源性基因能被共转录成一条mRNA链，并由内部核糖体进入位点控制第二组外源性基因的翻译。
优选的两组外源性抗肿瘤基因为粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)与TK基因。它们通过内部核糖体进入位点序列有效连接，并被分别插入到pXC-Δ2251的PacI位点，获得新的、含有两组外源性基因的腺病毒左端载体pXC-Δ2251/GM-CSF/TK。
为了获得相应的重组腺病毒，上述重组腺病毒左端载体与含有E3区基因的腺病毒右端载体共转染293细胞，通过同源重组方式获得新的重组腺病毒Δ1651，Δ1714，Δ1651/GM-CSF，Δ1714/GM-CSF，Δ1651/TK，Δ1714/TK，Δ1651/GM-CSF/TK，Δ1714/GM-CSF/TK，Δ2251/GM-CSF/TK。优选的腺病毒右端载体为pBHGE3质粒，也可为含有E3区基因的感染性腺病毒颗粒。腺病毒右端载体也可为不含E3区基因的pBGH10或pBGH11质粒，或从这些质粒衍生出来的类似质粒。有关腺病毒质粒的资料及它们的应用，参考Hitt，Construction andPropagation of Human Adenovirus Vectors，In：Cell Biology：A LaboratoryHandbook，J.Celis，Academic Press，NY，1995，或参考Graham，Adenovirus Based Expression Vectors and Recombinant Vaccines，In：Vaccines：New Approaches to Immunological Problems，R.W.Eliss，Butterworth，pp363-390，1992。
为了证实本发明中所述重组腺病毒的抗肿瘤效果，首先进行细胞水平的实验，比较野生型腺病毒、重组腺病毒Δ1651，Δ1651/GM-CSF、Δ1651/TK、Δ1651/GM-CSF/TK、Δ1714，Δ1714/GM-CSF，Δ1714/TK，和1714/GM-CSF/TK在正常细胞--微管内皮细胞(MVEC)，宫颈癌细胞株C33A、肝癌细胞株HeP3B和前列腺癌细胞株LNCaP中的复制能力。实验步骤和结果参考实施例4。本发明还通过比较野生型腺病毒与重组腺病毒Δ1651，Δ1651/GM-CSF对各种正常细胞、P53缺陷型和P53正常型肿瘤细胞株所产生的细胞致病效应(CPE)来评估重组腺病毒对肿瘤细胞的选择性杀伤作用，参见实施例5。此外，含有一组或两组外源性抗肿瘤蛋白基因的重组腺病毒Δ1651/GM-CSF、Δ1651/TK、Δ1651/GM-CSF/TK，Δ2251/GM-CSF/TK能选择性地在肿瘤细胞内高效表达抗肿瘤蛋白，参见实施例6、7和附图2、3。
除了细胞水平的实验外，本发明还通过动物肿瘤模型来进一步证实本发明所提供的重组腺病毒的抗癌效应，参见实施例8、9、10和附图4、5。
由实施例4、5所见，同时灭活E1B 19K蛋白和E1B 55K蛋白的重组腺病毒，能选择性地在P53功能正常型和/或P53正常缺陷型的肿瘤细胞内复制、繁殖，产生细胞病变效应，并杀死肿瘤细胞，它们在肿瘤细胞内的复制能力超过了野生型腺病毒，而对正常细胞基本上无杀伤作用。重组腺病毒Δ1651/GM-CSF，Δ1651/GM-CSF/TK除了能选择性地在P53缺陷型和/或P53功能正常型的肿瘤细胞内复制、繁殖，还能在肿瘤细胞内高效表达粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)，参照实施例6和附图2，进而诱导效应细胞产生肿瘤特异性细胞毒性T淋巴细胞和非特异性抗肿瘤免疫反应而进一步加强杀伤肿瘤的效应。有关粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子的资料可从本领域中各种不同来源获得。重组腺病毒Δ1651/TK和Δ1651/GM-CSF/TK除了能选择性地杀伤P53功能正常型和/或P53功能缺陷型的肿瘤细胞，还能在肿瘤细胞内高效表达HSV-TK基因产物，参照实施例7和附图3。HSV-TK基因产物对细胞没有直接毒性，然而，当细胞群接触到一种药物前体无环鸟苷(GCV)或FIAU时，在肿瘤细胞内高效表达的TK基因产物能将药物前体无环鸟苷(GCV)转化成有毒药物二，三磷酸核苷，并将肿瘤细胞选择性的消除，因此极大的增强了重组腺病毒的抗肿瘤作用。有关药物前体的资料可从本领域中各种不同来源获得。重组腺病毒Δ1651/GM-CSF/TK除了能选择性地杀伤P53功能正常型和/或P53功能缺陷型的肿瘤细胞外，还能在上述肿瘤细胞内高效表达粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和TK基因产物，参照实施例6和7，附图2和3。这类重组腺病毒具有多功能抗肿瘤效应：重组腺病毒的直接溶癌作用，粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子所诱发的抗肿瘤免疫反应和TK基因产物对肿瘤细胞所产生的“旁观者效应”，这三方面的抗癌作用结合在一起，产生了三杀伤的最佳抗肿瘤效应。
本发明中的重组腺病毒还含有E3区基因。目前认为E3基因产物能降低宿主对腺病毒的免疫排斥效应，延长外源性蛋白在宿主体内的表达时间。[Ican，等(1997)美国国家科学院院报(PNAS)94：2587～2592；Bunder等(1997)病毒学杂志(J.Virol.)71：7623～7628]。本发明人发现带有E3基因的腺病毒进入宿主体内的最大耐受量比不带E3基因的腺病毒提高了2倍左右，表明E3基因产物能提高宿主对腺病毒的耐受性，降低腺病毒对宿主所产生的毒副反应。参见实施例10。这可能E3区的14.7K蛋白和10.4K/14.5K蛋白复合物阻断肿瘤坏死因子所诱导的细胞毒性及炎症反应有关。
在本发明的一个代替实施方案中，重组腺病毒蛋白可以通过定点突变，或/和插入突变，或/和移码突变灭活E1B 19K蛋白和/或E1B 55K，所述病毒还可任选地携带一组，或两组，或两组以上的外源性基因。本发明的重组腺病毒能进一步包含一个在E1A基因上的额外突变。这种突变型的E1A蛋白质缺乏能够结合肿瘤抑制基因Rb(和/或300kd多肽和/或107kd多肽)的CR1和/或CR2结构区域，但包含一个能够反式激活腺病毒早期基因的功能CR3结构区域。该重组腺病毒能够在缺乏功能性Rb肿瘤细胞内复制，繁殖，并杀伤肿瘤细胞。
治疗肿瘤的方法
本发明还提供了治疗肿瘤的方法。本发明中的重组腺病毒可用于治疗多种P53正常型和/或P53缺陷型的人类肿瘤。例如但不限于支气管癌，鼻咽癌，喉癌，小细胞与非小细胞肺癌，肺腺癌，肝癌，胰腺癌，膀胱癌，结肠癌，乳腺癌，宫颈癌，卵巢癌，或淋巴细胞白血病的病人或非人类乳动物。重组腺病毒以有效抗肿瘤剂量的混悬液，通过多种途径应用到肿瘤组织中，包括静脉内，腹腔内，肌肉，皮下及局部肿瘤直接注射。每毫升含有大约10³～10¹²或更多病毒颗粒的混悬物可做为一种气雾剂吸入以治疗肿瘤，例如：支气管癌，小细胞肺癌，非小细胞肺癌，肺腺癌或喉癌，鼻咽癌，宫颈癌，或用药签将其直接敷到肿瘤部位以治疗肿瘤，例如：支气管癌，鼻咽癌，喉癌，宫颈癌，或着可以注射方法治疗肿瘤，例如可注射到腹腔以治疗卵巢癌，注射到门静脉治疗肝肿瘤或其他非肝脏原发肿瘤的肝转移，或着直接注射到肿瘤部位以治疗肿瘤，例如：乳腺肝癌，前列腺癌。
本发明的重组腺病毒还可用于预防多种P53正常型和P53缺陷型的人类肿瘤。在预防性应用中，重组腺病毒或其混合物的组合物，被应用到目前并不患有癌症的病人上，以增强病人对肿瘤复发的抵抗力，或延长缓解时间。
本发明的重组腺病毒还可作为一种肿瘤免疫疗法，治疗p53正常型和/或p53缺陷型的人类肿瘤，包括局部或远处转移的肿瘤。这种重组腺病毒可以通过多种途径应用到肿瘤组织中，选择性地在肿瘤细胞内复制、繁殖，并有效表达免疫细胞因子，免疫细胞因子能诱导效应细胞产生肿瘤特异性细胞毒性T淋巴细胞和非特异性抗肿瘤免疫反应。
本发明的抗肿瘤腺病毒疗法可联合其他抗肿瘤方案，如常规化疗、和/或放疗、和/或生物疗法以治疗各种肿瘤。优选的化疗药物包括Taxol，Taxotere，Doxorubicin，这些化合物的抗肿瘤疗效在本领域中是公认的。
为了进一步详细描述本发明，以下实施例是通过举例方法提供。然而在权利要求的范围内进行某些改变和调整应认为属于本发明的范畴。
实施例
实施例1.腺病毒E1B基因突变体的构建
A.质粒pXC-Δ1651的构建
质粒pXC-1购于加拿大Microbix Biosystem Inc(Toronto)。pXC-1含有人腺病毒5型(Ad5)从nt22-5790的基因序列。通过PCR方法[详细实验步骤参照分子克隆：实验手册，第二版，Sambrook编著(1989)]在pXC-1上构建缺失E1B基因(从nt1651-2591)的腺病毒左端质粒。具体-构建步骤如下：
以寡核苷酸链
UCP1(5’-TGAGACGCCCGACATCACCT-3’)
UCP2(5’-CCGCTCGAGCGGTTAATTAACCTAACACGCCATGCAAGTTAA-3’)
            XhoI    PacI
为引物，pXC-1 DNA为模板，得到PCR产物A。PCR产物A含有腺病毒从nt1316-1650的基因序列，并在3’端含有寡核苷酸
          CCAATTAATTGGCGAGCTCGCC序列。
             PacI    XhoI
以寡核苷酸链：
UCP3(5’-TTGGCTGCAGCGGCTGAAGC-3’)
UCP4(5’-GGTTAATTAACCGCTCGAGCGGGTAAATATCAGGAATTGTTG-3’)
为引物，pXC-1 DNA为模板，得到PCR产物B。PCR产物B含有腺病毒从nt2592-3820的基因序列，并在5’端含有寡核苷酸
     GGTTAATTAACCGCTCGAGCGG序列。
        PacI     XhoI
由此可见，PCR产物A的3’端含有与PCR产物B的5’端互补的22个寡核苷酸序列。将PCR产物A与PCR产物B混合在一起，100C变性5分钟，然后缓慢降温复性。复性后有大约10％-20％左右的PCR产物A的正链与PCR产物B的副链，通过22个互补寡核苷酸序列而互联成为PCR产物A+B。加入Taq DNA多聚酶(购于美国Promega公司)，在37C条件下补平PCR产物A+B。
以寡核苷酸UCP1与UCP3为引物，PCR产物A+B为模板，得到PCR产物C。以AflII和HpaI消化PCR产物C，并将其与同样的方式消化后的pXC-1连接，得到新的质粒pXC-Δ1651。pXC-Δ1651含有从nt1651-2591的缺失突变，缺失部分包括内源性E1B启动子，E1B19K基因和5’端E1B 55K基因，并在E1B基因缺失部位插入寡核苷酸GGTTAATTAACCGCTCGAGCGG序列。PacI     XhoI
B.质粒pXC-Δ1714的构建
为了在质粒pXC-1上构建缺失nt1714-2591的突变体，以寡核苷酸链
UCP1(5’-TGAGACGCCCGACATCACCT-3’)
UCP5(5’-CCGCTCGAGCGGTTAATTAACCGAGGTCAGATGTAACCAAGA-3’)
           XhoI   PacI
为引物，pXC-1 DNA为模板，得到PCR产物D。PCR产物D含有腺病毒从nt1316-1713的基因序列，并在3’端含有寡核苷酸
    CCAATTAATTGGCGAGCTCGCC序列。
       PacI   XhoI
以寡核苷酸链：
UCP3(5’-TTGGCTGCAGCGGCTGAAGC-3’)
UCP4(5’-GGTTAATTAACCGCTCGAGCGGGTAAATATCAGGAATTGTTG-3’)
           PacI      XhoI
为引物，pXC-1 DNA为模板，得到PCR产物B。PCR产物B含有腺病毒从nt2592-3820的基因序列，并在5’端含有寡核苷酸
  GGTTAATTAACCGCTCGAGCGG序列。
     PacI    XhoI
PCR产物D的3’端含有与PCR产物B的5’端互补的22个寡核苷酸序列。将PCR产物D与PCR产物B混合在一起，100℃变性5分钟，然后缓慢降温复性。复性后有大约10％-20％左右的PCR产物D的正链与PCR产物B的副链，通过22个互补寡核苷酸序列而互联成为PCR产物D+B。加入Taq NDA多聚酶(购于美国Promega公司)，在37C条件下补平PCR产物D+B。以寡核苷酸UCP1与UCP3为引物，PCR产物D+B为模板，进行第二次PCR反应，得到PCR产物E。以AflII和HpaI消化PCR产物E，并将其与同样的方式消化后的pXC-1相连接，得到新的质粒pXC-Δ1714。pXC-Δ1714含有从nt1714-2591的缺失突变，缺失部分包括E1B19K基因和5’端E1B 55K基因，但保留内源性E1B启动子序列，并在E1B基因缺失部位插入寡核苷酸GGTTAATTAACCGCTCGAGCGG序列。
            PacI    XhoI
C.质粒pXC-Δ2251的构建
为了在质粒pXC-1上构建缺失nt2251-3509的突变体，以寡核苷酸链
UCP1(5’-TGAGACGCCCGACATCACCT-3’)
UCP13(5’-CCGCTCGAGCGGTTAATTAACCCAACATTCATTCCCGAGGGT-3’)
            XhoI    PacI
为引物，pXC-1 DNA为模板，得到PCR产物L。PCR产物L含有腺病毒从nt1316-2250的基因序列，并在3’端含有寡核苷酸
CCAATTAATTGGCGAGCTCGCC序列。
   PacI    XhoI
以寡核苷酸链：
UCP3(5’-TTGGCTGCAGCGGCTGAAGC-3’)
UCP14(5’-GGTTAATTAACCGCTCGAGCGGGGTACTGAAATGTGTGGGCG-3’)
                  PacI        XhoI
为引物，pXC-1 DNA为模板，得到PCR产物M。PCR产物M含有腺病毒从nt3510-3820的基因序列，并在5’端含有寡核苷酸
     GGTTAATTAACCGCTCGAGCGG序列。
       PacI     XhoI
PCR产物L的3’端含有与PCR产物M的5’端互补的22个寡核苷酸序列。将PCR产物L与PCR产物M混合在一起，100℃变性5分钟，然后缓慢降温复性。复性后有大约10％-20％左右的PCR产物L的正链与PCR产物M的副链， 通过22个互补寡核苷酸序列而互联成为PCR产物L+M。加入Taq NDA多聚酶(购于美国Promega公司)，在37℃条件下补平PCR产物L+M。以寡核苷酸UCP1与UCP3为引物，PCR产物L+M为模板，进行第二次PCR反应，得到PCR产物N。以AflII和HpaI消化PCR产物N，并将其与同样的方式消化后的pXC-1相连接，得到新的质粒pXC-Δ2251。pXC-Δ2251含有从nt2251-3509的缺失突变，缺失部分包括E1B 55K基因，但保留内源性E1B启动子序列和E1B 19K基因，并在E1B 55K基因缺失部位插入寡核苷酸GGTTAATTAACCGCTCGAGCGG序列。
                      PacI        XhoI
实施例2.转基因E1B基因突变体的构建
A.质粒pXC-Δ1651/GM-CSF的构建
以寡核苷酸链：
UCP5(5’-CGCGGATCCGCGATGTGGCTGCAGAGCCTGCT-3’)
                   BamHI
UCP6(5’-CCGGAATTCCCCTCACTCCGGACTGGCTCCC-3’)
                  EcoRI
为引物，以质粒PGT60hGM-CSF(购于美国Invivogen公司)为模板，获得PCR产物F。PCR产物F含有完整的人源性GM-CSF基因序列，并在5’端和3’端含有BamHI和EcoRI的酶切位点。以EcoRI和BamHI消化PCR产物F，并插入到同样位点的质粒pcDNA3(购于美国Invitrogen公司)上，获得新的重组质粒pcDNA3-GM-CSF。
以寡核苷酸链：
UCP7(5’-CCTTAATTAAGGGTTGACATTGATTATTGACT-3’)
             PacI
UCP8(5’-CCTTAATTAAGGATGCAATTTCCTCATTTTATT-3’)
             PacI
为引物，以质粒pcDNA3-GM-CSF为模板，获得PCR产物G。PCR产物G含有CMV早期启动子，人源性GM-CSF基因序列和牛生长荷尔蒙(BGH)聚腺苷酸信号，并在PCR产物G的两端含有PacI酶切位点。以PacI消化PCR产物G，并连接到相同位点的pXC-Δ1651上获得新的重组质粒pXC-Δ1651/GM-CSF。质粒pXC-Δ1651/GM-CSF缺失内源性EiB启动子序列、E1B 19K基因序列和5’端E1B 55K基因，但含有人源性GM-CSF基因序列，并在GM-CSF基因的上游含有CMV早期启动子，在GM-CSF基因的下游含有BGH聚腺苷酸序列。
B.质粒pXC-Δ1714/GM-CSF的构建
以同样的方法获得PCR产物G，并以PacI消化PCR产物G，连接到相同位点的pXC-Δ1714上获得新的重组质粒pXC-Δ1714/GM-CSF。质粒pXC-Δ1714/GM-CSF缺失E1B 19K基因序列和5’端E1B 55K基因，但保留内源性E1B启动子序列。在E1B基因缺失突变部位插入人源性GM-CSF基因序列，并在GM-CSF基因的上游含有CMV早期启动子，GM-CSF基因的下游含有BGH聚腺苷酸序列。
C.质粒pXC-Δ1651/TK的构建
以寡核苷酸链：
UCP9(5’
-CCGCTCGAGCGGATGGCCTCGTACCCCGGCCA-3’)
           XhoI
UCP10(5’
-CTAGTCTAGACTAGTCAGTTAGCCTCCCCCATCT-3’)
             XbaI为引物，以质粒PGT60hGM-CSF为模板，获得PCR产物H。PCR产物H含有HSV TK基因序列，在PCR产物H的5’端含有XhoI位点，3’端含有XhaI位点，以XhoI和XbaI消化PCR产物H，并U插入到pcDNA3的相同位点获得新的质粒pcDNA3-TK。以寡核苷酸链：
CP7(5’-CCTTAATTAAGGGTTGACATTGATTATTGACT-3’)
            PacI
UCP8(5’-CCTTAATTAAGGATGCAATTTCCTCATTTTATT-3’)
            PacI
为引物，以质粒pcDNA3-TK为模板，获得PCR产物I。PCR产物I含有CMV早期启动子，HSV-TK基因序列和牛生长荷尔蒙(BGH)聚腺苷酸信号，并在PCR产物I的两端含有PacI酶切位点。以PacI消化PCR产物I，并连接到相同位点的pXC-Δ1651上获得新的重组质粒pXC-Δ1651/TK。质粒pXC-Δ1651/TK缺失内源性E1B启动子序列、E1B 19K基因序列和5’端E1B 55K基因，但含有HSV-TK基因序列，并在HSV-TK基因的上游含有CMV早期启动子，在HSV-TK基因的下游含有BGH聚腺苷酸序列。
D.质粒pXC-Δ1714/TK的构建
以同样的方法  获得PCR产物I，并以PacI消化PCR产物I，连接到相同位点的pXC-Δ1714上获得新的重组质粒pXC-Δ1714/TK。质粒pXC-Δ1714/TK缺失E1B 19K基因序列和5’端E1B 55K基因，但保留内源性E1B启动子序列。在E1B基因缺失突变部位插入HSV-TK基因序列，并在HSV-TK基因的上游含有CMV早期启动子，HSV-TK基因的下游含有BGH聚腺苷酸序列。
E.质粒pXC-Δ1651/GM-CSF/TK的构建
以XhoI和XbaI消化质粒pcDNA-TK获得HSV TK基因，并将HSVTK基因插入到相同位点的pcDNA-GM-CSF获得新的质粒pcDNA-CSF-TK。以寡核苷酸链：
UCP11(5’-GACGTCGACTAATTCCGGTTATTTTCCA-3’)
              SalI
UCP12(5’-GACGTCGACATCGTGTTTTTCAAAGGAA-3’)
             SalI
为引物，以质粒PCITE-3a(+)(购于美国Novagen公司)为模板，获得PCR产物J。PCR产物J含有脑心肌炎病毒(EMCV)的内部核糖体进入位点序列，并在PCR产物J的两端含有内切酶SalI位点。以SalI消化PCR产物J，并插入到pcDNA-CSF-TK的XboI位点的，获得新的质粒pcDNA-GM-CSF/TK。以寡核苷酸链：
UCP7(5’-CCTTAATTAAGGGTTGACATTGATTATTGACT-3’)
            PacI
UCP8(5’-CCTTAATTAAGGATGCAATTTCCTCATTTTATT-3’)
            PacI
为引物，以质粒pcDNA-CSF/TK为模板，获得PCR产物K。PCR产物K含有CMV早期启动子，人源性hGM-CSF基因序列，HSV-TK序列和牛生长荷尔蒙(BGH)聚腺苷酸信号，在人源性GM-CSF基因序列和HSV-TK序列之间由脑心肌类病毒内部核糖体进入位点有效连接。以PacI消化PCR产物K，并连接到相同位点的pXC-Δ1651上获得新的重组质粒pXC-Δ1651/GM-CSF/TK。质粒pXC-Δ1651/GM-CSF/TK缺失内源性E1B启动子序列、E1B 19K基因序列和5’端E1B 55K基因，但含有人源性hGM-CSF基因序列，HSV-TK序列和牛生长荷尔蒙(BGH)聚腺苷酸信号，并在人源性GM-CSF基因序列和HSV-TK序列之间由脑心肌类病毒内部核糖体进入位点有效连接，并在GM-CSF基因的上游含有CMV早期启动子，在HSV TK基因的下游含有BGH聚腺苷酸序列。
F.质粒pXC-Δ1714/GM-CSF/TK的构建
以同样的方法获得PCR产物K，并以PacI消化PCR产物K，连接到相同位点的pXC-Δ1714上获得新的重组质粒pXC-Δ1714/GM-CSF/TK。质粒pXC-Δ1714/GM-CSF/TK缺失E1B 19K基因序列和5’端E1B 55K基因，保留内源性E1B启动子序列，并含有人源性GM-CSF基因序列，HSV-TK序列和牛生长荷尔蒙(BGH)聚腺苷酸信号，在人源性GM-CSF基因序列和HSV-TK序列之间由脑心肌类病毒内部核糖体进入位点有效连接，并在GM-CSF基因的上游含有CMV早期启动子，在HSVTK基因的下游含有BGH聚腺苷酸序列。
G.质粒pXC-Δ2251/GM-CSF/TK的构建
以同样的方法获得PCR产物K，并以PacI消化PCR产物K，连接到相同位点的pXC-Δ2251上获得新的重组质粒pXC-Δ2251/GM-CSF/TK。质粒pXC-Δ2251/GM-CSF/TK缺失E1B 55K基因，保留内源性E1B启动子序列和E1B 19K基因，并含有人源性GM-CSF基因序列，HSV-TK序列和牛生长荷尔蒙(BGH)聚腺苷酸信号，在人源性GM-CSF基因序列和HSV-TK序列之间由脑心肌类病毒内部核糖体进入位点有效连接，并在GM-CSF基因的上游含有CMV早期启动子，在HSVTK基因的下游含有BGH聚腺苷酸序列。
实施例3.重组腺病毒的产生
A.Δ1651腺病毒的产生
pBHGE3购于加拿大Microbix Biosystems Inc。pBHGE3含有Ad5基因序列但E1区从nt188到1339缺失。pBHGE3本身不具有感染性，但pXC-1或从PXC-1衍生出来的质粒与pBHG-E3共转染293细胞，通过同源重组能产生具有感染的病毒(详细实验步骤参照Hitt，Constructionand Propagation of Human Adenovirus Vectors，In：Cell Biology：ALaboratory Handbook，J.Celis，Academic Press，NY，1995，或参考Graham，Adenovirus Based Expression Vectors and RecombinantVaccines，In：Vaccines：New Approaches to Immunological Problems。R.W.Eliss，Butterworth，pp363-390，1992)。Δ1651腺病毒由质粒pXC-Δ1651与质粒pBHGE3共转染293细胞，通过同源重组的方法获得。挑出单一的噬斑，并在293细胞中扩增。病毒DNA通过Qiagen血液试剂盒(购于美国Qiagen公司)获得，用PCR筛选确认。Δ1651腺病毒缺失了nt 1651-2591部分，缺失部分包括内源性E1B启动子，E1B19K基因和E1B 55K基因的大部分，Δ1651腺病毒不能编码E1B 19K蛋白和E1B55K蛋白。
B.Δ1714腺病毒的产生
Δ1714腺病毒由质粒pXC-Δ1714与质粒pBHGE3共转染293细胞，通过同源重组的方法获得。挑出单一的噬斑，并在293细胞中扩增，病毒DNA通过Qiagen血液试剂盒获得，用PCR筛选确认。Δ1714腺病毒缺失了nt 1714-2591部分，缺失部分包括E1B19K基因和E1B 55K基因的大部分，但保留内源性E1B启动子，Δ1714腺病毒不能编码E1B 19K蛋白和E1B 55K蛋白。
C.Δ1651/GM-CSF腺病毒的产生
Δ1651/GM-CSF腺病毒由质粒pXC-Δ1651/GM-CSF与质粒pBHGE3共转染293细胞，通过同源重组的方法获得。挑出单一的噬斑，并在293细胞中扩增，病毒DNA通过Qiagen血液试剂盒获得，用PCR筛选确认。Δ1651/GM-CSF腺病毒不能编码E1B 19K蛋白和E1B 55K蛋白，并携带由CMV早期启动子调控的GM-CSF基因。
D.Δ1651/TK腺病毒的产生
Δ1651/TK腺病毒由质粒pXC-Δ1651/TK与质粒pBHGE3共转染293细胞，通过同源重组的方法获得。挑出单一的噬斑，并在293细胞中扩增，病毒DNA通过Qiagen血液试剂盒获得，用PCR筛选确认。Δ1651/TK腺病毒不能编码E1B 19K蛋白和E1B 55K蛋白，并携带由CMV早期启动子调控的TK基因。
E.Δ1714/GM-CSF腺病毒的产生
Δ1714/GM-CSF腺病毒由质粒pXC-Δ1714/GM-CSF与质粒pBHGE3共转染293细胞，通过同源重组的方法获得。挑出单一的噬斑，并在293细胞中扩增，病毒DNA通过Qiagen血液试剂盒获得，用PCR筛选确认。Δ1714/GM-CSF腺病毒不能编码E1B 19K蛋白和E1B 55K蛋白，但保留内源性E1B启动子，并携带由CMV早期启动子调控的GM-CSF基因。
F.Δ1714/TK腺病毒的产生
Δ1714/TK腺病毒由质粒pXC-Δ1714/TK与质粒pBHGE3共转染293细胞，通过同源重组的方法获得。挑出单一的噬斑，并在293细胞中扩增，病毒DNA通过Qiagen血液试剂盒获得，用PCR筛选确认。Δ1714/TK腺病毒不能编码E1B 19K蛋白和E1B 55K蛋白，但保留内源性E1B启动子，并携带由CMV早期启动子调控的HSV TK基因。
G.Δ1651/GM-CSF/TK腺病毒的产生
Δ1651/GM-CSF/TK腺病毒由质粒pXC-Δ1651/GM-CSF/TK与质粒pBHGE3共转染293细胞，通过同源重组的方法获得。挑出单一的噬斑，并在293细胞中扩增，病毒DNA通过Qiagen血液试剂盒获得，用PCR筛选确认。Δ1651/GM-CSF/TK腺病毒不能编码E1B 19K蛋白和E1B 55K蛋白，并携带由CMV早期启动子调控的GM-CSF基因和HSV TK基因，它们通过脑心肌炎病毒(EMCV)内部核糖体进入位点序列有效连接。
H.Δ1714/GM-CSF/TK腺病毒的产生
Δ1714/GM-CSF/TK腺病毒由质粒pXC-Δ1714/GM-CSF/TK与质粒pBHGE3共转染293细胞，通过同源重组的方法获得。挑出单一的噬斑，并在293细胞中扩增，病毒DNA通过Qiagen血液试剂盒获得，用PCR筛选确认。Δ1714/GM-CSF/TK腺病毒不能编码E1B 19K蛋白和E1B 55K蛋白，但保留内源性E1B启动子，并携带由CMV早期启动子调控的GM-CSF基因和HSV TK基因，它们通过脑心肌炎病毒(EMCV)内部核糖体进入位点序列有效连接。
I.Δ2251/GM-CSF/TK腺病毒的产生
Δ2251/GM-CSF/TK腺病毒由质粒pXC-Δ2251/GM-CSF/TK与质粒pBHGE3共转染293细胞，通过同源重组的方法获得。挑出单一的噬斑，并在293细胞中扩增，病毒DNA通过Qiagen血液试剂盒获得，用PCR筛选确认。Δ2251/GM-CSF/TK腺病毒不能编码E1B 55K蛋白，但保留内源性E1B启动子和E1B 19K蛋白，并携带由CMV早期启动子调控的GM-CSF基因和HSV TK基因，它们通过脑心肌炎病毒(EMCV)内部核糖体进入位点序列有效连接。
实施例4.噬斑法检测重组腺病毒的复制能力
为了比较本发明中的重组腺病毒在肿瘤细胞和正常细胞内的复制能力，同等剂量的重组腺病毒和野生型腺病毒(1 MOI)分别感染正常细胞--人微管内细胞MVEC(购于美国Clonetics公司)，宫颈癌细胞(C33A，P53突变型，购于美国ATCC公司)，肝癌细胞(Hep3B，P53突变型，购于美国ATCC公司)和前列腺癌细胞(LNCaP，P53正常型，购于美国ATCC公司)。48小时后，将细胞冻融三次释放病毒，通过噬斑法在HEK293细胞内测定病毒滴度[详细实验步骤参照Heise等自然医学(Nature Medicine)，3(6)：639-645]。重组腺病毒在不同细胞株内的滴度与野生型病毒在同一细胞内的滴度相比较，其比率可用来评估病毒复制的有效性，以及对肿瘤细胞的选择性。例如，当比率小于100，表明重组腺病毒在其细胞株内的复制能力小于野生型腺病毒，相反，当比率大于100时，则表明此病毒在其细胞株内的复制能力大于野生腺病毒。由表1所见，Δ1651腺病毒、Δ1715腺病毒、Δ1651/GM-CSF腺病毒、Δ1773/GM-CSF腺病毒、Δ1651/TK腺病毒、Δ1773/TK腺病毒、Δ1651/GM-CSF/TK腺病毒、Δ1773/GM-CSF/TK腺病毒与野生型腺病毒在肿瘤细胞C33A，HeP3B、LNCaP中的比率均超过150％，表明同时灭活E1B 19K蛋白和E1B 55K蛋白的重组腺病毒在P53突变型和P53正常型的肿瘤细胞内的复制能力强于野生型腺病毒。而这些重组腺病毒与野生型腺病毒在正常细胞MVEC内的比率为0.2％左右，表明这类重组腺病毒在MVEV内的复制能力远远低于野生型腺病毒。比较这些重组腺病毒在肿瘤细胞和正常细胞内的复制能力，也能进一步表明这些重组腺病毒能选择性地在P53突变型和P53正常型的肿瘤细胞内复制，他们在肿瘤细胞内的复制能力高于在正常细胞内1000倍以上。
表1.噬斑法检测重组腺病毒在肿瘤细胞内的复制能力

实施例5.细胞致病效应实验
重组腺病毒和野生型腺病毒分别以20 MOI的剂量感染正常细胞，包括人微管内皮细(MVEC)，乳腺上皮细胞(MEC)，纤维细胞(HS68)，以上正常细胞均购于美国Clonetics公司，P53基因突变型的肿瘤细胞，包括宫颈癌细胞(C33A)，结肠癌细胞(SW620)，结肠癌细胞(HT29)，肺癌细胞(NCI-H128)，肝癌细胞(Hep3B)，卵巢癌细胞(OVCAR3)，P53基因正常型肿瘤细胞，包括前列腺癌(LNCaP)，乳腺癌(MCF7)，宫颈癌细胞(Hela)，黑色素瘤细胞(SP6)，肝癌细胞(Hep G2)，胰腺癌细胞(PANC-1)，以上肿瘤细胞株均购于美国ATCC公司(见表2)。感染后3天以显微镜法检查细胞致病效应(CPE)。(+)或(-)表明存在或缺乏致病效应(CPE)。由表2结果可知，野生型腺病毒对正常细胞和肿瘤细胞均产生致病效应(CPE)，而Δ1651腺病毒和Δ1651/GM-CSF/TK腺病毒对几乎所有的P53基因突变型和P53基因正常型肿瘤细胞，均产生致病效应(CPE)，但对正常细胞不产生致病效应。此结果进一步说明了同时灭活E1B 19K蛋白和E1B 55K蛋白的重组腺病毒能选择性地杀死P53功能正常型和P53功能缺陷型肿瘤细胞。但对正常细胞基本上无伤害作用。
表2.重组腺病毒和野生型腺病毒对正常细胞和肿瘤细胞的致病效应(CPE)
细胞株                                           致病效应(CPE)
正常细胞                    野生型腺病毒         Δ1651腺病毒       Δ
1651/GM-CSF/TK腺病毒
人微管内皮细(MVEC)          +                    -                  -
乳腺上皮细胞(MEC)           +                    -                  -
纤维细胞(HS68)              +                    -                  -
淋巴细胞(Lymphocytes)       +                    -                  -
P53基因突变型肿瘤细胞
宫颈癌细胞(C33A)            +                    +                  +
结肠癌细胞(SW620)           +                    +                  +
结肠癌细胞(HT29)            +                    +                  +
肺癌细胞(NCI-H128)          +                    +                  +
肝癌细胞(Hep3B)             +                    +                  +
卵巢癌细胞(OVCAR3)          +                    +                  +
P53基因正常型肿瘤细胞
前列腺癌(LNCaP)             +                    +                  +
乳腺癌(MCF7)                +                    +                  +
宫颈癌细胞(Hela)            +                    +                  +
黑色素瘤细胞(SP6)           +                    +                  +
肝癌细胞(Hep G2)            +                    +                  +
实施例6.表达粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的腺病毒
Δ1651腺病毒、Δ1651/GM-CSF腺病毒、Δ1651/TK腺病毒，Δ1651/GM-CSF/TK和Δ2251/GM-CSF/TK腺病毒分别以10MOI的剂量感染293细胞和C33A细胞。感染二天后，观察到腺病毒引起90％以上细胞致病作用(CPE)。收获被感染的293细胞和C33A细胞，快速离心除去细胞碎片，用ELISA方法检测粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(购于美国R&D System公司)的表达水平。其测检步骤按照厂家的要求进行。由图2所示，含有粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子基因表达盒的Δ1651/GM-CSF腺病毒，Δ1651/GM-CSF/TK腺病毒和Δ2251/GM-CSF/TK腺病毒均能高效表达粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子，其中Δ1651/GM-CSF，Δ1651/GM-CSF/TK和Δ2251/GM-CSF/TK在293细胞内表达粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子的水平分别为1000ng/ml，1250ng/ml和500ng/ml(1ml含有1×10⁵细胞)，在C33A细胞中的表达剂量分别为1100ng/ml，1300ng/ml和550ng/ml。而不含有粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子基因的Δ1651腺病毒和Δ1651/TK腺病毒未能检查出任何粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子。腺病毒Δ1651/GM-CSF和Δ1651/GM-CSF/TK表达粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子的水平基本相似，表明Δ1651/GM-CSF/TK内的第二组外源性基因HSV TK并未影响第一组基因粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子的表达。
实施例7.药物前体GCV对重组腺病毒的细胞致病效应的影响
肝癌细胞株Hep3B(P53基因突变型)以2×10000细胞/孔的数量种到96孔细胞板，37C培养过夜。第二天，Δ1651/TK腺病毒和Δ1651/GM-CSF/TK腺病毒分别以0.001MOI剂量感染HeP3B。感染后72小时，将含有或不含有药物前体GCV(购于美国Sigma公司)的新鲜细胞培养液加入到96孔板中，继续培养96小时，由MTT方法测定细胞的成活率[详细实验步骤参照Kodama等抗病毒研究(Antiviral Res)199631(3)：159-164]。在不含有GCV的培养条件下，Δ1651/TK腺病毒和Δ1651/GM-CSF/TK腺病毒以0.001MOI剂量感染HeP3B细胞，HeP3B细胞的成活率分别为71％和68％。在含有GCV的培养条件下，以同样剂量的病毒感染，HeP3B细胞的成活率明显降低，且与GCV浓度呈正比。由图3所见，当Δ1651/TK腺病毒和Δ1651/GM-CSF/TK腺病毒的感染剂量为0.001MOI时，GCV的IC5O为0.02ug/ml，当GCV浓度为1ug/ml时，0.001MOI的Δ1651/TK腺病毒或Δ1651/GM-CSF/TK腺病毒能杀伤99％的HeP3B细胞。由此可见，Δ1651/TK腺病毒和Δ1651/GM-CSF/TK腺病毒均能高效表达HSV-TK基因产物，并在药物前体GCV的诱导下，进一步加强了腺病毒对肿瘤细胞的细胞致病效应。
比较腺病毒Δ1651/GM-CSF和Δ1651/GM-CSF/TK在药物前提GCV的存在下的细胞致病效应曲线，表明两组重组腺病毒表达HSV TK产物的水平基本相似。由于Δ1651/GM-CSF/TK中的HSV TK基因是由脑心肌类病毒的内部核糖体进入位点控制翻译，本实验表明通过内部核糖体进入位点而有效连接的两组外源性基因组，其中第二组外源性基因能在内部核糖体进入位点的调控下高效表达。
实施例8.动物实验I
将LNCaP细胞(P53基因正常型)以1×10⁶细胞/鼠的剂量，皮下注射到雄性无胸腺的裸鼠颈背部。当肿瘤瘤体达到300mm³左右，将带有肿瘤的裸鼠分别分为4组(每组共含六个以上的裸鼠)，第一组为阴性对照，直接注入含有10％甘油的PBS溶液，第二组裸鼠接受Δ1651的直接肿瘤注射，第三组接受Δ1651/TK的直接肿瘤注射，第四组接受Δ1651/GM-CSF/TK的直接肿瘤注射，其各病毒的注射量为10⁹颗粒/mm3。每周测量肿瘤的生产情况，连续记录六周，其结果列于图4(LNCaP肿瘤)。由图4所见，接受注射Δ1651、Δ165 /TK和Δ1651/GM-CSF/TK一周后，裸鼠的LNCaP肿瘤瘤体开始缩小，给药后的六周，肿瘤均缩小至注射前瘤体体积的5％左右，肿瘤几乎完全消失。而阴性对照组的肿瘤体积持续增大，六周后是原肿瘤体积近四倍。本实验表明，本发明中的重组腺病毒具有超强的抗肿瘤效应，  单一疗程的注射能彻底治愈患有前列腺癌的裸鼠。
实施例9.动物实验II
将LNCaP细胞(P53基因正常型)以1×10⁶细胞/鼠的剂量，皮下注射到雄性无胸腺的裸鼠颈背部。当肿瘤瘤体达到300mm³左右，将带有肿瘤的裸鼠分别分为4组(每组共含六个以上的裸鼠)。裸鼠除接受病毒的直接肿瘤注射外，同时还接受前体药物GCV的腹腔内注射。由图5所示，此动物实验分为四组，第一组为阴性对照，接受10％甘油的PBS溶液注射，第二组接受Δ1651和GCV的注射，第三组接受Δ1651/TK和GCV的注射，第四组接受Δ1651/GM-CSF/TK和GCV的注射。病毒的注射剂量为1×10⁷颗粒数/mm³，GCV的注射剂量为60mg/Kg，连续注射6天。由图5可见，治疗6周后，接受Δ1651与GCV注射的裸鼠肿瘤瘤体为原肿瘤瘤体的103％。而接受Δ1651/TK和GCV，Δ1651/GM-CSF/TK和GCV注射的裸鼠肿瘤瘤体显著缩小，分别是原肿瘤体积的6.8％和8.7％。由此可见，Δ1651/TK和Δ1651/GM-CSF/TK内的HSV TK基因能高效表达，并能通过前体药GCV，极大地加强了腺病毒的抗肿瘤效应。
实施例10.腺病毒的最大耐受量实验
8周大的雄性小白鼠(各组为4只)接受大剂量重组腺病毒的直接静脉注射，观察大剂量腺病毒进入小鼠体内所产生的毒副反应，以确定腺病毒在小白鼠体内的最大耐受剂量(MTD)。重组腺病毒Δ1651，Δ1651/GM-CSF/TK，含有及不含有E3区基因的野生型腺病毒Wt/E3和Wt/E3^-以1×10¹¹颗粒/鼠，2×10¹¹颗粒/鼠，3×10¹¹颗粒/鼠静脉的剂量注射到小白鼠体内，观察各组小白鼠的死亡率以确定腺病毒的最大耐受量(表3)。由表3所示，3×10¹¹颗粒/鼠的Δ1651，Δ1651/GM-CSF/TK和Wt/E3静脉注射到小白鼠体内，不会引起小白鼠死亡，表明它们在小白鼠体内的最大耐受剂量至少为3×10¹¹颗粒，而wt/E3^-进入小白鼠体内的最大耐受量为1×10¹¹颗粒/鼠。本动物实验证明E3区基因产物能降低腺病毒进入宿主体内的毒副反应，并提高腺病毒的最大耐受剂量。
表3.腺病毒的最大耐受量实验