一种聚乳酸羟基乙酸/腺病毒复合纳米纤维支架材料、制备方法及其应用.pdf

一种聚乳酸-羟基乙酸/腺病毒复合纳米纤维支架材料、制备方法及其在骨修复方面的应用，属于骨修复材料技术领域。将PLGA溶于三氯甲烷与N,N-二甲基甲酰胺中，在常温下利用高压静电纺丝装置制得纳米纺丝架材料。以1M蔗糖为最终浓度制得腺病毒冷冻保护剂。将蔗糖/病毒溶液涂布于PLGA纳米纺丝支架表面，经预冻和冷冻干燥后得到PLGA/蔗糖-腺病毒复合体。这种PLGA/蔗糖-腺病毒载基因复合纳米纤维支架材料具有良好的生物相容性，并具有较好的生物降解性；其可通过将腺病毒局限在PLGA表面，使单位面积细胞接触的病毒浓度增高，增加感染效率；并能良好保存病毒活性，可以进行一次操作长时间保存。

1.  一种聚乳酸-羟基乙酸/腺病毒复合纳米纤维支架材料的制备方法，其步骤如下：
a)制备质量体积分数为0.2～0.4g/mL的聚乳酸-羟基乙酸溶液，溶剂为三氯甲烷与N,N-二甲基甲酰胺的混合，混合溶剂中三氯甲烷的体积含量为30～50％，然后在20～30℃条件下磁力搅拌4～8小时直至得到透明溶液；
b)将步骤a)溶液采用高压静电纺丝装置进行纺丝，然后将纺丝产物在20～30℃条件下真空干燥，即得到聚乳酸-羟基乙酸纳米纤维支架材料；
c)将聚乳酸-羟基乙酸纳米纤维支架材料裁剪成直径5mm～3cm的圆片，圆片正反面分别进行紫外线照射消毒；
d)取8.55g蔗糖晶体，溶于20mL纯水中，经过带有微孔滤膜的注射滤器抽滤除菌，得到1.25M蔗糖溶液；再取浓度为2×10¹⁰～2×10¹²VP/mL的腺病毒原体与1.25M蔗糖溶液以体积比1：4混合，得到蔗糖/腺病毒溶液；
e)取10～20μL蔗糖/腺病毒溶液滴加于步骤c)得到的聚乳酸-羟基乙酸纳米纤维支架材料圆片的一侧表面上；在-60～-80℃下预冻20～30h，然后在-60～-80℃的真空冷冻干燥机中冻干20～30h，获得聚乳酸-羟基乙酸/腺病毒复合纳米纤维支架材料。

2.  如权利要求1所述的一种聚乳酸-羟基乙酸/腺病毒复合纳米纤维支架材料的制备方法，其特征在于：高压静电纺丝装置的纺丝电压为15～25kv，正负电极间的距离为10～20cm，正极是静电纺丝装置的喷口，负极为接地的金属滚轴，正负电压使纺丝液在喷口处的流速为0.5mL/h～1.5mL/h；金属滚轴的直径为10～20cm，长度为20～30cm，金属滚轴表面覆盖锡箔纸，锡箔纸用于承接纺丝产物；喷口的直径为0.2～0.4mm，所得纺丝产物的直径范围为100～200nm。

3.  如权利要求1所述的一种聚乳酸-羟基乙酸/腺病毒复合纳米纤维支架材料的制备方法，其特征在于：聚乳酸-羟基乙酸中，聚乳酸的质量百分含量为30～80％。

4.  如权利要求3所述的一种聚乳酸-羟基乙酸/腺病毒复合纳米纤维支架的制 备方法，其特征在于：聚乳酸-羟基乙酸中，聚乳酸的质量百分含量为50％。

5.  如权利要求1所述的一种聚乳酸-羟基乙酸/腺病毒复合纳米纤维支架材料的制备方法，其特征在于：紫外线照射消毒的功率为8～10W、波长为250nm～260nm、照射时间20～30分钟。

6.  一种聚乳酸-羟基乙酸/腺病毒复合纳米纤维支架材料，其特征在于：由权利要求1～5任何一项所述的方法制备得到。

7.  权利要求6所述的一种聚乳酸-羟基乙酸/腺病毒复合纳米纤维支架材料在骨修复方面的应用。

一种聚乳酸-羟基乙酸/腺病毒复合纳米纤维支架材料、制备方法及其应用
技术领域
本发明属于骨修复材料技术领域，具体涉及一种聚乳酸-羟基乙酸(PLGA)/腺病毒(Ad)复合纳米纤维支架材料、制备方法及其在骨修复方面的应用。
背景技术
目前治疗骨缺损的方法有组织工程科学、骨及骨替代物移植及药物治疗等方法。其中，骨及骨替代物移植会产生创伤较大及骨整合不理想等问题，药物治疗中应用辛伐他汀、双磷酸盐等效果并不理想。而组织工程科学可以通过支架材料、生长因子及细胞成为一类可期待的方法。
纳米纤维支架直径为纳米级，表面积大，因而具有独特的小尺寸效应和表面效应。另一方面由于其类似于天然细胞外基质，有利于细胞黏附，进而促进细胞增殖及分化，而被广泛应用。但是现阶段研究显示：体内局部细胞不足，单纯的纳米纤维支架促进骨形成的能力有限。因此，需要生长因子或细胞与纳米纤维支架复合。外源细胞引入具有引起机体适应性免疫反应及细胞不能成活等缺点。而促红细胞生成素(EPO)可促进内皮祖细胞(EPCs)迁移、促进培养的人间充质干细胞(MSCs)趋化。并能通过增加间充质干细胞的趋性、迁移性，激活基质金属蛋白酶，促进局部血管的形成，为骨再生提供良好的微环境。蛋白类生长因子部分造价较高以及具有免疫原性，较难得到广泛应用。因此，可以应用负载生长因子基因的载体，通过转染自体细胞原位表达相应生长因子以达到治疗目标。编码EPO基因的腺病毒Ad-EPO能够在体外促进大鼠骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化。但是，单纯在骨缺损处应用病毒不仅会使病毒随体液扩散，降低病毒浓度，还有可能造成异位感染。目前的解决方法是利用生物材料将病毒固定于应用部位。例如：将病毒混入静电纺丝溶液中，通过高压静电纺丝装置将病毒与纳米纤维共纺。其缺点在于高压及有机溶剂会降低病毒活力，而且由于静电纺丝时会损失部分溶液而使病毒不易定量，进而不能控制实际应用时的病毒剂量。这为Ad-EPO在体内应用促进骨缺损修复造成了困难。
发明内容
本发明的目的在于提供一种促进骨修复的复合纳米纤维支架材料及其制备方法和用途。通过制备聚乳酸-羟基乙酸纳米纤维支架与编码促红细胞生成素基因的腺病毒(Ad-EPO)结合，达到局部提高病毒浓度，使病毒原位感染细胞， 表达EPO，为骨再生提供一个良好的微环境。但是，由于EPO并不可见，所以较难确定处理方法对腺病毒的活性是否有损害，因此，需要一种直观的方法测定病毒活性。编码绿色荧光蛋白(EGFP)基因的腺病毒Ad-EGFP感染细胞使细胞表达EGFP，EGFP在荧光显微镜下可发绿光，可以直观的观察病毒的活性，同时，EGFP对细胞的增殖与分化不产生影响。因此，本发明采用Ad-EGFP在体外检测PLGA/腺病毒复合纳米纤维支架上病毒的活力及病毒释放。利用蔗糖作为冷冻保护剂，采用冷冻干燥法将PLGA与腺病毒复合。
本发明所述的聚乳酸-羟基乙酸/腺病毒复合纳米纤维支架材料(PLGA/Ad)，其直径为100～200nm，首先由静电纺丝法获得聚乳酸-羟基乙酸纳米纤维，然后利用冷冻干燥法将腺病毒固定于聚乳酸-羟基乙酸纳米纤维表面。
本发明所述的聚乳酸-羟基乙酸/腺病毒复合纳米纤维支架的制备方法，其步骤如下：
a)制备质量体积分数为0.2～0.4g/mL的聚乳酸-羟基乙酸溶液，溶剂为三氯甲烷与N,N-二甲基甲酰胺的混合，混合溶剂中三氯甲烷的体积含量为30～50％，然后在20～30℃条件下磁力搅拌4～8小时直至得到透明溶液；
b)将步骤a)溶液采用高压静电纺丝装置进行纺丝，然后将纺丝产物在20～30℃条件下真空干燥，即得到聚乳酸-羟基乙酸纳米纤维支架材料；
c)将聚乳酸-羟基乙酸纳米纤维支架材料裁剪成直径5mm～3cm的圆片，圆片正反面分别进行紫外线照射消毒(功率8～10W、波长250nm～260nm，照射时间20～30分钟)；
d)取8.55g蔗糖晶体，溶于20mL纯水中，经过带有微孔滤膜的注射滤器(0.22～0.45μm微孔滤膜)抽滤除菌，得到1.25M蔗糖溶液；再取浓度为2×10¹⁰～2×10¹²VP/mL的腺病毒原体与1.25M蔗糖溶液以体积比1：4混合，得到蔗糖/腺病毒溶液；
e)取10～20μL蔗糖/腺病毒溶液滴加于步骤c)得到的聚乳酸-羟基乙酸纳米纤维支架材料圆片的一侧表面上；在-60～-80℃下预冻20～30h，然后在-60～-80℃的真空冷冻干燥机中冻干20～30h，获得聚乳酸-羟基乙酸/腺病毒复合纳米纤维支架材料。
进一步的，所述的高压静电纺丝装置的纺丝电压为15～25kv，正负电极间的距离为10～20cm，正极是静电纺丝装置的喷口，负极为接地的金属滚轴，正 负电压使纺丝液在喷口处的流速为0.5mL/h～1.5mL/h；金属滚轴的直径为10～20cm，长度为20～30cm，金属滚轴表面覆盖锡箔纸，锡箔纸用于承接纺丝产物；喷口的直径为0.2～0.4mm，所得纺丝产物的直径范围为100～200nm。
聚乳酸-羟基乙酸(PLGA)中，聚乳酸的质量百分含量为30～80％，优选为50％。
本发明制备的聚乳酸-羟基乙酸/腺病毒复合纳米纤维支架主要应用于修复受损骨组织的再生。
本发明与现有技术相比，具有以下优点：
(1)本发明制备的聚乳酸-羟基乙酸纳米纤维支架，形貌类似于细胞外基质，利于细胞的粘附和生长；通过控制共混比例，反应温度，时间等因素来控制材料的物理化学性能以及降解速率，这种PLGA/Ad纳米纤维具有良好的生物相容性。
(2)制备后病毒活性保存良好，能够感染细胞表达相关蛋白。
(3)该制备方法简便可行，对设备无特殊要求并具有良好的经济效益。
附图说明
图1：实施例1制备的PLGA纳米纤维支架材料的扫描电镜图，其中PLGA的质量体积浓度为0.3g/mL，图1(a)的放大倍数为10000×，图1(b)的放大倍数为5000×；
图2：实施例3中的PLGA/Ad-EGFP复合纳米纤维支架的病毒存留曲线；
图3：实施例3中的PLGA/Ad-EGFP复合纳米纤维支架感染骨髓间充质干细胞的荧光显微镜图像。其中，A0、A1、A2、A3为Ad-EGFP感染BMMSCs后1,3,7,14天时照射的荧光显微镜图像；B0、B1、B2、B3为在﹣70℃保存1天后的PLGA/Ad-EGFP感染BMMSCs后1,3,7,14天时的荧光显微镜图像；C0、C1、C2、C3为在﹣70℃保存15天后的PLGA/Ad-EGFP感染BMMSCs后1,3,7,14天时的荧光显微镜图像；D0、D1、D2、D3为在﹣70℃保存28天后的PLGA/Ad-EGFP感染BMMSCs后1,3,7,14天时的荧光显微镜图像；
图4：实施例3中的PLGA/Ad-EPO复合纳米纤维支架体内成骨能力检测图——Micro-CT。其中，A1、A2为对照组在第4周及第8周时的Micro-CT图像；B1、B2为实验组在第4周及8周时的Micro-CT图像；a1、a2、b1和b2为应用IPP图像分析软件检测的A1、A2、B1和B2中愈合面积百分比的数据分析。*代表P＜0.05。
图5：实施例3中的PLGA/Ad-EPO复合纳米纤维支架体内成骨能力检测图 ——HE染色。其中，A1、A2为对照组在第4周及第8周时的HE染色图像；B1、B2为实验组在第4及8周时的HE染色图像，B3为B1中箭头处放大10倍的图像；B4为B2中箭头处放大10倍的图像。
具体实施方式
实施例1：
将3g的PLGA(购于sigma公司，相对分子量为3.6万)溶于10mL的三氯甲烷与N,N-二甲基甲酰胺的混合溶剂中(体积比为4：6)，磁力搅拌4小时后，得到PLGA的三氯甲烷与二甲基甲酰胺混合溶液；然后利用静电纺丝装置纺丝(电压为18KV，距离为14cm，纺丝液在喷口处的流速为0.5mL/h，金属滚轴的直径为10cm，长度为24cm，喷口的直径为0.3mm)，制备得到PLGA的质量体积浓度为0.3g/mL的聚乳酸-羟基乙酸纳米纤维支架材料，在25℃下真空干燥24h后备用。其纤维直径在100nm～200nm，纤维交错，表面平滑，如图1所示。
实施例2：
取8.55g蔗糖晶体，溶于20mL纯水中，经过注射滤器(0.22μm微孔滤膜)抽滤除菌，得到1.25M蔗糖溶液。取病毒原液Ad-EGFP、Ad-EPO(美国国立卫生研究院，颅颌面研究组，郑长玉研究员馈赠；公众亦可以得到)分别与1.25M蔗糖溶液以1：4(V/V)混合，方法是将2μL浓度为2×10¹²病毒颗粒(VP)/mL的Ad-EPO溶液，与8μL浓度为1.25M的蔗糖溶液混合，吹打混匀后Ad-EPO浓度为4×10¹¹VP/mL，蔗糖的终浓度为1M，此为Ad-EPO/蔗糖溶液；取2μL浓度为2×10¹⁰VP/mL Ad-EGFP溶液，与8μL浓度为1.25M的蔗糖溶液混合，吹打混匀后Ad-EGFP浓度为4×10⁹VP/mL，蔗糖的终浓度为1M，此为Ad-EGFP/蔗糖溶液。EGFP是绿色荧光蛋白，EPO是促红细胞生成素，本专利中的Ad-EGFP对细胞的功能无任何影响，用于检测病毒活性和病毒释放，而Ad-EPO对细胞的增殖与成骨分化均有一定作用，用于体内成骨能力的检测。
实施例3:
将PLGA纳米纤维支架材料(实施例1)剪裁成直径为5mm和2cm的圆形，正反面分别进行紫外线(功率：8～10W、波长：250nm～260nm)照射消毒30分钟后，取10μL实施例2制备的Ad-EPO/蔗糖溶液滴加于直径5mm的PLGA纳米纤维支架的一面上；取10μL实施例2制备的Ad-EGFP/蔗糖溶液滴加于直 径2cm的PLGA纳米纤维支架上。在-70℃下预冻24h使液体充分冰冻，然后在-70℃的真空冷冻干燥机中冻干24h使冰冻的水升华，获得PLGA/Ad-EGFP及PLGA/Ad-EPO两种复合纳米纤维支架材料。
实施例4:
将11个冻干的PLGA/Ad-EGFP复合纳米纤维支架材料置于12孔板中以保证操作条件相同，其他孔空置，每孔加入350μL TE(10mM Tris-HCl,1mMEDTA,pH 7.5)缓冲液。在第1、2、4、8、15、30min及第1、2、4、8、16h于不同的孔中取出300μL上清液置于小离心管中。取出的上清液每100μL使用15μL质量百分浓度为0.5％的十二烷基硫酸钠(SDS)-TE溶液(SDS为溶质，TE缓冲液为溶剂)在室温放置15min，裂解病毒衣壳，使病毒DNA暴露出来。裂解后的上清液以每孔100μL、每个时间点设3个复孔加于96孔板的33个孔中。按照说明书将Quant-iT^TMdsDNA定量试剂盒(购买于Invitrogen公司)中的标准品配制成5个梯度浓度(浓度分别为1μg/ml、100ng/ml、10ng/ml、1ng/ml和0ng/ml)，液体分别以100μl加于上述96孔板的另5个孔中。该试剂盒中的Picogreen试剂以TE缓冲液稀释200倍，以每孔100μL加于上述样品及标准品所在的孔中。5min避光孵育后，Picogreen试剂可以与双链DNA结合形成DNA-Picogreen复合物，通过Picogreen的荧光强度检测DNA的量。待测样品及标准品中的DNA-Picogreen复合物在酶标仪上分别在激发波长485nm、发射波长538nm读取数据。对照组为10μL的Ad-EGFP/蔗糖溶液，对照组与实验组操作相同，以对照组中的双链DNA浓度为100％。如图3所示，病毒在前1h快速释放，随着时间延长，病毒释放速度减缓，在第16h时在PLGA纳米纺丝支架上存留20％左右。
实施例5:
以股骨全骨髓提取法提取大鼠骨髓间充质干细胞BMMSCs(吉林大学基础医学部动物实验中心，Wistar雄性大鼠，4～5周，体重80～100g)，在培养瓶中传代至第3代(Jin H,Zhang K,Qiao C,et al.Efficiently engineered cell sheet using a complex of polyethylenimine–alginate nanocomposites plus bone morphogenetic protein 2gene to promote new bone formation[J].International journal of nanomedicine,2014,9:2179.)，以每孔1.5×10⁵个细胞，每孔2ml培养基铺于六孔板上。24h细胞贴壁后将培养基更换为无血清的培养基。对照组为未与材料复合的病毒液体，病毒量与实施例3制备的PLGA/Ad-EGFP中的病 毒量相同，实验组为在-70℃下保存1、15、30天时取出的实施例3中制备的PLGA/Ad-EGFP，将PLGA/Ad-EGFP覆盖于细胞上，每个时间点设三个复孔。然后置于含体积分数5％CO₂的37℃恒温细胞培养箱(细胞培养箱中原有为空气，人为输入CO₂，使其体积分数达到5％)中培养，12h后将培养基更换为有血清的培养基。然后，每两天换一次体积为2mL的细胞培养基，细胞培养基中包含体积分数为85％-90％低葡萄糖-杜尔伯科改良伊格尔培养基L-DMEM(购买于Gibco公司)，及胎牛血清(购买于BI公司)，胎牛血清体积分数为10％～15％。在第1、3、7、14天于倒置荧光显微镜下观察并拍照。如图4所示，-70℃下保存30天后病毒仍能感染大鼠BMMSCs，使细胞表达绿色荧光蛋白(图4中明亮部分)。说明经过低温保存后Ad-EGFP仍具有活性。另外，与对照组相比，实验组的荧光面积更大，说明病毒与材料复合，可以使病毒的局部浓度提高，并缩减病毒在培养基中的沉降时间，增加单位时间病毒进入细胞的数目，从而达到提高转染效率的效果。
实施例6:
在Wistar雄性大鼠(吉林大学基础医学部动物实验中心，8～10周，体重280～300g)的头部耳缘后做长度为1cm的横行切口，分离骨膜，用慢速环形去骨钻在头盖骨人字缝区域制备直径为5mm的圆形缺损，实验组为将实施例3制备的PLGA/Ad-EPO复合纳米纤维支架以1片/只植入缺损处，以只进行手术的大鼠作为对照组，每组5只。操作过程中不断用生理盐水冲洗，最后用3/0手术缝合线缝合。术后八周将大鼠心脏灌流固定(质量体积分数为40mg/mL的多聚甲醛)处死后，将头盖骨取出，用多聚甲醛固定处理48小时后用于Micro-CT测量。如图4所示，通过面积计算，可以发现在第4周实验组促进骨缺损明显缩小，缺损边缘不光滑，在第8周，实验组促进骨缺损进一步缩小。经过HE染色证实，如图5所示，在第4周实验组由于Ad-EPO的作用，使缺损局部产生大量红细胞，并在第8周骨缺损边缘出现骨再生。说明本发明产物具有促进骨再生的功效。