具有抗肿瘤活性的乳菇菌素及其制备方法和应用.pdf

本发明提供一种具有抗肿瘤活性的乳菇菌素，其制备方法是从高等真菌细质乳菇(Lactarius mitissimus)，毛脚乳菇(Lactarius hirtipes J.Z.Ying)等子实体中，用乙醇、甲醇、氯仿、乙酸乙酯、丙酮、石油醚其中一种或几种溶剂提取，所得提取物反复用硅胶柱层析分离得到的。本发明还给出了这种乳菇菌素作为制备抗肿瘤药物的应用方向，包括临床上用于制备以乳菇菌素为有效成分的抗肿瘤药物。本发明乳菇菌素经体外试验表明具有较强的抗肿瘤活性，其中乳菇菌素Mitissimol D活性最强，对A549(人肺腺癌细胞株)，HCT-8(人结肠癌细胞株)，Bel-7402(人肝癌细胞株)，Hela(人宫颈癌细胞株)的半数抑制浓度IC50分别为2.5，11.0，3.6，4.6μg/ml，与阳性对照药剂顺铂几乎相当，这一类化合物有望成为新的抗肿瘤药物。

1、  具有抗肿瘤活性的乳菇菌素，其特征包括下述结构通式(I)的乳菇菌素：

其中：R₁为氢、羧基、羟基或醛基；R₂为氢、羟基、酯基或酰氨；R₃为氢、羧基、羟基或醛基；R₄为氢、羧基、羟基或醛基；R₅为氢或羟基或5位为亚甲基或羰基；3，4或6，7或8，9或10，11位形成环氧或形成单键或形成双键。

2、  根据权利要求1所述具有抗肿瘤活性的乳菇菌素，包括具有通式(I)特征的蛇麻烷倍半萜乳菇菌素mitissiols A-H结构如下：



3、  根据权利要求1所述具有抗肿瘤活性的乳菇菌素，包括具有通式(I)特征的蛇麻烷倍半萜乳菇菌素11β-19α-epoxy-4Z，7Z-humuladiene-5α-ol结构如下：


4、  根据权利要求1或2所述具有抗肿瘤活性的乳菇菌素的制备方法，其特征包括：所述具有抗肿瘤活性的乳菇菌素是从高等真菌细质乳菇(Lactariusmitissimus)的子实体中，用乙醇、甲醇、氯仿、乙酸乙酯、丙酮、石油醚其中一种或几种溶剂提取，所得提取物反复用硅胶柱层析分离得到的。

5、  根据权利要求4所述具有抗肿瘤活性的乳菇菌素的制备方法，其特征包括如下步骤：
A、提取：将1.6Kg高等真菌细质乳菇(Lactarius mitissimus)粉碎，用15L的95％乙醇提取3次，再用乙酸乙酯4.5L萃取，溶剂回收至干，称重得33.5g；
B、进入200-300目硅胶柱层析分离：
a、用CHCl₃-MeOH溶剂以100:0，98:2，95:5，90:10(vol/vol)梯度洗脱，在CHCl₃-MeOH 100:0洗脱段得一组分，进一步进行硅胶柱层析，用石油醚-丙酮溶剂以25:1，15:1，10:1，5:1梯度洗脱，在15:1部位得纯品乳菇菌素mitiSsimol A 66mg；
b、在a步骤CHCl₃-MeOH 95:5洗脱段得一组分，进一步进行硅胶柱层析，用石油醚-丙酮溶剂以10:1，8:1，6:1，4:1，5:1，2:1，1:1梯度洗脱，在10:1部位得纯品乳菇菌素mitissimol B 8mg；
C、在b步骤石油醚-丙酮2:1部位进一步硅胶柱层析，石油醚-乙酸乙酯以20:1，15:1，10:1，5:1，1:1，1:5梯度洗脱，在石油醚-乙酸乙酯20:1组分得纯品乳菇菌素mitissimol C 26mg；
d、在步骤C石油醚-乙酸乙酯15:1组分进一步利用Sephadex LH-20凝胶柱层析，CHCl₃-MeOH 1:1为洗脱剂，纯化得到乳菇菌素mitissimol D 5mg；
e、在步骤C石油醚-乙酸乙酯10:1组分进一步利用薄层制备层析，石油醚-丙酮4:1为展开剂，纯化得到乳菇菌素mitissimol E 8mg；
f、在步骤C石油醚-乙酸乙酯5:1组分得到乳菇菌素mitissimol F 17mg；

9、  在步骤C石油醚-乙酸乙酯1:1组分得到乳菇菌素mitissimol G 4mg；
h、在b步骤在石油醚-丙酮4:1部位得纯品乳菇菌素mitissimo 17mg。

6、  根据权利要求3所述具有抗肿瘤活性的乳菇菌素的制备方法，其特征包括：所述具有抗肿瘤活性的乳菇菌素是从高等真菌毛脚乳菇(Lactariushirtipes J.Z.Ying)的子实体中，用乙醇、甲醇、氯仿、乙酸乙酯、丙酮、石油醚其中一种或几种溶剂提取，所得提取物反复用硅胶柱层析分离得到的。

7、  根据权利要求6所述具有抗肿瘤活性的乳菇菌素的制备方法，其特征包括如下步骤：
A、提取：将6Kg高等真菌毛脚乳菇(Lactarius hirtipes J.Z.Ying)，粉碎，用20L的95％乙醇提取3次，再用乙酸乙酯5L萃取，溶剂回收至干，称重得8.2g；
B、200-300目硅胶柱层析分离：用石油醚-丙酮梯度洗脱50:1，20:1，9:1，5:1，1:1得5个组分，取石油醚-丙酮9:1组分反复用RP-C18柱层析，用石油醚-氯仿重结晶，得到乳菇菌素2β-3α-epoxy-6Z，9Z-humuladiene-8α-ol22mg。

8、  根据权利要求1所述具有抗肿瘤活性的乳菇菌素作为制备抗肿瘤药物的应用，其特征包括：临床上用于制备以乳菇菌素为有效成分的抗肿瘤药物。

9、  根据权利要求8所述具有抗肿瘤活性的乳菇菌素作为制备抗肿瘤药物的应用，其特征包括：临床上用于制备含有乳菇菌素为有效成分的组合物或化合物，制备含有乳菇菌素药学上可接受的盐、溶剂化物、或相应的结晶形态的物质为有效成分，并且加入药物可接受的载体或辅助成分的抗肿瘤药物。

具有抗肿瘤活性的乳菇菌素及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及一种具有抗肿瘤活性的乳菇菌素及其制备方法和应用，属于真菌的提取分离及制备抗肿瘤药物应用技术领域。
背景技术
癌症已经成为人类健康的主要威胁之一，且呈明显上升趋势，癌症在美国已经成为最主要的死亡因素，在我国癌症死亡率在城市中占各种死因的首位。因而我国已把抗癌药物的研究列为新药开发的最重要的战略性课题之一，研究新型的具有高效、低毒、高选择性的抗癌药物成为药物研究工作者长期的目标和任务。
自然界提供了广泛而专一有效的生物活性成分，在长期进化过程中许多有机体发展了一整套防御机制来对抗竞争者。有机体所使用的“武器”越来越精致，因此从自然资源中寻找新的活性成分或基本结构作为药物或农药是一个非常明智的做法。
在各种生物资源中，真菌属于“创造系数”特别高的生物，含有大量结构多样的次生代谢产物。人们通过实验对比人为使之受伤和未受损的子实体，发现子实体在受伤后很快产生大量的次生代谢产物，这些产物具有抗真菌、杀虫等多种活性。其中一个典型的例子是：乳菇属Lactarious中无活性的stearoylvelutinal(1)受损反应后立刻转化为具有很强活性的抗生素isovelleral(2)。近年来高等真菌愈来愈引起人们的重视。一方面是因为从高等真菌中不断发现结构新颖和具有显著生物活性的化合物，且结构变化大。这种结构多样性对于药物(或农药)的发现有重要意义。另一方面，高等真菌不仅可以直接采来作为研究材料用，而且可以较方便地通过菌丝体或孢子发酵培养，提供大量原料资源，为今后可能的工业化生产提供了保证，这也是一潜在的优势。高等真菌中的倍半萜化合物是高等真菌中一大类化合物类型，其结构变化非常丰富，生物活性显著。主要包括tremulane、caryophyllane、collybial、protoilludanes、marasmanes、lactaranes、cucumanes、fomannosanes、illudanes、isoilludanes、hirsutanes、pleurotellanes、cerapicanes、bulleranes、isolactaranes和merulanes类倍半萜。Humulane倍半萜本身在真菌中的存在非常稀少，目前只有申请人的研究小组发现一系列新的蛇麻烷Humulane倍半萜，并具有较强的抗肿瘤活性，目前国内外还未见其他报道。
发明内容
本发明的目的是提供一类新的具有抗肿瘤活性的蛇麻烷Humulane倍半萜化合物乳菇菌素(mitissiols)及其从细质乳菇(Lactariusmitissimus)，毛脚乳菇(Lactarius hirtipes J.Z.Ying)等子实体中提取乳菇菌素的方法；同时进一步提供以乳菇菌素为活性成分制备治疗和预防抗肿瘤药物方面药物的应用方向。
本发明的技术方案是这样实现的：这种具有抗肿瘤活性的乳菇菌素，其特征包括下述结构通式(I)的乳菇菌素：

其中：R₁为氢、羧基、羟基或醛基；R₂为氢、羟基、酯基或酰氨；R₃为氢、羧基、羟基或醛基；R₄为氢、羧基、羟基或醛基；R₅为氢或羟基或5位为亚甲基或羰基；3，4或6，7或8，9或10，11位形成环氧或形成单键或形成双键。
所述具有抗肿瘤活性的乳菇菌素，包括具有通式(I)特征的蛇麻烷倍半萜乳菇菌素mitissiols A-H结构如下：

所述具有抗肿瘤活性的乳菇菌素，包括具有通式(I)特征的蛇麻烷倍半萜乳菇菌素11β-19α-epoxy-4Z，7Z-humuladiene-5α-ol结构如下：

所述具有抗肿瘤活性的乳菇菌素的制备方法：所述具有抗肿瘤活性的乳菇菌素是从高等真菌细质乳菇(Lactarius mitissimus)的子实体中，用乙醇、甲醇、氯仿、乙酸乙酯、丙酮、石油醚其中一种或几种溶剂提取，所得提取物反复用硅胶柱层析分离得到的。
所述具有抗肿瘤活性的乳菇菌素的制备方法，包括如下步骤：
A、提取：将1.6kg高等真菌细质乳菇(Lactariusmitissimus)粉碎，用15L的95％乙醇提取3次，再用乙酸乙酯4.5L萃取，溶剂回收至干，称重得33.5g；
B、进入200-300目硅胶柱层析分离：
a、用CHCl₃-MeOH溶剂以100:0，98:2，95:5，90:10(Vol/Vol)梯度洗脱，在CHCl₃-MeOH100:0洗脱段得一组分，进一步进行硅胶柱层析，用石油醚-丙酮溶剂以25:1，15:1，10:1，5:1梯度洗脱，在15:1部位得纯品乳菇菌素mitissimol A 66mg；
b、在a步骤CHCl₃-MeOH 95:5洗脱段得一组分，进一步进行硅胶柱层析，用石油醚-丙酮溶剂以10:1，8:1，6:1，4:1，5:1，2:1，1:1梯度洗脱，在10:1部位得纯品乳菇菌素mitissimol B 8mg；
c、在b步骤石油醚-丙酮2:1部位进一步硅胶柱层析，石油醚-乙酸乙酯以20:1，15:1，10:1，5:1，1:1，1:5梯度洗脱，在石油醚-乙酸乙酯20:1组分得纯品乳菇菌素mitissimol C 26mg；
d、在步骤c石油醚-乙酸乙酯15:1组分进一步利用SephadexLH-20凝胶柱层析，CHCl₃-MeOH 1:1为洗脱剂，纯化得到乳菇菌素mitissimol D 5mg；
e、在步骤c石油醚-乙酸乙酯10:1组分进一步利用薄层制备层析，石油醚-丙酮4:1为展开剂，纯化得到乳菇菌素mitissimolE 8mg；
f、在步骤c石油醚-乙酸乙酯5:1组分得到乳菇菌素mitissimol F 17mg；
g、在步骤c石油醚-乙酸乙酯1:1组分得到乳菇菌素mitissimol G 4mg；
h、在b步骤在石油醚-丙酮4:1部位得纯品乳菇菌素mitissimol 7mg。
所述具有抗肿瘤活性的乳菇菌素的制备方法，所述具有抗肿瘤活性的乳菇菌素是从高等真菌毛脚乳菇(Lactarius hirtipes J.Z.Ying)的子实体中，用乙醇、甲醇、氯仿、乙酸乙酯、丙酮、石油醚其中一种或几种溶剂提取，所得提取物反复用硅胶柱层析分离得到的。
所述具有抗肿瘤活性的乳菇菌素的制备方法，包括如下步骤：
A、提取：将6kg高等真菌毛脚乳菇(Lactarius hirtipes J.Z.Ying)，粉碎，用20L的95％乙醇提取3次，再用乙酸乙酯5L萃取，溶剂回收至干，称重得8.2g；
B、200-300目硅胶柱层析分离：用石油醚-丙酮梯度洗脱50:1，20:1，9:1，5:1，1:1得5个组分，取石油醚-丙酮9:1组分反复用RP-C18柱层析，用石油醚-氯仿重结晶，得到乳菇菌素2β-3α-epoxy-6Z，9Z-humuladiene-8α-ol 22mg。
所述具有抗肿瘤活性的乳菇菌素作为制备抗肿瘤药物的应用，包括临床上用于制备以乳菇菌素为有效成分的抗肿瘤药物。
所述具有抗肿瘤活性的乳菇菌素作为制备抗肿瘤药物的应用，包括临床上用于制备含有乳菇菌素为有效成分的组合物或化合物，制备含有乳菇菌素药学上可接受的盐、溶剂化物、或相应的结晶形态的物质为有效成分，并且加入药物可接受的载体或辅助成分的抗肿瘤药物。
本发明乳菇菌素经体外试验表明具有较强的抗肿瘤活性，其中乳菇菌素Mitissimol D活性最强，对A549(人肺腺癌细胞株)，HCT-8(人结肠癌细胞株)，Bel-7402(人肝癌细胞株)，Hela(人宫颈癌细胞株)的半数抑制浓度IC₅₀分别为2.5，11.0，3.6，4.6μg/ml，与阳性对照药剂顺铂几乎相当，这一类化合物有望成为新的抗肿瘤药物。
附图说明
图1是乳菇菌素Mitissimol A的晶体衍射图
图2是乳菇菌素(S)-MTPA酯1b和乳菇菌素(R)-MTPA酯1a化学位移差值
具体实施方式
实施例1：乳菇菌素mitissiols A-H的制备
A、提取：
将采自云南省哀牢山(其菌种保存在中国科学院昆明植物研究所标本室)的1.6kg高等真菌细质乳菇(Lactarius mitissimus)粉碎，用15L的95％乙醇提取3次，再用乙酸乙酯4.5L萃取，溶剂回收至干，称重得33.5g；
B、进入200-300目硅胶柱层析分离：
a、用CHCl₃-MeOH溶剂以100:0，98:2，95:5，90:10(Vol/Vol)梯度洗脱，在CHCl₃-MeOH 100:0洗脱段得一组分，进一步进行硅胶柱层析，用石油醚-丙酮溶剂以25:1，15:1，10:1，5:1梯度洗脱，在15:1部位得纯品乳菇菌素mitissimol A 66mg；
b、在a步骤CHCl₃-MeOH 95:5洗脱段得一组分，进一步进行硅胶柱层析，用石油醚-丙酮溶剂以10:1，8:1，6:1，4:1，5:1，2:1，1:1梯度洗脱，在10:1部位得纯品乳菇菌素mitissimol B 8mg；
c、在b步骤石油醚-丙酮2:1部位进一步硅胶柱层析，石油醚-乙酸乙酯以20:1，15:1，10:1，5:1，1:1，1:5梯度洗脱，在石油醚-乙酸乙酯20:1组分得纯品乳菇菌素mitissimol C 26mg；
d、在步骤c石油醚-乙酸乙酯15:1组分进一步利用SephadexLH-20凝胶柱层析，CHCl₃-MeOH 1:1为洗脱剂，纯化得到乳菇菌素mitissimol D 5mg；
e、在步骤c石油醚-乙酸乙酯10:1组分进一步利用薄层制备层析，石油醚-丙酮4:1为展开剂，纯化得到乳菇菌素mitissimolE8mg；
f、在步骤c石油醚-乙酸乙酯5:1组分得到乳菇菌素mitissimol F 17mg；
g、在步骤c石油醚-乙酸乙酯1:1组分得到乳菇菌素mitissimol G 4mg；
h、在b步骤在石油醚-丙酮4∶1部位得纯品乳菇菌素mitissimol 7mg。
C、乳菇菌素mitissiols A-H理化性质
材料与仪器：
熔点用四川科学仪器厂生产的XRC-1型显微熔点仪测定，温度未校正；旋光用SEPA-300仪测定；红外在Bio-Rad FTS-135红外光谱仪测定；紫外在UV-210A紫外光谱仪上测定；NMR由Bruker AM-400和Bruker AM-500核磁共振仪测定，四甲基硅烷(TMS)为内标；质谱由VGA Auto Spec-3000型质谱仪测定。薄层层析和柱层析硅胶均为青岛海洋化工厂产品，Sephadex LH-20为Pharmacia公司产品。用10％硫酸-乙醇加热显色和碘蒸汽显色。
乳菇菌素mitissimol A：
无色结晶(CHCl₃)；mp169-171℃；[α]_D^25.2-42.0(c0.40，CHCl₃)；UV(CHCl₃)UV(CHCl₃)λ_max(log ε)252(4.30)nm；IR(KBr)：3481，2988，2959，2925，2881，1638，1445，1388，1297，1273，1045，968，900cm^-1；¹H-NMR(500MHz，CDCl₃)δ：4.22(d，1H，J＝10.0，1-H)，5.69(d，1H，J＝16.4，3-H)，6.06(d，1H，J＝16.4，4-H)，5.90(brd，1H，J＝10.6，7-H)，2.47(m，1H，8-H_α)，2.28(m，1H，8-H_β α)，2.37(m，1H，9-H_α)，2.23(m，1H，9-H_β)，5.25(brd，1H，J＝10.6，11-H)，1.14(s，3H，12-CH₃)，1.14(s，3H，13-CH₃)，1.79(brs，3H，14-CH₃)，1.62(s，3H，15-CH₃)；¹³C NMR(CDCl₃，500MHz))δ：75.6(d)，42.0(s)，157.0(d)，127.2(d)，203.7(s)，137.8(s)，148.1(d)，24.6(t)，39.5(t)，138.6(s)，128.0(d)，26.6(q)，17.1(q)，11.7(q)，16.0(q)；FABMS(pos)m/z235[M+1]⁺，469[2M+1]⁺；HRESIM(pos)m/z257.1516(实测值)(C₁₅H₂₂O₂Na，理论值257.1517)。
图1所示乳菇菌素Mitissimol A的X晶体衍射结构分析：C₁₅H₂₂O₂，M为234.33，空间群为P2(1)2(1)2(1)晶胞参数a＝9.1505(18)b＝9.5977(19)c＝6.152(3)晶胞体积：V＝418.5(5)晶胞内分子数Z＝4；晶胞密度d＝1.097Mg/m³；R_f和R_w值分别为0.0423和0.1049。用MAC-DIP-2030K面探仪收集衍射强度数据，MOKα辐射、石墨单色器。用ω扫描方式，获得独立衍射点7350和2517个。在微机上用直接法(SHELXS86)解析晶体结构。CCDC号为601319。
表1、乳菇菌素Mitissimol A的原子坐标

表2、乳菇菌素Mitissimol A的键长、键角值

乳菇菌素mitissimol B：
无色针状晶体(CHCl₃)；mp200-201℃；[α]_D^25.5-1.0(c0.59，CHCl₃)；UV(CHCl₃)λ_max(log ε)244(3.43)nm；IR(KBr)：3507，3011，2995，2962，2924，1651，1641，1466，1386，1294，1271，1061，975，911cm^-1；¹HNMR(500MHz，CDCl₃)δ：3.30(d，1H，J＝9.7，1-H)，5.93(d，1H，J＝16.4，3-H)，6.25(d，1H，J＝16.4，4-H)，6.05(brd，1H，J＝8.7，7-H)，2.41(m，2H，8-H)，2.28(ddd，1H，J＝13.4，3.9，2.8，9-H_α)，1.38(td，1H，J＝13.4，7.1，9-H_β)，2.75(d，1H，J＝9.7，11-H)，1.16(s，3H，12-CH₃)，1.24(s，3H，13-CH₃)，1.85(brs，3H，14-CH₃)，1.29(s，3H，15-CH₃)；¹³CNMR(CDCl₃，500MHz))δ：76.1(d)，40.4(s)，155.9(d)，129.2(d)，202.5(s)，139.2(s)，147.0(d)，24.5(t)，38.0(t)，63.5(s)，65.8(d)，26.8(q)，17.1(q)，12.0(q)，16.7(q)；ESIMS(pos)m/z 273[M+Na]⁺，523[2M+Na]⁺；HRESIMS(pos)m/z273.1474(实测值)(C₁₅H₂₂O₃Na，理论值273.1466)。
乳菇菌素mitissimol C：
无色结晶(MeOH)；mp193-196℃；[α]_D^25.1+99.0(c0.64，MeOH)；UV(MeOH)λ_max(logε)252(4.11)nm；IR(KBr)：3424(OH)，3037，2962，2928，1647(C＝CC＝OC＝C)，1477，1386，1099，1026，994，901cm^-1；¹H NMR(400MHz，CD₃OD)δ：4.19(d，1H，J＝10.7，1-H)，5.84(d，1H，J＝16.5，3-H)，6.07(d，1H，J＝16.5，4-H)，5.73(brd，1H，J＝10.0，7-H)，4.61(ddd，1H，J＝10.4，10.0，5.5，8-H)，2.70(dd，1H，J＝11.4，5.5，9-H_α)，2.12(dd，1H，J＝11.4，10.4，9-H_β)，5.30(brd，1H，J＝10.7，11-H)，1.11(s，3H，12-CH₃)，1.13(s，3H，13-CH₃)，1.858(brs，3H，14-CH₃)，1.65(s，3H，15-CH₃)；¹³CNMR(CD₃OD，400MHz))δ：76.0(d)，43.8(s)，161.4(d)，128.0(d)，206.5(s)，140.7(s)，147.8(d)，65.6(d)，52.0(t)，135.8(s)，130.9(d)，26.9(q)，17.6(q)，12.1(q)，17.3(q)；ESIMS(pos)[M+Na]⁺273，[2M+Na]⁺523；HRESIMS(pos)m/z273.1467[M+Na]⁺(实测值)(C₁₅H₂₂O₃Na，理论值273.1466)。
乳菇菌素mitissimol D：
白色粉末；m.p.193-196℃(MeOH)；[α]_D²⁵+138.0(c0.51，MeOH)；UV(MeOH)λmax(log ε)230(3.93)；IR(KBr)：3338(OH)，3039，2961，2928，1665(C＝CCOC＝C)，1388，1359，1126，1031，982，909cm¹；¹H NMR(500MHz，CD₃OD)δ：3.25(d，1H，J＝9.7，1-H)，6.12(d，1H，J＝16.4，3-H)，6.28(d，1H，J＝16.4，4-H)，5.92(brd，1H，J＝9.9，7-H)，4.53(ddd，1H，J＝12.1，9.9，5.3，8-H)，2.51(dd，1H，J＝12.7，5.3，8-H_α)，1.27(dd，·1H，J＝12.7，12.1，8-H_α)，2.79(d，1H，J＝9.7，11-H)，1.22(s，3H，12-CH₃)，1.11(s，3H，13-CH₃)，1.95(brs，3H，14-CH₃)，1.29(s，3H，15-CH₃)；¹³CNMR(CD₃OD)δ：76.9(d)，41.9(s)，160.1(d)，130.5(d)，205.3(s)，142.8(s)，146.8(d)，65.2(d)，48.4(t)，61.8(s)，66.7(d)，27.2(q)，17.7(q)，12.5(q)，18.0(q)；ESI-MS(pos)m/z[M+Na]⁺289，[2M+Na]⁺555；HRESI-MS(pos)m/z 289.1408(实测值)(calcd for C₁₅H₂₂O₄Na，理论值289.1415)。
乳菇菌素mitissimol E：
白色粉末；m.p.80-82℃(MeOH)；[α]_D¹⁸-41.5(c0.5，MeOH)；UV(MeOH)λmax(log ε)233(3.84)；IR(KBr)：3442(OH)，2967，2929，1687，1637(C＝OC＝C)，1467，1389，1365，1055，966，916cm^-1；¹H NMR(400MHz，CD₃OD)δ：3.39(d，1H，J＝9.8，1-H)，6.08(d，1H，J＝17.2，3-H)，6.80(d，1H，J＝17.2，4-H)，2.81(d，1H，J＝9.1，7-H)，3.77(ddd，1H，J＝11.6，9.1，3.6，8-H)，2.44(dd，1H，J＝13.4，3.6，8-H_α)，1.40(dd，1H，J＝13.4，11.6，8-HH_α)，2.77(d，1H，J＝9.8，11-H)，1.20(s，3H，12-CH₃)，1.18(s，3H，13-CH₃)，1.69(s，3H，14-CH₃)，1.46(s，3H，15-CH₃)；¹³CNMR(CD₃OD)δ：76.1(d)，41.8(s)，158.9(d)，128.1(d)，200.4(s)，67.0(s)，66.9(d)，66.0.4(d)，46.7(t)，60.6(s)，66.0(d)，27.5(q)，18.1(q)，16.7(q)，18.9(q)；ESI-MS(pos)m/z[M+Na]⁺305，[2M+Na]⁺587；HRESI-MS(pos)m/z305.1365(实测值)(C₁₅H₂₂O₅Na，理论值，305.1364)。
乳菇菌素mitissimol F：
无色胶状物质，m.p.148-150℃(MeOH)；[α]_D^25.1-37.7(c0.55，MeOH)；UV(MeOH)λ_max(logε)235(3.48)；IR(KBr)：3441，2968，2927，1676，1617，1453，1395，1150，1116，1064，994，901cm^-1cm^-1；¹H NMR(CD₃OD)δ：3.34(d，1H，J＝10.0，1-H)，6.20(d，1H，J＝16.1，3-H)，7.11(d，1H，J＝16.1，4-H)，2.52(dd，1H，J＝13.4，9.2，7-H_α)，1.23(dd，1H，J＝13.4，5.2，7-H_β)，2.43(ddd，1H，J＝9.2，5.2，2.4，8-H)，2.68(d，1H，J＝2.4，9-H)，2.81(d，1H，J＝10.0，11-H)，1.22(s，3H，12-CH₃)，1.13(s，3H，13-CH₃)，1.40(s，3H，14-CH₃)，0.95(s，3H，15-CH₃)；¹³C NMR(CD₃OD)δ：72.9(d)，43.2(s)，150.7(d)，129.8(d)，209.5(s)，79.4(s)，44.8(t)，52.4(d)，60.3(d)，61.8(s)，62.3(d)，27.1(q)，18.3(q)，27.9(q)，11.9(q)；ESI-MS(pos)m/z[M+Na]⁺305，[2M+Na]⁺587；HR-ESI-MS(pos)m/z305.1373(实测值)(C₁₅H₂₂O₅Na，理论值305.1364)。
利用Mosher试剂的方法来测定乳菇菌素mitissimol F的绝对构型：Mosher方法是近年来发展起来的用¹H NMR测定仲醇类化合物绝对构型的方法。它是利用2-甲氧基-2-(三氟甲基)-2-苯基-乙酸(MTPA)的R构型和S构型化合物与仲醇形成酯，根据¹HNMR上Δ(Δ＝S-R)为正值或负值及可能的两个异构体的分子模型来确定仲醇的绝对构型。根据图2所示实验结果，乳菇菌素(R)-MTPA((2-甲氧基-2-(三氟甲基)-2-苯基-乙酸)(2-甲氧基-2-(三氟甲基)-2-苯基-乙酸))酯1a的H-C(3)，H-C(4)，CH₂(7)，H-C(8)，Me(12)，Me(13)和Me(14)的化学位移比乳菇菌素(S)-MTPA((2-甲氧基-2-(三氟甲基)-2-苯基-乙酸)(2-甲氧基-2-(三氟甲基)-2-苯基-乙酸))酯1b在更高场，而H-C(9)，H-C(11)和Me(15)的化学位移在更低场。因此，乳菇菌素mitissimol F在C-1的绝对构型是S构型。具体方法如下：
MTPA(2-甲氧基-2-(三氟甲基)-2-苯基-乙酸)与mitissimol F酯化反应：取2.82mg乳菇菌素mitissimol F，11.2mg(S)-MTPA在CHCl₂ 10ml溶液中溶解，再加(S)-MTPA 11.2mg，N，N-二环己基碳二亚胺N，N′-dicyclohexylcarbodiimide(DCC)9.9mg和4-二甲氨基吡啶4-dimethylaminopyridine(DMAP)2mg于50ml圆底烧瓶中。将圆底烧瓶放置于磁力搅拌器上搅拌，在室温下反应12h。反应液用制备TLC(薄层层析)得乳菇菌素(S)-MTPA酯1a 3.1mg；取2.60mg乳菇菌素mitissimol F，11.2mg(R)-MTPA在CHCl₂ 10ml溶液中溶解，再加(R)-MTPA 10.8mg，N，N-二环己基碳二亚胺N，N′-dicyclohexylcarbodiimide(DCC)8.7mg和4-二甲氨基吡啶4-dimethylaminopyridine(DMAP)2mg于50ml圆底烧瓶中。将圆底烧瓶放置于磁力搅拌器上搅拌，在室温下反应12h。反应液用制备TLC(薄层层析)得乳菇菌素(R)-MTPA酯1a 3.1mg，得乳菇菌素(R)-MPTA ester 1b 2.6mg。
乳菇菌素(R)-MTPA(2-甲氧基-2-(三氟甲基)-2-苯基-乙酸)酯1a：
无色无定形粉末；¹HNMR δ 7.180(1H，d，J＝16.3Hz，H-4)，6.231(1H，d，J＝16.1Hz，H-3)，5.087(1H，d，J＝10.0Hz，H-1)，2.947(1H，d，J＝10.0Hz，H-11)，2.696(1H，d，J＝2.4Hz，H-9)，2.540(1H，dd，J＝13.2，4.9Hz，H-7α)，1.224(1H，br d，J＝9.7Hz，H-7β)，2.474(1H，br d，J＝8.2Hz，H-8)，1.403(3H，s，H-14)，1.244(3H，s，H-12)，1.117(3H，s，H-13)，0.896(3H，s，H-15)；FABMS m/z499
乳菇菌素(S)-MTPA(2-甲氧基-2-(三氟甲基)-2-苯基-乙酸))酯1b：
无色无定形粉末；¹HNMR δ 7.149(1H，d，J＝16.2Hz，H-4)，6.197(1H，d，J＝16.2Hz，H-3)，5.075(1H，d，J＝10.1Hz，H-1)，3.015(1H，d，J＝10.1Hz，H-11)，2.732(1H，brd，J＝2.4Hz，H-9)，2.538(1H，dd，J＝13.3，5.0Hz，H-7α)，1.221(1H，br d，J＝9.2Hz，H-7β)，2.472(1H，br d，J＝8.9Hz，H-8)，1.397(3H，s，H-14)，1.239(3H，s，H-12)，1.112(3H，s，H-13)，0.905(3H，s，H-15)；FABMSm/z499。
乳菇菌素mitissimol G：
无色胶状物质，m.p.205-207℃(MeOH).[α]_D^24.2-2.b(c0.11，CHCl₃).UV(CHCl₃)λ_max(log ε)241(3.63)；IR(KBr)：3552，3391，2990，2967，2927，1696，1630，1464，1387，1338，1127，1081，1049，999，911cm^-1.¹H NMR(pyridine-d₅)δ：3.62(d，1H，J＝9.5，1-H)，6.77(d，1H，J＝16.2，3-H)，7.58(d，1H，J＝16.2，4-H)，2.67(brd，1H，J＝14.6，7-H_α)，2.57(dd，1H，J＝14.6，6.8，7-H_β)，3.80(dd，1H，J＝9.7，6.8，8-H)，2.54(brd，1H，J＝13.1，9-H_α)，1.80(dd，1H，J＝13.1，9.7，9-H_β)，3.25(d，1H，J＝9.5，11-H)，1.43(s，3H，12-CH₃)，1.32(s，3H，13-CH₃)，2.05(s，3H，14-CH₃)，1.34(s，3H，15-CH₃)；¹³C NMR(pyridine-d₅)δ：74.6(d)，42.1(s)，150.8(d)，127.2(d)，204.1(s)，77.6(s)，51.6(t)，64.6(d)，52.9(t)，60.7(s)，65.1(d)，26.7(q)，17.6(q)，22.6(q)，18.8(q)；ESI-MS(pos)m/z[M+Na]⁺307，[2M+Na]⁺591.HR-ESI-MS(pos)m/z307.1522(实测值)C₁₅H₂₄O₅Na，理论值307.1521)。
乳菇菌素mitissimol H：
白色粉末；m.p.63-65℃(MeOH)；[α]_D^19.5+3.08(c0.06，MeOH)；UV(MeOH)λmax(log ε)202(3.54)；IR(KBr)：3440，2932，1709，1456，1015，975，911cm^-1；¹H-NMR(CD₃OD)δ：3.35(d，1H，J＝10.0，1-H)，5.43(t，1H，J＝5.6，3-H)，1.97(d，1H，J＝2.67，4-H_α)，1.70(overlapped，1H，4-H_β)，3.01(m，1H，6-H)，4.37(d，1H，J＝8.2，7-H)，3.75(m，1H，8-H)，2.02(d，1H，J＝1.3，9-H_α)，1.70(overlapped，1H，9-H_β)，5.38(d，1H，J＝9.8，11-H)，1.71(overlapped，3H，12-CH₃)，1.61(brs，3H，13-CH₃)，0.99(brs，3H，14-CH₃)，0.82(s，3H，15-CH₃)；¹³CNMR(CD₃OD)δ：60.5(d)，47.6(s)，97.9(d)，41.4(t)，215.4(s)，41.9(d)，89.8(d)，70.5(d)，50.2(t)，135.3(s)，120.1(d)，26.2(q)，18.5(q)，17.8(q)，17.0(q)；FAB-MS(pos)m/z[M+Gly]+361，[M+2Gly]+453；HR-ESI-MS(pos)m/z269.1643(实测值)(C₁₅H₂₅O₃，理论值269.1647)。
实施例2：乳菇菌素11β-19α-epoxy-4Z，7Z-h umuladiene-5α-ol的制备
A、提取：
将采自云南省哀牢山(其菌种保存在中国科学院昆明植物研究所标本室)的高等真菌毛脚乳菇6kg粉碎，用20L的95％乙醇提取3次，再用乙酸乙酯5L萃取，溶剂回收至干，称重得8.2g；
B、200-300目硅胶柱层析分离：用石油醚-丙酮梯度洗脱50:1，20:1，9:1，5:1，1:1得5个组分，取石油醚-丙酮9:1组分反复用RP-C18柱层析，用石油醚-氯仿重结晶，得到乳菇菌素2β-3α-epoxy-6Z，9Z-humuladiene-8α-ol22mg。
C、乳菇菌素11β-19α-epoxy-4Z，7Z-humuladiene-5α-ol的理化性质乳菇菌素11β-19α-epoxy-4Z，7Z-humuladiene-5α-ol：
无色针状晶体；mp189-191℃；[α]_D²⁵-21.3(c0.32，CHCl₃)；IR(KBr)：3296，2594，1640，1610，1452，1387，1360，1297，972cm^-1；¹HNMR(500MHz，CDCl₃)δ：1.59(d，1H，J＝14.3，1-Hα)，1.34(dd，1H，J＝14.3，9.8，1-H β)，5.37(d，1H，J＝16.1，3-H)，5.72(dd，1H，J＝16.1，6.9，4-H)，4.69(m，1H，5-H)，5.44(m，1H，7-H)，2.46(m，1H，8-H α)，2.08(m，1H，8-H β)，2.02，1.16(m，2H，9-2H)，2.56(d，1H，J＝9.8，11-H)，1.70(s，3H，14-CH₃)，1.16(s，3H，13-CH₃)，1.02(s，3H，12-CH₃)，1.16(s，3H，15-CH₃)；¹³CNMR(CDCl₃，500MHz))δ：40.4(t)，35.1(s)，139.3(d)，132.1(d)，78.1(d)，143.1(s)，124.9(d)，22.7(t)，37.9(t)，61.4(s)，63.3(d)，30.5(q)，16.1(q)，12.9(q)，23.0(q)；HRESIMS(pos)m/z236.1757(实测值)(C₁₅H₂₄O₂，理论值236.1776)。
附：四唑盐(MTT)还原法检测上述乳菇菌素的抗肿瘤活性试验
1、实验材料和试剂
1-1、四唑盐(MTT)：用0.01mol/L的磷酸盐缓冲液溶解噻唑兰MTT(3-(4，5-dimrthythiazol-z-yl)2，5-diphenytetrazolium bromide，SIGMA公司)浓度为5mg/ml，过滤除菌，分装后4℃避光保存。
1-2、四唑盐裂解液的配置：80g的十二烷基磺酸钠(SDS，华美生物工程公司)
溶解在200ml的N-N-二甲基二酰氨(北京化工厂)中，水浴加热助溶，加入200ml蒸馏水，用80％乙酸与1N盐酸(1:1)混合调pH至4.7。
1-3、细胞株选用：A549人肺腺癌细胞株，HCT-8人结肠癌细胞株，Bel-7402人肝癌细胞株，Hela人宫颈癌细胞株
2、实验方法
2-1、取培养4-5天，处于指数生长期的细胞培养一瓶，加入0.05％Trypsin-EDTA液，使贴壁细胞脱落，用10ml含5％胎牛血清的RPMI1640(购自美国Gibco公司)培养液配成混悬液；
2-2、用台盼蓝染色后在血球记数板上做细胞记数；
2-3、用细胞培养基(购自美国Gibco公司)稀释细胞混悬液，配成每100ml含10000或20000个细胞。
2-4、取96孔平板，每孔加细胞混悬液100μl，将平板置于37℃二氧化碳培养箱培养24小时，
2-5、供试化合物设为5个浓度梯度，依次为6.25ug/ml，12.5ug/ml，25ug/ml，50ug/ml，100ug/ml；
2-6、将平板在37℃，含5％CO₂空气及100％湿度的烘箱中培养2-3天；
2-7、四唑盐用无血清RPMI1640(购自美国Gibco公司)培养液配置成1mg/ml，每孔加50μl，37℃温育4小时，使MTT还原为甲臜(Formazan)；
2-8、吸取上清液，加入150μl二甲基亚砜使甲臜溶解，用平板摇床摇匀；
2-9、酶标仪检测各孔吸收度OD值(λ＝570nm)；
2-10、绘制细胞活力曲线图，求出半数抑制浓度IC₅₀值。μg/ml
3、实验结果

上述数据表明本发明乳菇菌素经体外试验表明对癌细胞有强烈的抑制作用，所测试的9个蛇麻烷型乳菇菌素都具有较强的抗肿瘤活性，其中乳菇菌素Mitissimol D活性最强，对A549(人肺腺癌细胞株)，HCT-8(人结肠癌细胞株)，Bel-7402(人肝癌细胞株)，Hela(人宫颈癌细胞株)的半数抑制浓度IC₅₀分别为2.5，11.0，3.6，4.6μg/ml，与阳性对照药剂顺铂几乎相当，这一类化合物有望成为新的抗肿瘤药物，显示出良好的应用价值。
针对上述试验结论本发明提供这种具有抗肿瘤活性的乳菇菌素作为制备抗肿瘤药物的应用，包括临床上用于制备以乳菇菌素为有效成分的抗肿瘤药物。制备含有乳菇菌素药学上可接受的盐、溶剂化物、或相应的结晶形态的物质为有效成分，并且加入药物可接受的载体或辅助成分的抗肿瘤药物。
以本发明具有抗肿瘤活性的乳菇菌素为主要有效成分的药物制剂还可包括添加药物可接受的载体制成药物组合物制剂形式，包括：片剂、糖衣片剂、薄膜衣片剂、肠溶衣片剂、胶囊剂、硬胶囊剂、软胶囊剂、口服液、口含剂、颗粒剂、冲剂、丸剂、散剂、膏剂、丹剂、混悬剂、溶液剂、注射剂、栓剂、软膏剂、硬膏剂、霜剂、喷雾剂、滴剂、贴剂、缓释制剂、控释制剂。本发明的制剂，优选的是注射剂型，如：冻干粉针剂，注射液，大输液，小水针，注射用乳剂等。
以本发明具有抗肿瘤活性的乳菇菌素为主要有效成分的药物制剂，可按照制剂学常规技术制备。
以本发明具有抗肿瘤活性的乳菇菌素为主要有效成分的药物制剂，其口服给药的制剂可含有常用的赋形剂，诸如粘合剂、填充剂、稀释剂、压片剂、润滑剂、崩解剂、着色剂、调味剂和湿润剂，必要时可对片剂进行包衣。
适用的填充剂包括纤维素、甘露糖醇、乳糖和其它类似的填充剂。适宜的崩解剂包括淀粉、聚乙烯吡咯烷酮和淀粉衍生物，例如羟基乙酸淀粉钠。适宜的润滑剂，例如硬脂酸镁。适宜的药物可接受的湿润剂包括十二烷基硫酸钠。
可通过混合，填充，压片等常用的方法制备固体口服组合物。进行反复混合可使活性物质分布在整个使用大量填充剂的那些组合物中。
以本发明具有抗肿瘤活性的乳菇菌素为主要有效成分的药物制剂，可以是水性或油性悬浮液、溶液、乳剂、糖浆剂或酏剂，或者可以是一种在使用前可用水或其它适宜的载体复配的干燥产品。这种液体制剂可含有常规的添加剂，诸如悬浮剂，例如山梨醇、糖浆、甲基纤维素、明胶、羟乙基纤维素、羧甲基纤维素、硬脂酸铝凝胶或氢化食用脂肪，乳化剂，例如卵磷脂、脱水山梨醇—油酸酯或阿拉伯胶；非水性载体(它们可以包括食用油)，例如杏仁油、分馏椰子油、诸如甘油的酯的油性酯、丙二醇或乙醇；防腐剂，例如对羟基苯甲酯或对羟基苯甲酸丙酯或山梨酸，并且如果需要，可含有常规的香味剂或着色剂。
以本发明具有抗肿瘤活性的乳菇菌素为主要有效成分的注射剂，可以将此配合物悬浮或者溶解，溶液的制备通常是通过将活性物质溶解在一种载体中，在将其装入一种适宜的小瓶或安瓿前过滤消毒，然后密封。辅料例如一种局部麻醉剂、防腐剂和缓冲剂也可以溶解在这种载体中。为了提高其稳定性，可在装入小瓶以后将这种组合物冰冻，并在真空下将水除去。
以本发明具有抗肿瘤活性的乳菇菌素为主要有效成分的药物制剂，在制备成药剂时可选择性的加入药物可接受的载体选自：甘露醇、山梨醇、焦亚硫酸钠、亚硫酸氢钠、硫代硫酸钠、盐酸半胱氨酸、巯基乙酸、蛋氨酸、维生素C、EDTA二钠、EDTA钙钠，—价碱金属的碳酸盐、醋酸盐、磷酸盐或其水溶液、盐酸、醋酸、硫酸、磷酸、氨基酸、氯化钠、氯化钾、乳酸钠、木糖醇、麦芽糖、葡萄糖、果糖、右旋糖苷、甘氨酸、淀粉、蔗糖、乳糖、甘露糖醇、硅衍生物、纤维素及其衍生物、藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、甘油、土温80、琼脂、碳酸钙、碳酸氢钙、表面活性剂、聚乙二醇、环糊精、β—环糊精、磷脂类材料、高岭土、滑石粉、硬脂酸钙、硬脂酸镁等。
以本发明具有抗肿瘤活性的乳菇菌素为主要有效成分的药物制剂，在使用时根据病人的情况确定用法用量。
以本发明具有抗肿瘤活性的乳菇菌素为主要有效成分的药物制剂，可以是
单位剂量形式，在制成药剂时，单位剂量的药剂可含有本发明的具有抗肿瘤活性的乳菇菌素或其药学上可接受的盐、溶剂化物、和相应的结晶形态的物质0.1-1000mg，占单位制剂总重量的0.1-99.9％，其余为药学上可接受的载体，药学上可接受的载体以重量计可以是制剂总重量的0.1-99.9％。
本发明列举的实施例旨在更进一步地阐明这一类具有抗肿瘤活性的乳菇菌素的结构、制备方法、制剂方法和应用方向，而不对本发明的保护范围构成任何限制。