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蔗糖水解酶的突变体及其应用
    【技术领域】
     本发明涉及一种蔗糖水解酶突变体，以及该突变体酶在蔗糖降解中的应用。背景技术 蔗糖是植物中光合作用产生的可再生的碳水化合物，每年全球产量超过了 5 亿 吨 ( 马尔克斯 · 萨瓦亚 · 亚克，蔗糖乙醇的中巴合作，商务周刊，2009，1 ：72)。
     蔗 糖 水 解 酶 (β-D-fructofuranoside fructohydrolase， EC 3.2.1.26) 是 一 类 把 蔗 糖水解成葡萄糖和果糖的水解酶。 目前鉴定的蔗糖水解酶主要是来自植物和真菌如酵 母 和 曲 霉 (Lammens W.， et al，2008， Crystal structures of Arabidopsis thaliana cell-wall invertase mutants in complex with sucrose.J.Mol.Biol.，377 ：378-385.)。 蔗 糖 水 解 酶 在 生物体中具有不同的形式，根据最适 pH 值的范围不同被分为三类，酸性、中性、碱性
     (L.H.S.， et al.， Production and characterization of a thermostable extracellular[beta]-d-fructofuranosidase produced by Aspergillus ochraceus with agroindustrial residues as carbon sources.Enzyme and Microbial Technology，2007.42(1) ：52-57.)。 按照进化起源 上，蔗糖水解酶可以分为两类，酸性蔗糖水解酶是一类 ；中性和碱性又是一类 (Bocock P.N.， et al.，2008， Evolution and diversity of invertase genes in Populus trichocarpa.Planta， 227 ：565-576.)。 酸性蔗糖水解酶是目前研究得最多的蔗糖水解酶，其中来自酿酒酵母 的酸性蔗糖水解酶又是最受关注的 (Goosen C.， et al.，2007， Molecular and biochemical characterization of a novel intracellular invertase from Aspergillus niger with transfructosylating activity.Eukaryot.Cell，6 ：674-681.De Los Angeles Calixto-Romo M.， etal.，2008)， Expression ， purification and immobilization of the intracellular invertase INVA ， from Zymomonas mobilis on crystalline cellulose and Nylon-6.J.Ind.Microbiol.Biotechnol.，35 ： 1455-1463.) ；而中、碱性蔗糖水解酶由于纯化的难度以及酶蛋白不稳定，目前被研究 的 比 较 少 (Roitsch T.， et al.，2004， Function and regulation of plant invertases ：sweet sensations.Trends Plant Sci.，9 ：606-613.)。
     在食品工业许多产品的生产中，用于水解蔗糖的蔗糖水解酶的最适宜 pH 值通常 是在中性的范围内的 (Serna-Saldivar S.R.， et al.，2008， Production of invert syru p from sugarcane juice using immobilized invertase.US patent 7435564.)。 目前，一些研究小组正在 寻找各种方法以提高蔗糖水解酶的最适 pH 值。 Sanjar 等人通过方式将蔗糖酶固定，成 功地将酵母蔗糖水解酶的最适 pH 值从 5.0 提高到 6.0(Sanjar G.， et al.，2006， Enhanced pH and thermal stabilities of invertase immobilized on montmorillonite K-10.Food Chem.，94 ： 573-579.)。 寻找适合于食品工业生产的新的中性蔗糖水解酶，提高水解蔗糖的速度，从而 缩短发酵生产时间，对于降低利用蔗糖生产各种食品的生产成本具有十分重要的意义。 发明内容
     本发明的目的是通过对蔗糖水解酶的改造，使之获得新的蔗糖水解酶突变体，这个突变体酶可用于蔗糖水解。
     本发明所述的新的蔗糖水解酶突变体 Sinv2(SEQ ID NO ：1)，其是通过分子改 造蔗糖水解酶基因 inv2(GenBank 序列号 HQ267532) 而得到的，具体是通过缺失 inv2 分子 上的前 360 个碱基，改造得到一个新的蔗糖水解酶突变体。 这个蔗糖水解酶突变体和原 酶相比，水解蔗糖的活性获得了 1 倍的提高，同时酶反应的最适 pH 值由酸性 4.5 变为中 性 6.0。
     SEQ ID NO ：1 的蛋白质是蔗糖水解酶突变体 Sinv2，由 466 个氨基酸组成。 氨 基酸序列如下 ：
     序列特征 ：
     长度 ：466 氨基酸
     类型 ：多肽
     链型 ：单链
     几何结构 ：立体
     分子类型 ：蛋白质
     序列描述 ：
     Phe Arg Pro Gly Phe His Phe Thr Pro Glu Tyr Gly Trp Met Asn
     1 5 10 15
     Asp Pro Asn Gly Leu Val Tyr Leu Asp Gly Glu Tyr His Leu Phe
     16 20 25 30
     Tyr Gln Tyr Asn Pro Tyr Gly Asn Arg Trp Gly Asn Met His Trp
     31 35 40 45
     Gly His Ala Val Ser Thr Asp Leu Thr Ser Trp Thr Tyr Leu Pro
     46 50 55 60
     Thr Ala Ile Glu Pro Asp Lys Leu Gly Asp Ile Phe Ser Gly Ser
     61 65 70 75
     Ala Val Val Asp Ser Thr Asn Ser Ala Gly Phe Gly Lys Asn Ala
     76 80 85 90
     Leu Ile Ala Ile Tyr Thr Ala Asn Gly Ala Thr Gln Gln Gln Cys
     91 95 100 105
     Ile Ala Tyr Ser Ile Asp Lys Gly Arg Thr Phe Thr Lys Tyr Glu
     106 110 115 120
     Lys Asn Pro Val Leu Pro Asn Pro Gly Ile Lys Asp Phe Arg Asp
     121 125 130 135
     Pro Lys Val His Trp Asn Glu Gln Ala Lys Gln Trp Val Met Ala
     136 140 145 150
     Leu Ala Thr Gln Gln Thr Ile Thr Phe Phe Gly Ser Pro Asp Leu
     151 155 160 165
     Lys Asn Trp Thr Arg Leu Ser Glu Phe Gly Lys Asn Tyr Gly Ala
     166 170 175 1805CN 102021156 A CN 102021170 A
     说明书Phe Pro Leu Glu Phe 195 Ser Ile Asn Pro Gly 210 Phe Ile Gly Asp Phe 225 Pro Tyr Pro Leu Trp 240 Val Thr Phe Ser Asn 255 Met Gly Trp Met Ser 270 Lys Ser Phe Arg Asn 285 Ala Ser Asn Gly Gln Glu Val Thr Lys Leu Val Asn Ser Asn Gly Lys Phe Lys Val Trp Gly Asn Phe Thr Phe Arg Asn Thr Gly Pro Phe Ala Pro Phe Met Asp Lys Thr Val Leu Thr Leu Thr Phe Phe Lys Ile Phe Glu 300 Leu 315 Glu 330 Glu 345 Phe 360 Asp 375 Ile 390 Leu 405 Ala 420 Asn 435 Thr 450 Ile 4653/6 页His 181 Glu 196 Gly 211 Asp 226 Val 241 Ile 256 Asn 271 AlaGly Gly Val Trp 185 Gly Lys Thr Lys 200 Pro Asn Gly Gly 215 Gly Lys Thr Phe 230 Asp Tyr Gly Arg 245 Gly Lys Asn Asp 260 Trp Asp Tyr Ala 275 Met Thr Leu Pro Ile Leu Lys Ser Ile Thr Met Thr Lys Asn Gln Lys Phe Ser His Asp Glu Ile Phe Pro Lys Pro 290 Thr 305 Gly 320 Asn 335 Ile 350 Glu 365 Ile 380 Gln 395 Ser 410 Phe 425 Ser 440 Trp 455Glu Cys Pro Asp Leu 190 Trp Val Leu Leu Val 205 Ser Ala Thr Gln Tyr 220 Ser Ala Asp Pro Leu 235 Asp Asp Tyr Ala Gly 250 Gly Arg Arg Ile Phe 265 Asn Asp Val Pro Thr 280 Arg Glu Leu Lys Leu Ser Ala Pro Val Glu Thr Ile Asn Val Leu Gln Asp Gln Arg Lys Asp Leu Gly Asp Tyr Leu Lys Val Asp Lys Phe Ala Thr Tyr Thr Ile Arg Ile Asn Asp Gly Gln Thr Tyr Lys Asn Val Glu Asn 295 Ser 310 Ile 325 Phe 340 Ala 355 Leu 370 Arg 385 Glu 400 Leu 415 Glu 430 Ser 445 Leu 460286 His Leu 301 Arg Gly 316 Lys Ser 331 Leu Asn 346 Gly Leu 361 Trp Glu 376 Lys Glu 391 Ala Lys 406 Ser Ser 421 Leu Val 436 Ala Asn 451 Lys。466 本发明还涉及含有本发明蔗糖水解酶突变体的宿主。 本发明所述的新的蔗糖水解酶突变体，该突变体酶在蔗糖的降解中具有广泛的用途。 其特殊在于它的最适 pH 变为中性同时水解蔗糖的能力提高 1 倍，该突变体蛋白 质可用于蔗糖的降解。
     本发明所述的新的蔗糖水解酶突变体的制备方法包括蔗糖水解酶基因的克隆、 蔗糖水解酶突变体基因的获得、蔗糖水解酶突变体基因的表达和纯化以及蔗糖水解酶突 变体水解蔗糖酶活的测定等步骤，具体如下 ：
     1) 蔗糖水解酶基因 inv2 的克隆
     使用上游引物 inv-1 ：5’-CACTCATGATGCACCACCACCACCACCACAATAGA CAGATGAATCCAGGTC-3’ ( 包含一个 PagI 酶切位点和一个 6xHis 标签在 5’ 末端 ) 和 下游引物 inv-2 ：5’ -CACCTGCAGACGATGATTTCACAGATGCAAGC-3’ ( 包含一个 PstI 酶切位点 )，通过聚合酶链式反应 (PCR) 扩增蔗糖水解酶基因 inv2，用限制性内切酶 PagI 和 Pst I 酶切蔗糖水解酶基因 inv2 后，插入到经 NcoI 和 Pst I 酶切的表达载体 pSE380 进行连接。 获得的重组质粒命名为 pSE-inv2。
     2) 蔗糖水解酶突变体基因 Sinv2 的获得
     Sinv2 基因是根据 inv2 基因序列信息从 inv2 基因的 361 位碱基开始设计引物来 进行改造。 以 1) 中构建的 pSE-inv2 为模板，使用上游引物 Sinv ：5’ -CACTCATGAT GCACCACCACCACCACCACTTTCGACCTGGATTTCATTTC-3’ ( 包含一个 PagI 酶切位 点和一个 6xHis 标签在 5’ 末端 ) 和下游引物 inv-2 进行 PCR， PCR 反应程序 ：第一步 95℃ 2 分钟 ；第二步进行 30 个循环，循环为 98℃ 10 秒，54℃ 15 秒，72℃ 1.5 分钟 ；第 三步 72℃ 10 分钟。 PCR 产物用限制性内切酶 PagI 和 Pst I 酶切后，插入到经 NcoI 和 Pst I 酶切的表达载体 pSE380，转化到 XL1-Blue 感受态细胞 (CaCl2 化学法转化 )。 然后进 行 DNA 测序分析确定正确的转化子。
     3) 蔗糖水解酶突变体基因 Sinv2 的表达和表达产物的纯化
     将含有质粒 pSE-Sinv2 的重组大肠杆菌菌株接种、培养基、超声波破胞、离心、 纯化、层析、洗脱，收集洗脱的蛋白质溶液，验证，发现有一条目的大小的蛋白质条 带。
     4) 蔗糖水解酶突变体 Sinv2 水解蔗糖酶活的测定
     将蔗糖水解酶突变体 Sinv2 纯化物，加入 DNS 溶液溶解，加入试剂混合，放置 沸水中反应，室温冷却，用分光光度计测吸光度 OD600。 利用吸光度测定值来计算酶活。
     将获得的突变前的 Inv2 和突变后的 Sinv2 的酶活和最适 pH 的实验数据作图。 结 果发现 ：蔗糖水解酶突变体 Sinv2 的最适 pH 值由 4.5 提高到 6.0，同时水解蔗糖的酶活提 高 1 倍。
     具体实施方式
     下述实施方法是为了更好的解释本发明，而不应该被解释为限制本发明的目 的。在 本 发 明 的 实 施 例 中 所 用 到 的 材 料 包 括 ：大 肠 杆 菌 (Escherichia coli) 株 系 XL1-Blue( 购自 TaKaRa 公司 ) ；载体为购自 Intrivogen 公司的表达载体 pSE380 ；购自 Intrivogen 公司的 Ni-NTA 蛋白质组氨酸纯化介质 ；购自 TaKaRa、MBI 的限制性内切酶、 修饰酶。
     下面将通过实施例对本发明作详细描述 ：
     1) 蔗糖水解酶基因 inv2 的克隆
     使用上游引物 inv-1 ：5’ -CACTCATGA TGCACCACCACCACCACCACAATAG ACAGATGAATCCAGGTC-3’( 包含一个 PagI 酶切位点和一个 6xHis 标签在 5’末端 ) 和 下游引物 inv-2 ：5’ -CACCTGCAGACGATGATTTCACAGATGCAAGC-3’ ( 包含一个 PstI 酶切位点 )，通过聚合酶链式反应 (PCR) 扩增蔗糖水解酶基因 inv2，用限制性内切酶 PagI 和 Pst I 酶切蔗糖水解酶基因 inv2 后，插入到经 NcoI 和 Pst I 酶切的表达载体 pSE380 进行连接。 获得的重组质粒命名为 pSE-inv2。
     2) 蔗糖水解酶突变体基因 Sinv2 的获得
     Sinv2 基因是根据 inv2 基因序列信息从 inv2 基因的 361 位碱基开始设计引物来进 行改造。 以 1) 中构建的 pSE-inv2 为模板，使用上游引物 Sinv ：5’ -CACTCATGATGC ACCACCACCACCACCACTTTCGACCTGGATTTCATTTC-3’( 包含一个 PagI 酶切位点和 一个 6xHis 标签在 5’末端 ) 和下游引物 inv-2 进行 PCR，PCR 反应程序 ：第一步 95℃ 2 分钟 ；第二步进行 30 个循环，循环为 98 ℃ 10 秒，54 ℃ 15 秒，72 ℃ 1.5 分钟 ；第三步 72℃ 10 分钟。 PCR 产物用限制性内切酶 PagI 和 Pst I 酶切后，插入到经 NcoI 和 Pst I 酶 切的表达载体 pSE380，转化到 XL1-Blue 感受态细胞 (CaCl2 化学法转化 )。 转化产物克 隆送交上海生物工程有限公司进行 DNA 测序分析确定正确的转化子。
     3) 蔗糖水解酶突变体基因 Sinv2 的表达和表达产物的纯化
     将含有质粒 pSE-Sinv2 的重组大肠杆菌 XL1-Blue 菌株接种到 20mL 含氨苄青霉 素 (100μg/mL) 的 LB 培养基中，37 ℃振荡培养，待 OD600 为 0.6 时，加入 IPTG( 终浓 度为 1mmol/L)30 ℃诱导 10 小时。 11000 转离心 3min，收集菌体，用 4mL 裂解缓冲液 (50mmol/LNaH2PO4，300mmol/L NaCl，10mmol/L 咪唑， pH 8.0) 重悬菌体，超声波破 胞 9min。 12000 转离心 10min，取上清进行后面的蛋白质纯化。 按每 4ml 上清液加入 1mL 50％的镍亲和层析胶体，在 4℃用 200 转摇 60 分钟，把混合物灌注到柱子，收集流 出物。 加 1ml 冲洗缓冲液 (50mmol/L NaH2PO4，300mmol/L NaCl，20mmol/L 咪唑，pH 8.0) 到柱子里，缓慢搅拌，收集流出物。 重复冲洗步骤 4 次。 加入洗脱缓冲液 (50mmol/ L NaH2PO4，300mmol/LNaCl，250mmol/L 咪唑，pH 8.0) 洗脱蛋白质。 收集洗脱的蛋白 质溶液，用变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS-PAGE) 验证，发现有一条目的大小的蛋白 质条带。
     4) 蔗糖水解酶突变体 Sinv2 水解蔗糖酶活的测定
     取 5μL 蔗糖水解酶突变体 Sinv2 纯化物，加入 500μL 1％ (w/v) 蔗糖 ( 溶于 pH 7.0、100mmol/L 的磷酸缓冲液中 ) 溶液混合，在 45℃作用 30 分钟后，加入 1mL DNS 溶 液 [DNS 试剂配制 ：称取 1 克氢氧化钠用约 40mL 双蒸水溶解，再称取 1 克二硝基水杨 酸、0.2 克苯酚、0.05 克无水亚硫酸钠、20 克四水酒石酸钾钠，将其溶解于约 30mL 双蒸 水中，两种溶液混合，定容到 100mL。 ]，放置沸水中反应 5 分钟，室温冷却，用分光光度计测吸光度 OD600。 利用吸光度测定值来计算酶活。
     将获得的突变前的 Inv2 和突变后的 Sinv2 的酶活和最适 pH 的实验数据作图。 结 果发现 ：蔗糖水解酶突变体 Sinv2 的最适 pH 值由 4.5 提高到 6.0，同时水解蔗糖的酶活提 高 1 倍。 附图说明 ：
     图 1 是蔗糖水解酶突变体 Sinv2 纯化物的 SDS-PAGE 图。
     图 2 是蔗糖水解酶突变前后 (Inv2 和 Sinv2) 酶活及最适 pH 的比较图。
     从图 1 了解到，蔗糖水解酶突变体 Sinv2 纯化物的分子量为 51kDa。
     蔗 糖 水 解 酶 (β-D-fructofuranoside fructohydrolase， EC 3.2.1.26) 是 一 类 把 蔗 糖水解成葡萄糖和果糖的水解酶。 目前鉴定的蔗糖水解酶主要是来自植物和真菌如酵 母 和 曲 霉 (Lammens W.， et al，2008， Crystal structures of Arabidopsis thaliana cell-wall invertase mutants in complex with sucrose.J.Mol.Biol.，377 ：378-385.)。 蔗 糖 水 解 酶 在 生物体中具有不同的形式，根据最适 pH 值的范围不同被分为三类，酸性、中性、碱性
    (L.H.S.， et al.， Production and characterization of a thermostable extracellular[beta]-d-fructofuranosidase produced by Aspergillus ochraceus with agroindustrial residues as carbon sources.Enzyme and Microbial Technology，2007.42(1) ：52-57.)。 按照进化起源 上，蔗糖水解酶可以分为两类，酸性蔗糖水解酶是一类 ；中性和碱性又是一类 (Bocock P.N.， et al.，2008， Evolution and diversity of invertase genes in Populus trichocarpa.Planta， 227 ：565-576.)。 酸性蔗糖水解酶是目前研究得最多的蔗糖水解酶，其中来自酿酒酵母 的酸性蔗糖水解酶又是最受关注的 (Goosen C.， et al.，2007， Molecular and biochemical characterization of a novel intracellular invertase from Aspergillus niger with transfructosylating activity.Eukaryot.Cell，6 ：674-681.De Los Angeles Calixto-Romo M.， etal.，2008)， Expression ， purification and immobilization of the intracellular invertase INVA ， from Zymomonas mobilis on crystalline cellulose and Nylon-6.J.Ind.Microbiol.Biotechnol.，35 ： 1455-1463.) ；而中、碱性蔗糖水解酶由于纯化的难度以及酶蛋白不稳定，目前被研究 的 比 较 少 (Roitsch T.， et al.，2004， Function and regulation of plant invertases ：sweet sensations.Trends Plant Sci.，9 ：606-613.)。
     在食品工业许多产品的生产中，用于水解蔗糖的蔗糖水解酶的最适宜 pH 值通常 是在中性的范围内的 (Serna-Saldivar S.R.， et al.，2008， Production of invert syru p from sugarcane juice using immobilized invertase.US patent 7435564.)。 目前，一些研究小组正在 寻找各种方法以提高蔗糖水解酶的最适 pH 值。 Sanjar 等人通过方式将蔗糖酶固定，成 功地将酵母蔗糖水解酶的最适 pH 值从 5.0 提高到 6.0(Sanjar G.， et al.，2006， Enhanced pH and thermal stabilities of invertase immobilized on montmorillonite K-10.Food Chem.，94 ： 573-579.)。 寻找适合于食品工业生产的新的中性蔗糖水解酶，提高水解蔗糖的速度，从而 缩短发酵生产时间，对于降低利用蔗糖生产各种食品的生产成本具有十分重要的意义。 发明内容
     本发明的目的是通过对蔗糖水解酶的改造，使之获得新的蔗糖水解酶突变体，这个突变体酶可用于蔗糖水解。
     本发明所述的新的蔗糖水解酶突变体 Sinv2(SEQ ID NO ：1)，其是通过分子改 造蔗糖水解酶基因 inv2(GenBank 序列号 HQ267532) 而得到的，具体是通过缺失 inv2 分子 上的前 360 个碱基，改造得到一个新的蔗糖水解酶突变体。 这个蔗糖水解酶突变体和原 酶相比，水解蔗糖的活性获得了 1 倍的提高，同时酶反应的最适 pH 值由酸性 4.5 变为中 性 6.0。
     SEQ ID NO ：1 的蛋白质是蔗糖水解酶突变体 Sinv2，由 466 个氨基酸组成。 氨 基酸序列如下 ：
     序列特征 ：
     长度 ：466 氨基酸
     类型 ：多肽
     链型 ：单链
     本发明涉及一种蔗糖水解酶突变体，以及该突变体酶在蔗糖降解中的应用。背景技术 蔗糖是植物中光合作用产生的可再生的碳水化合物，每年全球产量超过了 5 亿 吨 ( 马尔克斯 · 萨瓦亚 · 亚克，蔗糖乙醇的中巴合作，商务周刊，2009，1 ：72)。
     蔗 糖 水 解 酶 (β-D-fructofuranoside fructohydrolase， EC 3.2.1.26) 是 一 类 把 蔗 糖水解成葡萄糖和果糖的水解酶。 目前鉴定的蔗糖水解酶主要是来自植物和真菌如酵 母 和 曲 霉 (Lammens W.， et al，2008， Crystal structures of Arabidopsis thaliana cell-wall invertase mutants in complex with sucrose.J.Mol.Biol.，377 ：378-385.)。 蔗 糖 水 解 酶 在 生物体中具有不同的形式，根据最适 pH 值的范围不同被分为三类，酸性、中性、碱性
    (L.H.S.， et al.， Production and characterization of a thermostable extracellular[beta]-d-fructofuranosidase produced by Aspergillus ochraceus with agroindustrial residues as carbon sources.Enzyme and Microbial Technology，2007.42(1) ：52-57.)。 按照进化起源 上，蔗糖水解酶可以分为两类，酸性蔗糖水解酶是一类 ；中性和碱性又是一类 (Bocock P.N.， et al.，2008， Evolution and diversity of invertase genes in Populus trichocarpa.Planta， 227 ：565-576.)。 酸性蔗糖水解酶是目前研究得最多的蔗糖水解酶，其中来自酿酒酵母 的酸性蔗糖水解酶又是最受关注的 (Goosen C.， et al.，2007， Molecular and biochemical characterization of a novel intracellular invertase from Aspergillus niger with transfructosylating activity.Eukaryot.Cell，6 ：674-681.De Los Angeles Calixto-Romo M.， etal.，2008)， Expression ， purification and immobilization of the intracellular invertase INVA ， from Zymomonas mobilis on crystalline cellulose and Nylon-6.J.Ind.Microbiol.Biotechnol.，35 ： 1455-1463.) ；而中、碱性蔗糖水解酶由于纯化的难度以及酶蛋白不稳定，目前被研究 的 比 较 少 (Roitsch T.， et al.，2004， Function and regulation of plant invertases ：sweet sensations.Trends Plant Sci.，9 ：606-613.)。
     在食品工业许多产品的生产中，用于水解蔗糖的蔗糖水解酶的最适宜 pH 值通常 是在中性的范围内的 (Serna-Saldivar S.R.， et al.，2008， Production of invert syru p from sugarcane juice using immobilized invertase.US patent 7435564.)。 目前，一些研究小组正在 寻找各种方法以提高蔗糖水解酶的最适 pH 值。 Sanjar 等人通过方式将蔗糖酶固定，成 功地将酵母蔗糖水解酶的最适 pH 值从 5.0 提高到 6.0(Sanjar G.， et al.，2006， Enhanced pH and thermal stabilities of invertase immobilized on montmorillonite K-10.Food Chem.，94 ： 573-579.)。 寻找适合于食品工业生产的新的中性蔗糖水解酶，提高水解蔗糖的速度，从而 缩短发酵生产时间，对于降低利用蔗糖生产各种食品的生产成本具有十分重要的意义。 发明内容
    本发明的目的是通过对蔗糖水解酶的改造，使之获得新的蔗糖水解酶突变体，这个突变体酶可用于蔗糖水解。
     本发明所述的新的蔗糖水解酶突变体 Sinv2(SEQ ID NO ：1)，其是通过分子改 造蔗糖水解酶基因 inv2(GenBank 序列号 HQ267532) 而得到的，具体是通过缺失 inv2 分子 上的前 360 个碱基，改造得到一个新的蔗糖水解酶突变体。 这个蔗糖水解酶突变体和原 酶相比，水解蔗糖的活性获得了 1 倍的提高，同时酶反应的最适 pH 值由酸性 4.5 变为中 性 6.0。
     SEQ ID NO ：1 的蛋白质是蔗糖水解酶突变体 Sinv2，由 466 个氨基酸组成。 氨 基酸序列如下 ：
     序列特征 ：
     长度 ：466 氨基酸
     类型 ：多肽
     链型 ：单链
     几何结构 ：立体
     分子类型 ：蛋白质
     序列描述 ：
     Phe Arg Pro Gly Phe His Phe Thr Pro Glu Tyr Gly Trp Met Asn
     1 5 10 15
     Asp Pro Asn Gly Leu Val Tyr Leu Asp Gly Glu Tyr His Leu Phe
     16 20 25 30
     Tyr Gln Tyr Asn Pro Tyr Gly Asn Arg Trp Gly Asn Met His Trp
     31 35 40 45
     Gly His Ala Val Ser Thr Asp Leu Thr Ser Trp Thr Tyr Leu Pro
     46 50 55 60
     Thr Ala Ile Glu Pro Asp Lys Leu Gly Asp Ile Phe Ser Gly Ser
     61 65 70 75
     Ala Val Val Asp Ser Thr Asn Ser Ala Gly Phe Gly Lys Asn Ala
     76 80 85 90
     Leu Ile Ala Ile Tyr Thr Ala Asn Gly Ala Thr Gln Gln Gln Cys
     91 95 100 105
     Ile Ala Tyr Ser Ile Asp Lys Gly Arg Thr Phe Thr Lys Tyr Glu
     106 110 115 120
     Lys Asn Pro Val Leu Pro Asn Pro Gly Ile Lys Asp Phe Arg Asp
     121 125 130 135
     Pro Lys Val His Trp Asn Glu Gln Ala Lys Gln Trp Val Met Ala
     136 140 145 150
     Leu Ala Thr Gln Gln Thr Ile Thr Phe Phe Gly Ser Pro Asp Leu
     151 155 160 165
     Lys Asn Trp Thr Arg Leu Ser Glu Phe Gly Lys Asn Tyr Gly Ala
     166 170 175 1805CN 102021156 A CN 102021170 A