新的取代的丙酰胺苯甲酰脲衍生物， 含它们的药物组合物及其用途 【发明领域】
本发明涉及新的2-取代丙酰胺苯甲酰脲衍生物或其药用盐，其制备方法，含它们的药物组合物及其作为微管蛋白抑制剂的用途。
背景技术
微管是真核生物细胞骨架的重要组成成分，参与细胞的分裂，运动和物质运输等，具有多种生物学活性。阻断微管功能的抗微管药物广泛运用于医学领域，比较熟知的有抗肿瘤，抗痛风，细胞核型诊断试剂，抗寄生虫及农业上的杀虫剂等方面。抗微管蛋白药物是目前有效的一类抗肿瘤药物，它能干扰细胞分裂中纺锤体的形成，从而使细胞停滞在有丝分裂中期，阻断细胞分裂增值；同时，由于微管是信号传导和物质运输的通道，干扰微管的形成可影响与凋亡相关的信号传导通路，引起细胞凋亡；基于这些抗肿瘤分子机制的阐明，这类抗肿瘤药日益引起人们的关注。微管蛋白抑制剂主要可分为两种类型：一类是紫杉醇型，其促进微管蛋白聚合，抑制微管解聚；紫杉醇自1989年问世，相继有紫杉醇类似物产生：Epothilone(1995)，Discodermolide(1996)，Eleutherobins(1997)and DepoB & DepoF(2001)等；另一类是秋水仙素或长春新碱型，与微管蛋白结合，抑制微管聚合。这类药物的类似物有：phomopsinA(1995)，cryptophycin(1998)，2-aroylindoles(2001)。
发明目的
本发明的目的是寻找新的微管蛋白抑制剂。
发明简述
本发明人经研究现已发现2-取代的丙酰胺苯甲酰脲衍生物或其药用盐具有优良地抑制微管蛋白组装的作用，从而可成为有效的抗肿瘤化合物。
由此，本发明第一方面涉及式I的2-取代丙酰胺苯甲酰脲衍生物或其药用盐
式I
其中X为卤素，如氟、氯、溴或碘。
本发明还涉及作为抗肿瘤剂的式I 2-取代丙酰胺苯甲酰脲衍生物或其药用盐
其中X为卤素，如氟、氯、溴或碘。
本发明还涉及药物组合物，其包括式I 2-取代的丙酰胺苯甲酰胺衍生物或其药用盐及药用赋形剂或载体。
本发明还涉及作为微管蛋白抑制剂或抗肿瘤剂的药物组合物，其包括式I 2-取代的丙酰胺苯甲酰胺衍生物或其药用盐及药用赋形剂或载体。
本发明还涉及式I 2-取代的丙酰胺苯甲酰脲衍生物或其药用盐在制备用于治疗肿瘤或与微管蛋白组装有关疾病的药物中的用途。
本发明还涉及治疗肿瘤或与微管蛋白组装有关疾病的方法，其包括将治疗有效量的式I 2-取代丙酰胺苯甲酰脲衍生物给药于需治疗的患者。
本发明进一步涉及式I 2-取代丙酰胺苯甲酰脲衍生物或其药用盐的制备方法，其包括将下式的化合物
与下式化合物反应，
其中X为卤素。
发明详述
根据本发明，“X”为氟，氯，溴或碘，优选为溴。
根据本发明，优选X为溴的式I化合物，即3-(2-溴代丙酰氨基)苯甲酰脲。
根据本发明，式I丙酰胺苯甲酰脲衍生物的药用盐包括式I丙酰胺苯甲酰脲衍生物与无机酸或有机酸形成的药用盐，无机酸举例有：盐酸，硫酸或磷酸；有机酸举例有：甲酸，乙酸，苯甲酸，甲磺酸，乙磺酸。
本发明中所用术语“患者”意指哺乳动物，例如人。
根据本发明，本发明的化合物或药物组合物可单独或通过口服或非肠道或局部途径使用，口服的剂型举例讲有片剂，胶囊，溶液，混悬液，粉剂。非肠道给药的剂型举例讲有注射液，粉针剂等。
根据本发明，本发明所用的原料3-氨基苯甲酰脲的制备可见(Jiang ID，Roboz J.Weisz I.Deng L，Holland JF，Bekesi JG.Synthesis，canceridal and antimicrotubule activities of 3-(haloacetamido)-benzolureas.Anticancer Drug Des.1998，13(7)：735-747)。
式II化合物的制备可见“Beil 2，248；256。
【附图说明】
图1和图2表示本发明化合物1对微管组装和解聚的作用。图1具体表示在本发明化合物1(1或4μM)或paclitaxel(20μM)或长春碱(20μM)存在或不存在下于反应缓冲液中的游离微管与GTP和Mg2+D于37℃培养从而进行的组装；图2具体表示在本发明化合物1(32μM)或Paclitaxel(20μM)或长春碱(20μM)存在或不存在下组装的微管在冰中培养从而进行的解聚。微管的组装或解聚每5分钟于350nM测定OD(光密度)。
下面的实施例和生物活性试验用来进一步说明本发明，但不意味着对本发明的任何限制。
实施例1 3-(2-溴代丙酰氨基)苯甲酰脲的制备
将0.895g(5.0mmol)3-氨基苯甲酰脲于室温下溶解于1.0ml N，N-二甲基乙酰胺中，滴加1.0ml2-溴丙酰溴，并在室温下继续搅拌2小时，搅拌下加入100ml冰水，有沉淀析出，抽滤，用水充分洗涤，得灰白色固体，用甲醇重结晶，得白色固体0.8g，收率为51.1％。
Mp：252-254℃；
FAB：M+1：314；
IR(kBr)cm-1：1712cm-1，1674cm-1；
300MHZ，1H-NMR(d6-DMSO)：
δ：7.80(dd，1H，2-芳环氢)，7.68(d，1H，6-芳环氢)，
7.43(m，2H，4-5-芳环氢)，4.70(q，1H，-CHBr)，1.75(d，3H，-CH3)，10.55，10.52，8.14，8.0(4s，活泼氢)
本发明实施例1化合物(化合物1)的体外抗肿瘤活性
化合物1体外对肿瘤淋巴细胞和多种不同的实体瘤细胞的抑制作用见下面表1，其中化合物1的抗瘤活性以半数有效浓度IC50表示，IC50值在0.3μM-3.0μM之间，结果见表1。
表1.化合物1对多种肿瘤细胞的半数有效浓度IC50 肿瘤细胞系 IC50(μg/ml) CEM(人淋巴瘤细胞系) 0.061 HT-29(人结肠癌细胞系) 0.990 BEL-7402(人肝癌细胞系) 0.328 HepG2(人肝癌细胞系) 0.298 QGY-7701(人肝癌细胞系) 0.334
由表1结果可看到，本发明化合物对多种肿瘤细胞有良好的抑制作用。
化合物1对微管蛋白组装的抑制
纯化的牛脑微管蛋白购自Sigma(St.Lows，MO)。化合物1对微管蛋白组装一解组装过程的作用采用Vender建议的条件进行测定。对于组装抑制，是将100μl微管蛋白溶液(500-600μg蛋白/ml)温和地与400μl反应缓冲液(含0.1M MES，1mM EGTA，0.5mM MgCl2)，0.1mM EDTA和2.5M甘油于35℃混合。然后将化合物1加到每个样品池中。在加GTP到每个样品中使最终浓度为1mM之后，在分光光度计(pharmaceia LKB，Uppsala，Sweden)上于350nm每隔5分钟测量光密度(OD)的变化以监测微管蛋白组装过程。于室温40分钟内观察到整个组装过程。对于解组装的抑制，按上述方法将化合物1加到含再聚微管蛋白的池中，并在融冰中培养。于350nm监测OD变化30分钟直到对照组中OD值返回到起始水平，即组装一脱组装循环完全。溶剂用作对照但对组装或脱组装过程均无作用。结果见图A和B。图A和B表明本发明化合物1可抑制微管蛋白的组装，而不阻滞微管蛋白的解聚。
化合物1体内抗肿瘤作用
裸鼠(6-7周龄，16-20克重)来自中国医科院实验动物中心并用于人肝癌细胞BEC-7402异种移植。在培养前小心除去所有肿瘤移植组织的结缔组织和血块。在实验小鼠背部皮下移植人肿瘤细胞(4mm3/鼠)。一星期后，带肿瘤裸鼠随机分为溶剂对照和治疗组，每组8只小鼠。在移植后第8天腹膜给予化合物1(剂量5，10或15mg/kg)。每隔4天给予一次，再给予6次。每星期测肿瘤体积来观察治疗反应，直到对照组肿瘤体积达到2000mm3。由测经仪得到两个垂直肿瘤直径，宽和长，然后由下式得到肿瘤体积，
肿瘤肿瘤＝长×宽2×0.52，
结果见表2
表2.化合物1对人肝癌细胞裸鼠体内异种移植的生长抑制作用
组别 给药方案 动物数 体重(X±SD) 瘤体积 抑瘤率
开始 最后 (％)
对照 8 20.1±2.2 23.4±5.0 2026.8±1072.1
化合物1 i.p 7 19.2±2.1 21.9±3.6 831.8±477.0* 58.9
10mg/kg/4天
*P＜0.05