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1、10申请公布号CN104147127A43申请公布日20141119CN104147127A21申请号201410359788522申请日20140725A61K36/59200601A61P35/0020060171申请人黑龙江中医药大学地址150040黑龙江省哈尔滨市动力区和平路24号72发明人周忠光白云张英博仲丽丽李洋潘思文74专利代理机构北京科龙寰宇知识产权代理有限责任公司11139代理人孙皓晨王家印54发明名称一种治疗恶性肿瘤的中药组合物及其制备方法和应用57摘要本发明提供一种治疗恶性肿瘤的中药组合物及其制备方法和应用。所述中药组合物是由以下原料药制备得到北豆根，三七和黄芪，将各原料。
2、药粉碎后加入制剂成型所需的辅料，按照药物制剂常规方法做成临床上适宜的各种制剂，本发明的中药组合物其全方清热解毒、扶正固本驱邪，消肿止痛散瘀之功，经临床验证疗效满意。同时，本发明通过研究该中药组合物对体内和体外肿瘤模型的抗肿瘤作用及作用机制，为进一步研发治疗恶性肿瘤的中药新药提供客观依据。51INTCL权利要求书1页说明书9页附图2页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书9页附图2页10申请公布号CN104147127ACN104147127A1/1页21一种治疗恶性肿瘤的中药组合物，是由以下原料药制备得到北豆根，三七，黄芪。2根据权利要求1所述的中药组合物，是由以。
3、下重量份的各原料药制备得到北豆根515份，三七510份，黄芪1525份。3根据权利要求2所述的中药组合物，是由以下重量份的各原料药制备得到北豆根10份，三七75份，黄芪20份。4权利要求13任一项所述的中药组合物的制备方法，是将各原料药粉碎后加入制剂成型所需的辅料，按照药物制剂常规方法做成临床上适宜的各种制剂。5根据权利要求4所述的制备方法，所述的制剂包括胶囊剂、丸剂、颗粒剂、片剂或口服液。6权利要求13任一项所述的中药组合物，在制备治疗恶性肿瘤药物中的应用。权利要求书CN104147127A1/9页3一种治疗恶性肿瘤的中药组合物及其制备方法和应用技术领域0001本发明涉及中药组合物，具体涉及。
4、一种治疗恶性肿瘤的中药组合物，还涉及其制备方法和应用。背景技术0002恶性肿瘤是严重危害人类健康的大敌，己经成为我国城乡居民死亡的第一杀手，并呈逐年上升趋势。防治肿瘤是当代医学界的重大课题，广泛受到国内外医学界的关注。然而恶性肿瘤的治疗十分困难。西医的外科手术、放疗、化疗目前是治疗恶性肿瘤的三大基本手段。然而外科手术不但给病人带来巨大的生理和心理上的痛苦，而且其远期疗效也不尽人意。放疗和化疗的非特异性杀灭肿瘤细胞的作用导致正常细胞和脏器损害无法避免，以至于有些患者并非死于癌症本身，而是间接的死于放疗和化疗药物所带来的毒副反应。由以上不难看出，恶性肿瘤的三大常规治疗都存在一些弊端，人们期盼有一些。
5、新的方法和手段来与癌症作斗争。1994年，加拿大的SCHIPPER教授在关于恶性肿瘤概念的新模式中提出，有效的治疗并不需要肿瘤的完全消退，机体的反应性对癌瘤治疗最为重要。这一观点的提出与中医药治疗恶性肿瘤的扶正培本的特点相吻合。中药以其扶正增强机体免疫力、祛邪杀伤肿瘤细胞而又副作用少越来越受到重视。发明内容0003针对现有问题，本发明所要解决的技术问题是提供了一种用于治疗恶性肿瘤的中药组合物。全方清热解毒、扶正固本驱邪，消肿止痛散瘀之功，经临床验证疗效满意。本发明运用先进实验技术手段对中药组合物抗肿瘤作用及机制进行深入探讨。本发明将为研发出作用机制明确安全有效的抗肿瘤中药新药奠定基础,具有重要。
6、的理论意义和广阔的应用前景。0004为此，本发明提供一种治疗恶性肿瘤的中药组合物及应用。所述中药组合物是由以下原料药制备得到北豆根，三七，黄芪。0005具体的，所述中药组合物是由以下重量份的各原料药制备得到北豆根515份，三七510份，黄芪1525份。0006优选的，所述中药组合物是由以下重量份的各原料药制备得到北豆根10份，三七75份，黄芪20份。0007所述的原料药粉碎后加入制剂成型所需的辅料，按照药物制剂常规方法做成临床上适宜的各种制剂，所述的制剂包括胶囊剂、丸剂、颗粒剂、片剂或口服液。本发明制剂的制备方法属于常规制剂方法，在此无庸赘述。0008本发明的中药组合物可用于制备治疗恶性肿瘤的。
7、药物。0009本发明的中药组合物其全方清热解毒、扶正固本驱邪，消肿止痛散瘀之功，经临床验证疗效满意。同时，本发明通过研究该中药组合物对体内和体外肿瘤模型的抗肿瘤作用及作用机制，为进一步研发治疗恶性肿瘤的中药新药提供客观依据。说明书CN104147127A2/9页4附图说明0010图1为胰腺癌BXPC3细胞生长曲线；0011图2为本发明中药组合物对P2组胰腺癌小鼠异位移植瘤形态学的影响图；0012图3为本发明中药组合物对P1组胰腺癌小鼠异位移植瘤形态学的影响图；0013图4为本发明中药组合物对5FU组胰腺癌小鼠异位移植瘤形态学的影响图；0014图5为本发明中药组合物对M组胰腺癌小鼠异位移植瘤形态。
8、学的影响图。具体实施方式0015下面结合实施例对本发明作进一步说明，应该理解的是，这些实施例仅用于例证的目的，决不限制本发明的保护范围。0016所用的中药组合物按照以下方法制备0017按以下重量称取的各原料药北豆根10份，三七75份，黄芪20份。原料药用蒸馏水浸泡1H，水煎2次，每次30MIN，两次煎液混匀，旋转蒸发仪分别浓缩至50ML，4保存，制成水煎剂，用于以下研究00181资料与方法001911入选标准75例病人均为2011年9月2013年8月在黑龙江中医药大学附属第一医院住院治疗的消化道恶性肿瘤病人。全部病例患者就诊时绝大多数为西医诊断确切，手术、化疗后复发者。002012一般资料设对。
9、照组和治疗组。见表10021表1两组临床资料0022002313临床分期按照国际抗癌联盟UICC1987年关于恶性肿瘤的TNM标准进行临床分期。75例恶性肿瘤患者中，多数是中期占85，并有不同情况的转移，如淋巴结肿大，胃、脑、腹腔转移，伴胸、腹水及发烧，出血，疼痛等。002414临床诊断标准根据现代医学检查，凡为阳性者可确诊肿瘤胸片、X线、CR、MRI、干板等仪器检查阳性；纤维支气管镜检查阳性；活体组织取材经病理组织检查阳性；分泌物脱落细胞学检查阳性；体腔积液抽水检查阳性；凡远端器官或部位有转移者；临床症状表现与上述有关诊断相结合的明确诊断。002515治疗方法治疗组应用中药组合物1剂/日,2。
10、0天为一疗程，共3个疗程；对照说明书CN104147127A3/9页5组未用中药组合物。两组均同时进行辅助治疗，如祛胸水、腹水、止痛、止血、增进食欲和通便等。002616疗效标准根据病情进行血、尿、便常规化验和特异性指标化验，X线拍片、B超、CT等检查，观察临床症状，如体重、咳嗽、进食、疼痛、出血、体温、呼吸、心率、胸水、腹水、肿瘤大小等。00272观察结果0028表2两组患者临床总疗效比较00290030经RIDIT分析，两组间有显著性差异P005。0031试验例2药理学实验0032所用的中药组合物按照以下方法制备0033按以下重量称取的各原料药北豆根10份，三七75份，黄芪20份。原料药用。
11、蒸馏水浸泡1H，水煎2次，每次30MIN，两次煎液混匀，旋转蒸发仪分别浓缩至50ML，4保存，制成水煎剂，用于以下研究00341体外实验对人胰腺癌BXPC3细胞进行体外培养，以中药组合物高、低剂量组，5FU5氟尿嘧啶的培养液干预，空白对照组用正常培养液培养，进行以下实验利用胎盘兰染色测定BXPC3细胞生长周期并绘制生长曲线；利用细胞划痕实验检测药物干预后BXPC3细胞的运动能力；运用MTT方法检测药物干预后BXPC3细胞增殖作用；采用流式细胞术检测药物干预后BXPC3细胞周期及细胞凋亡。00352体内实验制备裸鼠移植瘤模型，观察中药组合物对小鼠的体重及肿瘤生长情况的影响，并测定脾指数、抑瘤率；。
12、透射电镜下观察肿瘤细胞超微结构，以此探讨本发明中药组合物的抗肿瘤作用及其作用机制，具体通过以下实验进行0036体外实验00371实验材料0038中药组合物按上述方法制备,按常规方法浓缩煎液成2G/ML的生药浓度,灭菌后冷藏备用制备水煎液,4保存备用。人原位胰腺癌细胞株BXPC3，购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心。脲嘧啶替加氟片,齐鲁制药有限公司,批号0502002；培养液RPMI1640、IMDM购自GIBCO公司；胎牛血清杭州四季青生物工程公司产品。00392主要仪器设备0040CO2培养箱TC2323型，超净工作台，数显电热恒温干燥箱2022A型，倒置相差显微镜LH50A型，酶。
13、联免疫检测仪DG3022A型，高速台式离心机TGL16C型，离心机LD42型，研究用显微镜BH2型、流式细胞仪等。说明书CN104147127A4/9页600413实验方法004231胰腺癌BXPC3细胞培养0043311细胞的复苏从液氮中取出冻存细胞，迅速将冻存管投入已经预热至37水浴锅中解冻，并不断摇动，使冻存管内液体在12MIN内迅速融化。用75酒精消毒冻存管外壁后移入超净工作台内。将管内液体吸入已经消毒过的EP管内，1000RPM/MIN离心3MIN，弃上清液，加入10ML培养基，将其吹打成为单细胞悬液，细胞计数，调整浓度为5105/ML接种于培养瓶中，将培养瓶置于37、5CO2的培养。
14、箱中培养，次日换液。0044312细胞的传代细胞贴壁8090时可进行细胞传代，小心吸取原培养基，用PBS冲洗两次，弃去PBS，加入适量胰蛋白酶液，轻轻摇晃培养瓶，使瓶底充分接触消化胰酶，盖紧瓶盖，置于37培养箱内35MIN后，发现细胞有少量脱落时，取出加入培养基终止消化，收集液体于EP管中，1500RPM/MIN离心5MIN，弃上清液，用PBS清洗两次，弃去PBS，加入培养基将细胞吹打为单细胞悬液并调整细胞浓度1105/ML接种于培养瓶中，将培养瓶置于37、5CO2的培养箱中继续培养。0045313细胞的冻存将细胞冻存前一天换液，依细胞传代的操作，将细胞浓度调整为39106/ML，1500RP。
15、M/MIN离心5MIN，弃上清液，加入适量预先配置好的冻存液10DMSO与90FBS充分混合，现用现配，使细胞混合均匀，分装于已标记的冻存管中，每管1ML。然后将细胞置于410MIN，2030MIN，80过夜，最后放入液氮中长期保存。0046314细胞的计数胰酶消化后的细胞，制成单细胞悬液，取100L细胞悬液加入100L胎盼蓝染液04，充分混匀。取一套洁净血球计数板，将盖玻片覆盖在血球计数槽上，吸取10L上述细胞计数液沿盖玻片边缘打入，倒置显微镜下记录四个象限中未被染色的细胞数。细胞悬液的细胞浓度为四个象限细胞数之和/42104。0047315药物干预取对数生长期人胰腺癌BXPC3细胞，用胰蛋。
16、白酶消化，PBS清洗3次，制成单细胞悬液，将细胞浓度调整为1105/ML，接种于25CM2培养瓶中，放入375CO2培养箱培养24H后，弃原培养基，分别加入含中药组合物终浓度为80、40G/ML的培养基，阳性对照组加入含5FU终浓度为50G/ML的培养基，空白对照组加正常培养基，置于375CO2培养箱培养48H。004832胎盘蓝染色法检测细胞生长曲线0049取对数生长期人胰腺癌BXPC3细胞，用胰蛋白酶消化，PBS清洗3次，制成单细胞悬液，将细胞浓度调整为1104个/ML，以300L每孔接种于24孔培养板，放入375CO2培养箱，继续培养，在1天24H、2天48H、3天72H、4天96H、5。
17、天120H、6天144H每天同一时间分别取四个孔进行计数。收集这几天实验数据，绘制人胰腺癌BXPC3细胞的生长曲线。005033MTT法检测细胞增殖0051取对数生长期人胰腺癌BXPC3细胞，用胰蛋白酶消化，PBS清洗3次，制成单细胞悬液，将细胞浓度调整为2105个/ML，以100L每孔接种于96孔培养板。在培养箱中培养24H后，更换培养基，分别加入含中药组合物终浓度为80、40G/ML的培养基，阳性对照组加入含5FU终浓度为50G/ML的培养基，每孔100L，空白对照组加正常培养基，每孔100L，每组设6个复孔，继续培养48H，培养结束前4H，加入MTT5MG/ML10L于各培养孔，继续培养。
18、4H后，小心吸取培养基，每孔加入DMSO100L，37摇床震荡10MIN后，用酶标说明书CN104147127A5/9页7仪在波长为490NM处检测各孔的吸光度值OD。以上实验重复3次。收集收据，计算药物对BXPC3细胞抑制率。005234划痕实验检测细胞运动能力0053首先用MARKER笔比着直尺在6孔板背后，均匀地划横线，大约每隔051CM划一道，横穿过孔。每孔至少穿过3条线。在每孔中加入约5105个BXPC3细胞，置于培养箱内培养24H后，用20L枪头比着直尺，尽量垂直于背后的横线画划痕。用PBS洗细胞每孔3次，以去除划下的细胞，分别加入含中药组合物终浓度为80、40G/ML的培养基，对。
19、照组加入含5FU终浓度为50G/ML的培养基，空白对照组加正常培养基，每组设4个复孔，放入375CO2培养箱，继续培养48H。按0、24、48小时取样拍摄划痕处。应用PHOTOSHOP软件测量划痕的距离，每孔随机选取3个位置。细胞运动能力可根据划痕位置细胞愈合的相对距离来进行判断。0054划痕愈合相对距离L48H距离/0H距离100005535检测细胞凋亡率每组取对数生长期的胰腺癌BXPC3细胞以2L05/ML，4ML接种于25CM2培养瓶中，培养24小时后，给药组加入中药组合物终浓度为80G/ML、40G/ML的培养基，阳性对照组加入含5FU终浓度为50G/ML的培养基，空白对照组补足等体积。
20、的培养基，放置培养箱中培养48小时后，PBS清洗2次，胰酶消化35MIN，加入培养基终止消化，收集细胞于15ML离心管中，1500RPM离心5MIN，PBS洗两遍，制成单细胞悬液。加入5LANNEXINVFITC,轻轻混匀。室温2025避光孵育10MIN可以使用铝箔进行避光。1000G离心5MIN，弃上清，加入190LANNEXINVFITC结合液小心重悬细胞。加入10L碘化丙啶染色液PROPIDIUMIODIDE，PI，轻轻混匀，冰浴避光放置。染色完成后应在24H内进行流式检测，最好能在当日完成。流式细胞仪在激发波长为488NM波长处检测红色突发光，同时检测光散射的情况。采用仪器本身分析软件。
21、对细胞DNA含量和光散射情况进行分析。以上数据均经CELLQUEST软件收集并且处理。005636检测细胞周期每组取对数生长期的胰腺癌BXPC3细胞以2L05/ML，4ML接种于25CM2培养瓶中，培养24小时后，给药组加入中药组合物终浓度为80G/ML、40G/ML的培养基，阳性对照组加入含5FU终浓度为50G/ML的培养基，空白对照组补足等体积的培养基，放置培养箱中培养48小时。PBS清洗2次，胰酶消化35MIN，加入二倍体积培养液终止消化，收集细胞于15ML离心管中，1500RPM离心5MIN，PBS洗两遍，制成单细胞悬液。1500RPM离心取去除细胞碎片，用20预冷70乙醇固定，4过夜。
22、，1500RPM离心5MIN，弃上清液，每管加入碘化丙啶染色液至终浓度为50MG/L，避光，37孵育30MIN，用流式细胞仪检测，用氩离子激光激发荧光，激发光波波长为488NM，发射光波波长为650NM，每个样本计数20000个细胞，应用MULTICYCLE软件进行细胞周期分析。005737数据分析0058组间差异的统计分析采用SPSS软件进行组间T检验，各组数据均用表示，所有P值均表示两两对比，P005为差异显著，P001为差异极显著，均具有统计学意义。00594实验结果006041胰腺癌BXPC3细胞的生长曲线0061根据不同时间活细胞数绘制胰腺癌BXPC3细胞生长曲线如图1所示，以细胞浓。
23、度1104/ML接种后，从第四天进入对数生长期，第五天之后进入生长抑制期。说明书CN104147127A6/9页8006242胰腺癌BXPC3细胞运动能力情况0063表1胰腺癌BXPC3细胞运动能力的情况00640065注与空白组比较，P005表示为，P001表示为，与5FU组比较，P005表示为，P001表示为。006643胰腺癌BXPC3细胞增殖情况0067表2胰腺癌BXPC3细胞增殖的情况00680069注与空白组比较，P005表示为，P001表示为，与5FU组比较，P005表示为，P001表示为。007044胰腺癌BXPC3细胞凋亡率情况0071表3胰腺癌BXPC3细胞凋亡率的情况00。
24、720073注与空白组比较P005表示为，P001表示为。007445胰腺癌BXPC3细胞周期情况0075表4胰腺癌BXPC3细胞周期的情况0076说明书CN104147127A7/9页90077注与空白组比较P005表示为，P001表示为。0078体内实验部分00791实验材料008011实验动物及瘤株SPF级BALB/C小鼠4周龄购自上海斯莱克实验动物有限公司，人原位胰腺癌细胞株BXPC3，购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心。008112实验药品及试剂中药组合物按上述方制备,按常规方法浓缩煎液成2G/ML的生药浓度,灭菌后冷藏备用制备水煎液,4保存备用。5FU美国SIGMA公司，。
25、改良型RPMI1640培养基、胎牛血清、双抗青霉素100G/ML及链霉素100G/ML、消化胰酶美国HYCLONE公司，TRIZOL试剂盒、DEPC上海生工生物工程，RAF1抗体SANTACRUZ，MEK1抗体、ERK1抗体CELLSIGNALING，山羊抗兔IGG二抗、山羊抗大鼠IGG二抗、山羊抗小鼠IGG二抗、GAPDH鼠单抗美国ABCAM公司，蛋白抽提试剂盒、BCA蛋白浓度测定试剂盒碧云天生物技术研究所，预染蛋白MARKERFERMENTAS，其他试剂均为国产或者进口分析纯级。008213仪器设备医用型洁净工作台北京东联哈尔仪器制造有限公司；CO2培养箱力康发展公司；倒置显微镜美国PHI。
26、LIPPINES公司；冰箱合肥荣事达电冰箱有限公司；液氮生物容器成都金凤液氮容器有限公司；超级恒温槽上海一恒科学仪器有限公司；高速离心机湖南湘仪H1650W；实时定量PCR检测仪美国伯乐公司；多用脱色摇床苏州捷美SYC2101；凝胶成像分析系统美国ALPHAINNOTECH公司；垂直电泳仪及转膜系统美国BIOROD公司。00832实验方法008421动物造模、分组及给药取对数生长期BXPC3细胞,制成浓度为5106个/ML的细胞悬液备用。抽取细胞悬液02ML/只接种于常规皮肤消毒后的裸鼠右前肢腋部皮下。动物称量体重随机分为五组，模型组M，生理盐水组C，阳性对照组5FU，中药组合物高剂量组P2和。
27、中药组合物低剂量组P1，每组6只，共30只。C组不接种BXPC3细胞，其他四组均接种。动物接种24H后进行药物干预，连续给药21天，C组、M组每天腹腔注射09生理盐水02ML/只，5FU组每天腹腔注射2MG/ML5FU02ML/只，即每天给药剂量为20MG/KG；P20组每天腹腔注射2MG/ML中药组合物02ML/只，即每天给药剂量为20MG/KG；P10组每天腹腔注射1MG/ML中药组合物02ML/只，即每天给药剂量为10MG/KG。0085以上5组裸鼠成瘤肿瘤体积约100MM3后，测量体重，并用游标卡尺从体外测量肿瘤的最长径与最短径,并根据公式计算肿瘤体积、相对肿瘤体积和相对体重，每周23。
28、说明书CN104147127A8/9页10次，以动态观察肿瘤生长情况；连续观察8周后，称体重后处死裸鼠，无菌条件下取肿瘤组织,称瘤重，计算抑瘤率；采用透射电镜观察移植瘤中肿瘤细胞形态学变化。008622统计分析0087使用SPSS170分析软件对所得数据进行分析，所有数据以均数标准差XS，组间差异性比较用T检验，多组间差异性比较采用方差分析。评定标准P005为有统计学意义，P001为有显著性统计学意义。00883实验结果008931BXPC3胰腺癌小鼠模型体重情况0090表5BXPC3胰腺癌小鼠模型体重情况00910092注P2表示中药组合物20MG/KG组，P1表示中药组合物10MG/KG组。
29、，5FU表示阳性对照组，M组表示模型对照组，C表示空白对照组。0093实验结果如表5显示，实验各组小鼠体重均有增加，其中5FU组小鼠体重增加最为缓慢，C组小鼠体重增加最快，而P2组，P1组及M组小鼠体重增加较C组缓慢但较5FU组稍快。给药各组与C组比较均没有统计学差异，给药各组与M组比较均没有统计学差异。009432BXPC3胰腺癌小鼠模型脾重及脾指数情况0095表6BXPC3胰腺癌小鼠模型脾重及脾指数情况00960097注P2表示中药组合物20MG/KG组，P1表示中药组合物10MG/KG组，5FU表示阳性对照组，M组表示模型对照组，C表示空白对照组。5FU与C组比较表示P005。0098如。
30、表6所示，P2组，P1组与C组脾重比较均无统计学差异，P2组，P1组与M组脾重比较无统计学差异，5FU组与C组及M组脾重比较具有统计学差异。各给药组与C组脾说明书CN104147127A109/9页11指数比较均无统计学差异，P2组P1组与M组脾指数比较无统计学差异，5FU组与C组及M组脾指数比较具有统计学差异。009933BXPC3胰腺癌小鼠模型瘤重及抑瘤率情况0100表7BXPC3胰腺癌小鼠模型瘤重及抑瘤率情况01010102注P2表示中药组合物20MG/KG组，P1表示中药组合物10MG/KG组，5FU表示阳性对照组，M组表示模型对照组，C表示空白对照组。各组与M组比较表示P005，表示。
31、P001。0103表7所示，P2、P1及5FU组瘤重均有一定程度的减轻，P2、P1及5FU组瘤重与M组比较均有统计学意义，P2组与M组瘤重比较有显著统计学意义；各组肿瘤抑制率分别为5588，3614，3088。010434中药组合物对胰腺癌BXPC3小鼠异位移植瘤组织形态学的影响0105图25分别为中药组合物对P2、P1、5FU以及M组胰腺癌小鼠异位移植瘤形态学的影响图。0106以上所述仅为本发明的较佳实施例，对本发明而言仅仅是说明性的，而非限制性的。本专业技术人员理解，在本发明权利要求所限定的精神和范围内可对其进行许多改变，修改，甚至等效，但都将落入本发明的保护范围内。说明书CN104147127A111/2页12图1图2图3说明书附图CN104147127A122/2页13图4图5说明书附图CN104147127A13。