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1、10申请公布号CN104152532A43申请公布日20141119CN104152532A21申请号201410385968022申请日20140807C12Q1/18200601A01G7/0020060171申请人贵州省烟草科学研究院地址550032贵州省贵阳市金阳新区云潭北路贵州省烟草科学研究院72发明人王仁刚任学良林世锋谢升东王轶54发明名称一种幼苗期鉴定烟草青枯病抗性的方法57摘要本发明公开了一种幼苗期鉴定烟草青枯病抗性的方法，将保水剂与珍珠岩按21的比例混均，消毒后装入6孔细胞培养板，将烟草种子播种在细胞培养板上，每个品种各播种到一个孔中，1020粒/孔，放在无菌培养室中培养，温。
2、度环境25、每天光照16小时、光照强度4000LUX、相对温度7080，出苗后，每个孔中均匀的留苗5株，用烟草育苗专用肥配制营养液，使其中氮肥浓度达到100PPM，追施到培养板中，待小苗长至两片真叶时，将青枯菌悬浮液用移液枪接种到细胞培养板的每个孔中，每孔接种1ML，15天后调查记录。本发明鉴定周期更短，25天小苗即可用于鉴定，不受季节限制，试验稳定性强。51INTCL权利要求书1页说明书3页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书3页10申请公布号CN104152532ACN104152532A1/1页21一种幼苗期鉴定烟草青枯病抗性的方法，其特征在于包括以下步骤。
3、（1）育苗将保水剂与珍珠岩按21的比例混均，消毒后装入6孔细胞培养板，将烟草种子播种在细胞培养板上，每个品种各播种到一个孔中，1020粒/孔，放在无菌培养室中培养，出苗后，每个孔中均匀的留苗5株，用烟草育苗专用肥配制营养液，使其中氮肥浓度达到100PPM，追施到培养板中；（2）青枯菌悬浮液的制备将20下保存于无菌水中的青枯菌，在肉汁培养基平板上划线，培养于2830下，24H后挑取典型菌落移置于肉汁斜面，28，24H后，再移至肉汁斜面，在28培养24H后用无菌水稀释成108CFU/ML，即成所需要的接菌浓度；（3）接种小苗长至两片真叶时，将青枯菌悬浮液用移液枪接种到细胞培养板的每个孔中，每孔接种。
4、1ML，15天后调查记录；（4）记载方法执行国家标准GB/T232222008，烟草病虫害分级及调查方法。2根据权利要求1所述的幼苗期鉴定烟草青枯病抗性的方法，其特征在于无菌培养室的培养条件为温度环境25、每天光照16小时、光照强度4000LUX、相对温度7080。权利要求书CN104152532A1/3页3一种幼苗期鉴定烟草青枯病抗性的方法技术领域0001本发明属于植物抗病性鉴定技术领域，具体涉及幼苗期鉴定烟草青枯病抗性的方法。背景技术0002由细菌引起的一种烟草病害，在我国多个烟区都有发生，危害严重。对青枯病缺乏特效防治药剂，一旦发生很难防治。在青枯病易发地区，最主要的方法就是选用抗青枯病。
5、烟草品种。对烟草品种的青枯病抗病性鉴定，目前主要依靠田间病圃鉴定，但是田间病圃鉴定有鉴定时间长、成本高，受地力、季节的影响较大，抗性鉴定不稳定等缺点。中国专利CN200910094174“一种烟草青枯病抗性的苗期鉴定方法”采用漂浮池恒温水培接种鉴定方法，具有发病迅速、结果重复性好、结果可靠性高等优点，但是这个方法操作复杂，时间周期相对还是较长，需要一个月的时间。发明内容0003本发明要解决的技术问题针对现有技术中存在的抗性鉴定不稳定、鉴定周期长、受地力、季节的影响较大等问题，本发明提供了一种幼苗期鉴定烟草青枯病抗性的方法，具有鉴定周期短、不受季节限和鉴定结果稳定等优点。0004本发明采用的技术。
6、方案幼苗期鉴定烟草青枯病抗性的方法，包括以下步骤（1）育苗将保水剂与珍珠岩按21的比例混均，消毒后装入6孔细胞培养板，将烟草种子播种在细胞培养板上，每个品种各播种到一个孔中，1020粒/孔，放在无菌培养室中培养，温度环境25、每天光照16小时、光照强度4000勒克斯、相对温度7080，出苗后，每个孔中均匀的留苗5株，用烟草育苗专用肥配制营养液，使其中氮肥浓度达到100PPM，追施到培养板中；（2）青枯菌悬浮液的制备将20下保存于无菌水中的青枯菌，在肉汁培养基平板上划线，培养于2830下，24H后挑取典型菌落移置于肉汁斜面，2824H后，再移至肉汁斜面，在28培养24H后用无菌水稀释成108CF。
7、U/ML，即成所需要的接菌浓度；（3）接种小苗长至两片真叶时，将青枯菌悬浮液用移液枪接种到细胞培养板的每个孔中，每孔接种1ML，15天后调查记录。0005记载方法执行国家标准“烟草病虫害分级及调查方法（GB/T232222008）”。病情指数（D）计算公式D（各级病株数该病级数）100/（调查总株数最高级数）病害严重度分级标准按国家标准GB/T232242008执行，抗性划分为6个级别高抗或免疫（I）病指为0；抗病（R）抗病（R）；中抗（MR）病指为20140；中感（MS）病指为40160；感（S）病指为60180；高感（HS）病指为801100。0006本发明与现有技术相对具有以下有益效果（。
8、1）鉴定周期更短，25天小苗即可用于鉴定，相比其它现有技术的鉴定周期短；说明书CN104152532A2/3页4（2）以细胞培养板为载体，在室内恒定环境下育苗鉴定，不受季节限制，试验稳定性强；（3）使用无菌苗，不受其它微生物影响，鉴定结果稳定。具体实施方式0007实施例11材料与方法11试验材料对12个烟草品种进行青枯病抗性鉴定。D101、长脖黄、大虎耳、TI448A、红花大金元、K326、南江3号、云烟85、岩烟97、K346、RG17、中烟10012试验方法将保水剂与珍珠岩按21的比例混均，消毒后装入6孔细胞培养板，将烟草种子播种在细胞培养板上。将试验的12个品种分别播种到一个孔中，102。
9、0粒/孔。试验设4个重复。将播种后的细胞培养板放在无菌培养室中培养，温度环境25、每天光照16小时、光照强度4000勒克斯（LUX）、相对温度7080。出苗后，每个孔中均匀的留苗5株。小苗长至两片真叶时（2530天），将青枯菌悬浮液用移液枪接种到细胞培养板的每个孔中，每孔接种1ML。15天后调查记录。0008青枯菌悬浮液的制作将20下保存于无菌水中的青枯菌，在肉汁培养基平板上划线，培养于2830下，24H后挑取典型菌落移置于肉汁斜面，2824H后，再移至肉汁斜面，在28培养24H后用无菌水稀释成108CFU/ML，即成所需要的接菌浓度。0009记载方法执行国家标准“烟草病虫害分级及调查方法（G。
10、B/T232222008）”。病情指数（D）计算公式D（各级病株数该病级数）100/（调查总株数最高级数）病害严重度分级标准按国家标准GB/T232242008执行，抗性划分为6个级别表1国家标准抗性划分表高抗或免疫（I）病指为0；抗病（R）病指为0120；中抗（MR）病指为20140；中感（MS）病指为40160；感（S）病指为60180；高感（HS）病指为801100。表2常规病圃鉴定与小苗快速鉴定结果编号/品种名称病指抗性D101190R长脖黄938HS大虎耳438MSTI448A542MS红花大金元722SK326270MR南江3号584MS云烟85376MR岩烟9785R说明书CN104152532A3/3页5K346175RRG17214MR中烟100559MS试验所选品种的鉴定结果，与生产试验中的抗性基本一致。说明本发明方法可以做为烟草品种抗青枯病鉴定的一种快捷方法。说明书CN104152532A。