一种利用平端连接法高效筛选阳性转化子的DNA重组方法.pdf

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摘要
申请专利号:

CN201510105476.6

申请日:

2015.03.10

公开号:

CN104774861A

公开日:

2015.07.15

当前法律状态:

实审

有效性:

审中

法律详情:

实质审查的生效IPC(主分类):C12N 15/66申请日:20150310|||公开

IPC分类号:

C12N15/66

主分类号:

C12N15/66

申请人:

江苏康为世纪生物科技有限公司

发明人:

任军; 高芳芳; 王春香; 马丽娟

地址:

225300江苏省泰州市经济开发区药城大道一号TQB大楼4楼

优先权:

专利代理机构:

北京方圆嘉禾知识产权代理有限公司11385

代理人:

董芙蓉

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内容摘要

一种利用平端连接法高效筛选阳性转化子的DNA重组方法,将载体使用限制性内切酶进行酶切线性化,产生平末端线性化质粒DNA;目的DNA片段使用DNA聚合酶进行PCR扩增并回收PCR产物;将平末端线性化载体与平末端PCR产物混合后加入限制性内切酶与T4DNA连接酶同时存在的反应体系中,进行连接反应,当发生载体自连时,进行酶切反应,限制性内切酶将自连载体切为平末端载体,继续与游离的PCR产物连接;该反应过程为连接反应和酶切反应的交替循环,最终反应终止于酶切反应;将上述体系直接转化入感受态大肠杆菌,转化子即为阳性克隆。本发明操作步骤简单,可加快试验进度、降低实验成本、提高克隆成功率,大幅提高了平端连接的反应效率和平端连接克隆方法的成功率。

权利要求书

1.  一种利用平端连接法高效筛选阳性转化子的DNA重组方法,其特征在于:包括以下步骤:
(1)载体酶切线性化与目的DNA片段PCR扩增:载体使用限制性内切酶进行酶切线性化,产生平末端,并回收线性化质粒DNA;目的DNA片段使用DNA聚合酶进行PCR扩增并回收PCR产物;
(2)载体与PCR产物连接:将平末端线性化载体与平末端PCR产物混合,然后加入限制性内切酶与T4DNA连接酶同时存在的反应体系中,设定连接温度进行连接反应,线性化载体既可以与目标PCR产物片段发生连接,产生目的重组子,也可以发生载体自连,当载体与PCR产物连接成为重组子时,反应体系中的限制性内切酶无法将连接点切开;当发生载体自连时,设定酶切温度进行酶切反应,限制性内切酶将自连载体切为平末端载体,继续与游离的PCR产物发生连接;该反应过程为连接反应和酶切反应的交替循环,最终反应终止于酶切反应。
(3)将上述体系直接转化入感受态大肠杆菌,涂平板培养,转化子即为阳性克隆。

2.
  根据权利要求1所述的一种利用平端连接法高效筛选阳性转化子的DNA重组方法,其特征在于:所述限制性内切酶为可产生平末端的限制性内切酶,可以是SmaI和FspI等。

3.
  根据权利要求1所述的一种利用平端连接法高效筛选阳性转化子的DNA重组方法,其特征在于:所述步骤(1)中DNA聚合酶为高保真DNA聚合酶。

4.
  根据权利要求1所述的一种利用平端连接法高效筛选阳性转化子的DNA重组方法,其特征在于:所述步骤(2)中平末端线性化载体与平末端PCR产物的混合摩尔比范围为1∶3-1∶100。

5.
  根据权利要求1所述的一种利用平端连接法高效筛选阳性转化子的DNA重组方法,其特征在于:所述步骤(2)中连接温度为20-25℃。

6.
  根据权利要求1所述的一种利用平端连接法高效筛选阳性转化子的DNA重组方法,其特征在于:所述步骤(2)中酶切温度为20-40℃。

7.
  根据权利要求1所述的一种利用平端连接法高效筛选阳性转化子的DNA重组方法,其特征在于:所述步骤(2)中连接反应的反应时间为20-40min。

8.
  根据权利要求1所述的一种利用平端连接法高效筛选阳性转化子的DNA重组方法,其特征在于:所述步骤(2)中酶切反应的反应时间为20-40min。

9.
  根据权利要求1所述的一种利用平端连接法高效筛选阳性转化子的DNA重组方法,其特征在于:所述步骤(2)反应时间为10-14h。

10.
  根据权利要求1所述的一种利用平端连接法高效筛选阳性转化子的DNA重组方法,其特征在于:所述步骤(3)反应时间为10-14h。

说明书

一种利用平端连接法高效筛选阳性转化子的DNA重组方法
技术领域
本发明涉及基因重组领域,具体的说是一种平端连接的DNA重组方法。
背景技术
自20世纪60年代末70年代初,限制性核酸内切酶和DNA连接酶等的发现,使DNA分 子进行体外切割和连接成为可能。在有Mg2+和ATP存在的连接缓冲系统中,分别经酶切线性化 的载体质粒分子与目的DNA片段在DNA连接酶的催化作用下进行连接。目的DNA与载体分子 的连接就是DNA重组,重新组合的DNA分子叫做重组体或重组子,体外构建的环化DNA重组 子(即重组质粒)可转化入大肠杆菌。这样,当重组质粒在大肠杆菌中复制时,目的DNA片 段作为质粒的一部分同时增殖,进而达成各种生物工程目的。DNA重组技术促进了生命科学 和医学科学的发展,在疾病的临床诊断、遗传病的基因治疗、疫苗的研制以及肿瘤等诸多领 域取得了不容小觑的成就。
在基因重组过程中,高效的DNA连接方法是关键步骤之一,随着基因工程的应用越来越 广泛,建立起了多种构建DNA重组子的方法,现有常用的方法包括粘端连接法、TA克隆法和 平端连接法,都具有不同程度的缺点或局限性。(1)粘端连接法是将目的DNA片段与载体分 别用相同的内切酶进行酶切,获得相同的粘性末端,具有互补粘端的目的DNA片段和载体在 适当的温度下,通过氢键配对,经DNA连接酶催化连接成重组体。但是在以PCR方法产生目 的DNA片段时,需要加长PCR引物,除限制酶识别序列(多数为4-6个碱基)外,还需要在 其5’端多合成3-4个“保护性”碱基以利于限制性内切酶与PCR产物末端的稳定结合。这些 额外添加的碱基有可能成为PCR扩增的障碍,有时难以获得目的DNA片段。即使在目的DNA 末端添加了“保护性”碱基,其酶切效率也经常不够高,其中尤以NotI、XhoI和XbaI等内 切酶较易出现此类问题。当酶切效率较低时,在连接反应产物中会产生较多自身环化的载体 质粒,经常导致克隆实验失败。虽然使用碱性磷酸酶对酶切后的载体质粒进行处理后进行连 接反应可减少载体质粒的自环化,但除耗时、费力、增加成本外,还增加了额外处理与纯化 步骤,也增加了DNA分子的损耗,不利于起始DNA材料很少时的克隆。(2)TA克隆法是采用 3’端突出一个胸苷的质粒DNA来克隆PCR产物。由于TaqDNA聚合酶能在平端双链DNA的3’ 末端加一个碱基,所加碱基几乎全是腺苷,可将载体DNA的3’末端加一个胸苷,利用载体末 端T与目的基因末端A配对进行克隆,可获得较高的克隆效率。然而,大部分的高保真酶, 如pfu,pfx、kod、phusion等扩增的PCR产物产生的是平末端,不能直接用于TA克隆。(3) 平端连接法通过加大T4DNA连接酶的浓度和控制温度将平端的目的DNA片段和载体直接连 接。平端连接本身实验条件苛刻,反应效率低,要求反应体系中不存在亚精胺类多胺,需要 低浓度(0.5mmol/L)的ATP(Ferretti和Sga ranekka,1981),高浓度的连接酶以及高浓度 的平端。平端连接法自身环化很多,背景很高,阳性率很低,虽也可用碱性磷酸酶降低背景 干扰,但由于平端连接相对困难,挑取到阳性克隆几率仍不高。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有的缺陷,提出了一种改良的利用平端连接法高效筛 选阳性转化子的DNA重组方法,旨在将高保真DNA聚合酶扩增得到的平末端DNA片段不经任 何处理直接用于基因克隆,从而减少实验步骤、加快试验进度、降低实验成本、提高克隆成 功率。
为了解决上述技术问题,本发明提供了如下的技术方案:
一种利用平端连接法高效筛选阳性转化子的DNA重组方法,其特征在于:包括以下步骤:
(1)载体酶切线性化与目的DNA片段PCR扩增:载体使用限制性内切酶进行酶切线性 化,产生平末端,并回收线性化质粒DNA;目的DNA片段使用DNA聚合酶进行PCR扩增并回 收PCR产物;
(2)载体与PCR产物连接:将平末端线性化载体与平末端PCR产物按混合,然后加入 限制性内切酶与T4 DNA连接酶同时存在的反应体系中,设定连接温度进行连接反应,线性 化载体既可以与目标PCR产物片段发生连接,产生目的重组子,也可以发生载体自连,当载 体与PCR产物连接成为重组子时,反应体系中的限制性内切酶无法将连接点切开;当发生载 体自连时,设定酶切温度进行酶切反应,限制性内切酶将自连载体再次切为平末端载体,继 续与游离的PCR产物发生连接;该反应过程为连接反应和酶切反应的交替循环,最终反应终 止于酶切反应。
(3)将上述体系直接转化入感受态大肠杆菌,涂平板培养,转化子即为阳性克隆。
进一步地,所述限制性内切酶为可产生平末端的限制性内切酶,可以是SmaI和FspI等。
进一步地,所述步骤(1)中DNA聚合酶为高保真DNA聚合酶。
进一步地,所述步骤(2)中平末端线性化载体与平末端PCR产物的混合摩尔比范围为 1∶3-1∶100。
进一步地,所述步骤(2)中连接温度为20-25℃。
进一步地,所述步骤(2)中酶切温度为20-40℃。
进一步地,所述步骤(2)中连接反应的反应时间为20-40min。
进一步地,所述步骤(2)中酶切反应的反应时间为20-40min。
进一步地,所述步骤(2)的反应时间为10-14h。
进一步地,所述步骤(3)的反应时间为10-14h。
本发明一种利用平端连接法高效筛选阳性转化子的DNA重组方法,旨在将高保真DNA聚 合酶扩增得到的平末端DNA片段不经任何处理直接用于基因克隆,利用限制性内切酶与T4DNA 连接酶在同一反应缓冲体系中均具有活性这一特点,通过在连接体系中加入限制性内切酶使 自连的载体重新线性化,使载体能有更多机会参与到与平末端PCR产物的连接中,大幅提高 平端连接中的DNA重组效率。本发明操作步骤简单,可加快试验进度、降低实验成本、提高 克隆成功率,大幅提高了平端连接的反应效率和平端连接克隆方法的成功率。
附图说明
附图用来提供对本发明的进一步理解,并且构成说明书的一部分,与本发明的实施例一 起用于解释本发明,并不构成对本发明的限制。在附图中:
图1是本发明的工作模型图。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的优选实施例进行说明,应当理解,此处所描述的优选实施例仅 用于说明和解释本发明,并不用于限定本发明。
实施例一
本实施例中选取的限制性内切酶为SmaI。基因组中限制性内切酶酶切靶点序列的出现频 率相差很大,以人基因组为例,大约每78kb出现一个SamI(CCC|GGG)酶切位点,因此以 人基因组为模板的PCR产物(通常不大于5kbp)中出现SmaI酶切位点的几率较低。同时, SamI酶切位点为多数工具载体质粒上的一个常规酶切位点,应用较广。SamI酶对其靶点的 切割效率较高,且其最佳反应温度为25℃,不需要任何仪器设备,酶切反应室温下即可顺利 进行。T4DNA连接酶的活性适应性较好,只要在各种内切酶反应缓冲液中加入适量ATP,其 连接催化活性即可发挥,T4 DNA连接酶的最佳反应温度为22℃,室温亦处于其最佳活性温 度范围之内。以上几点特性保证了此发明的高效、顺利进行。
如图1所示本发明一种利用平端连接法高效筛选阳性转化子的DNA重组方法,包括以下 步骤:
(1)载体酶切线性化与目的DNA片段PCR扩增:
载体使用限制性内切酶SmaI进行酶切线性化,产生平末端CCC|GGG,并回收线性化质粒 DNA;目的DNA片段使用高保真DNA聚合酶进行PCR扩增并回收PCR产物;
(2)载体与PCR产物连接:
取平末端线性化载体与平末端PCR产物按摩尔比1∶50,加入1ul 10×SmaI缓冲溶液, 向反应体系内加入5U T4DNA连接酶和20U限制性内切酶SmaI,再加入ATP至终浓度为 0.5mmol/L,加入六氨氯化钴至终浓度为1umol/L,水补齐至10ul。
设定连接温度为22℃进行连接反应30min,线性化载体既可以与目标PCR产物片段发 生连接,产生目的重组子,也可以发生载体自连,当载体与PCR产物连接成为重组子时,连 接位点的序列为CCCNNN或NNNGGG,因NNN不为CCC或GGG,无法构成SmaI酶切位点,反应 体系中的限制性内切酶SmaI不可将连接点切开;而一旦发生载体自连时,SmaI酶切位点 CCC|GGG将被恢复,限制性内切酶SmaI发挥活性,设定酶切温度为25℃进行酶切反应30min, 将自连载体再次切为平末端载体,继续与游离的PCR产物发生连接,该反应为连接反应和酶 切反应的交替循环反应,最终反应终止于酶切反应,可将反应体系置于22℃-30min和25℃ -30min的温度-时间循环的PCR仪中反应过夜,最终反应终止于反应温度为25℃的酶切反 应。
(3)将上述体系直接转化入感受态大肠杆菌,涂平板培养,转化子即为阳性克隆。
实施例二
本实施例按实施例一方法进行试验,限制性内切酶为SmaI,连接酶为T4 DNA,特别地, 由于本实施例中限制性内切酶SmaI和连接酶T4 DNA的最佳反应温度分别为25℃和22℃, 可见连接反应温度和酶切反应温度相近,并且二者都与室温相接近,因此,载体与PCR产物 连接反应可以不需要设置温度变化,仅需将反应管置于室温条件下反应过夜即可,不需要设 置温度变化重复,不需要任何仪器,操作非常方便,所以限制性内切酶SmaI是该方法的首 选用酶。
实施例三
本实施例按实施例一或二方法进行试验,按优选地,本实施例中平末端线性化载体与平 末端PCR产物按摩尔比1∶100,提高平末端PCR产物反应比例的原因在于:虽然反应体系中 的限制性内切酶SmaI可以将自连载体重新切开,但无法将自连的PCR产物重新切开,PCR产 物一旦自连,形成环化分子,这条分子将无法再参与与载体的连接反应而作废,而这也是常 规平端克隆效率极低的原因之一。因此要尽量多加入平末端PCR产物,这样即使其中多数分 子因自连环化而作废,仍剩余有充足的平末端PCR产物与载体连接,可以提高连接反应产率, 提高连接成功率。
实施例四
本实施例中选取的限制性内切酶为FspI,其酶切位点为TGC|GCA,最佳反应温度为37℃, 按实施例一方法进行:
(1)载体酶切线性化与PCR扩增:
载体使用限制性内切酶FspI进行酶切线性化,产生平末端TGC|GCA,并回收线性化质粒 DNA;目的DNA片段使用高保真DNA聚合酶进行PCR扩增并回收PCR产物;
(2)载体与目的DNA片段PCR产物连接:
取平末端线性化载体与平末端PCR产物按摩尔比1∶50,加入1ul 10×FspI缓冲溶液, 向反应体系内加入5U T4DNA连接酶和20U限制性内切酶FspI,再加入ATP至终浓度为 0.5mmol/L,加入六氨氯化钴至终浓度为1umol/L,水补齐至10ul。
设定连接温度为22℃进行连接反应30min,线性化载体既可以与目标PCR产物片段发 生连接,产生目的重组子,也可以发生载体自连,当载体与PCR产物连接成为重组子时,连 接位点的序列为TGCNNN或NNNGCA,因NNN不为TGC或GCA,无法构成FspI酶切位点,反应 体系中的限制性内切酶FspI不可将连接点切开;而一旦发生载体自连时,FspI酶切位点 TGC|GCA将被恢复,限制性内切酶FspI发挥活性,设定酶切温度为37℃进行酶切反应30min, 将自连载体再次切为平末端载体,继续与游离的PCR产物发生连接。随着反应的时间延长, 越来越多的载体与PCR产物连接为重组子,线性载体与自环化载体分子数量越来越少,直至 趋近于零。
该反应为连接反应和酶切反应的交替循环,最终反应终止于酶切反应,可将反应体系置 于22℃-30min和37℃-30min的温度-时间循环的PCR仪中反应过夜,最终反应终止于 反应温度为37℃的酶切反应。
(3)将上述体系直接转化入感受态大肠杆菌,涂平板培养,转化子即为阳性克隆。
实施例五
本实施例按实施例四方法进行试验,按优选地,本实施例中平末端线性化载体与平末端 PCR产物按摩尔比1∶100,提高平末端PCR产物反应比例的原因在于:虽然反应体系中的限 制性内切酶FspI可以将自连载体重新切开,但无法将自连的PCR产物重新切开,PCR产物一 旦自连,形成环化分子,这条分子将无法再参与与载体的连接反应而作废,而这也是常规平 端克隆效率极低的原因之一。因此要尽量多加入平末端PCR产物,这样即使其中多数分子因 自连环化而作废,仍剩余有充足的平末端PCR产物与载体连接,可以提高连接反应产率,提 高连接成功率,进而提高阳性转化子数量。
本发明一种利用平端连接法高效筛选阳性转化子的DNA重组方法,旨在将高保真DNA聚 合酶扩增得到的平末端DNA片段不经任何处理直接用于基因克隆,特别是创新性地利用限制 性内切酶与T4 DNA连接酶在同一反应缓冲体系中均具有活性这一特点,通过在反应体系中 加入限制性内切酶使自连的载体重新线性化,克服常规平端克隆方法中由于载体的自环化导 致的克隆效率极低的弊端,使载体能有更多机会参与到与平末端PCR产物的连接中。另外, 本发明在反应过程中,加大了平末端DNA片段比例,以防止平末端DNA片段自连形成环化分 子后无法与载体连接而作废,从而导致克隆效率低的情况。以上设计使得本发明能够大幅提 高平端连接中的DNA重组效率,按此方法连接,当反应结束后进行转化,转化子绝大多数为 阳性。本发明操作步骤简单,可加快试验进度、降低实验成本、提高克隆成功率,大幅提高 了平端连接的反应效率和平端连接克隆方法的成功率。
对比试验
以限制性内切酶SmaI酶切、纯化回收后的线性化puc19(约2.6Kbp)为克隆载体,以 一段不含有SmaI识别位点的约500bp PCR产物片段作为克隆目标进行对比实验。
实验过程:
(1)按表1分别设置连接反应,并将两个反应管放置于室温下反应过夜;
表1

(2)分别取2ul连接产物按常规方法,以42度热击法转化入100ul感受态大肠杆菌;
(3)分别计数菌斑形成数量,各随机挑选10个菌斑进行酶切阳性鉴定(携有目的DNA 片段);
(4)重复实验5次。
实验结果:
实验结果如表2所示,从对比实验结果可以看出:常规平端克隆方法会形成大量假阳性 克隆,在后续筛选数目不多,时常无法得到有效的阳性克隆。本专利方法在极大程度上避免 了假阳性克隆的形成,显著提高了克隆效率。
表2

最后应说明的是:以上所述仅为本发明的优选实施例而已,并不用于限制本发明,尽管 参照前述实施例对本发明进行了详细的说明,对于本领域的技术人员来说,其依然可以对前 述各实施例所记载的技术方案进行修改,或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发 明的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围 之内。

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一种利用平端连接法高效筛选阳性转化子的DNA重组方法,将载体使用限制性内切酶进行酶切线性化,产生平末端线性化质粒DNA;目的DNA片段使用DNA聚合酶进行PCR扩增并回收PCR产物;将平末端线性化载体与平末端PCR产物混合后加入限制性内切酶与T4DNA连接酶同时存在的反应体系中,进行连接反应,当发生载体自连时,进行酶切反应,限制性内切酶将自连载体切为平末端载体,继续与游离的PCR产物连接;该反应过。

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