环孢菌素组合物.pdf

环孢菌素组合物
    发明人

    Richard S.Graham、Walter L.Tien、Aileen Morgan、

    Rhett M.Schiffman、David A.Hollander和Mayssa Attar

     相关申请

    本申请要求2007年9月20日提交的美国专利申请11/858,200——一个部分继续申请——的优先权基础，所述美国专利申请11/858,200要求2007年7月20日提交的美国专利申请11/781,095的优先权基础，所述美国专利申请11/781,095要求2006年7月25日提交的美国临时申请60/820,239；2006年10月17日提交的美国临时申请60/829,796；2006年10月17日提交的美国临时申请60/829,808；2007年1月5日提交的美国临时申请60/883,525；2007年5月7日提交的美国临时申请60/916,352和2006年12月11日提交的美国临时申请60/869,459的优先权基础；上述申请中的每一篇都以引用的方式整体纳入本文中。

    背景技术

    与泪腺功能或与流泪有关的异常经常使患有这些异常的哺乳动物不舒适。

    【附图说明】

    图1.对新西兰白兔双侧眼部单次局部滴注三种0.05％环孢菌素A制剂之一后，平均(±SD)角膜环孢菌素A浓度(半对数)值。

    图2.对新西兰白兔双侧眼部单次局部滴注三分之一0.05％环孢菌素A制剂后，平均(±SD)结膜环孢菌素A浓度(半对数)值。

    图3.对新西兰白兔双侧眼部单次局部滴注三分之一0.05％环孢菌素A制剂后，平均(±SD)巩膜环孢菌素A浓度(半对数)值。

    图4.对新西兰白兔双侧眼部单次局部滴注三分之一0.05％环孢菌素A制剂后，平均(±SD)睑缘环孢菌素A浓度(半对数)值。

    图5.对新西兰白兔双侧眼部单次局部滴注三分之一0.05％环孢菌素A制剂后，平均(±SD)鼻泪管环孢菌素A浓度(半对数)值。

    【具体实施方式】

    本文公开了一种包含浓度为约0.0001％(w/v)到小于约0.05％(w/v)的环孢菌素A的组合物。

    我们令人意外地发现，可制备具有治疗效果的浓度小于约0.05％(w/v)以下的环孢菌素A组合物。

    在一个实施方案中，将本文公开的组合物给予对其有需要的哺乳动物的眼睛以治疗在影响角膜的外科手术后角膜敏感度的丧失。

    在另一个实施方案中，将本文公开的组合物给予对其有需要的哺乳动物的眼睛以提高在影响角膜的外科手术后角膜敏感度的恢复。

    在另一个实施方案中，将本文公开的组合物给予对其有需要的哺乳动物的眼睛以治疗疱疹后角膜敏感度的丧失。

    在另一个实施方案中，将本文公开的组合物给予对其有需要的哺乳动物的眼睛以治疗干眼病。

    

    环孢菌素A

    环孢菌素A是一种具有免疫抑制性质的环肽，其结构如上所示。环孢菌素A(cyclosporine A)的其他名称包括环胞菌素、环胞菌素A、环孢素和环孢素A。

     治疗方法

    一个实施方案是一种治疗角膜敏感度丧失的方法，包括将一种包含浓度为约0.0001％(w/v)到小于约0.05％(w/v)的环孢菌素A的组合物给予对其有需要的哺乳动物。

    所述治疗通常包括将10-50μL本文所公开组合物的液滴局部给予哺乳动物或人的一只眼睛或双眼。本领域技术人员可却确定每天给予人或哺乳动物以产生有效缓解的液滴数。

    角膜敏感度的丧失可与若干因素有关。例如，角膜敏感度的丧失经常是由影响角膜的外科手术或由病毒感染引起的。

    可导致角膜敏感度丧失的外科手术的实例包括角膜屈光手术或穿透角膜移植术，例如下述方法：

    放射状角膜切开术，

    屈光性角膜切开术，

    激光辅助的原位角膜磨削术(LASIK)，

    激光辅助的上皮下角膜磨削术(LASEK)，

    SB-LASIK，

    EPI-LASIK，

    等等。

    可导致角膜敏感度丧失的病毒感染的实例包括：

    HSV-1，

    HSV-2，

    VZV，等等。

    在一个实施方案中，每天给予所述组合物1-4次。

    在另一个实施方案中，每天给予所述组合物2次。

    在另一个实施方案中，每天只给予所述组合物1次。

    在另一个实施方案中，当在三个月中每天只给予所述组合物1次时，不到14％的患者患眼烧伤。

    在另一个实施方案中，当在三个月中每天只给予所述组合物1次时，不到10％的患者患眼烧伤。

    在另一个实施方案中，当在三个月中每天只给予所述组合物1次时，不到8％的患者患眼烧伤。

    对于本发明的公开内容，“治疗”、“医治”或“疗法”是指一种化合物、组合物、治疗性活性剂或药物在疾病或其他不良病症的诊断、治愈、缓解、治疗、预防中，或影响人类或其他动物的身体的结构或任何功能的应用。

     组合物

    环孢菌素A的浓度小于约0.05％。这意指所述浓度小于市售的名为的0.05％环孢菌素A乳液中的浓度。

    在另一个实施方案中，环孢菌素A的浓度为约0.005％(w/v)到约0.04％(w/v)。

    在另一个实施方案中，环孢菌素A的浓度为约0.02％(w/v)到约0.04％(w/v)。

    在另一个实施方案中，环孢菌素A的浓度为约0.005％(w/v)。

    在另一个实施方案中，环孢菌素A的浓度为约0.015％(w/v)。

    在另一个实施方案中，环孢菌素A的浓度为约0.0015％(w/v)。

    在另一个实施方案中，环孢菌素A的浓度为约0.02％(w/v)。

    在另一个实施方案中，环孢菌素A的浓度为约0.03％(w/v)。

    在另一个实施方案中，环孢菌素A的浓度为约0.04％(w/v)。

    配制一种眼用可接受的液体从而可将其局部给予眼睛。应尽可能地使舒适度最大化，然而某些时候制剂考虑因素可能迫使舒适度不能达到最理想。对于不能使舒适度最大化的情况，应该配制所述液体从而使得患者可忍受所述液体的局部眼用。此外，眼用可接受的液体应被包装为单次使用，或含有防腐剂以防止在多次使用期间被污染。

    对于眼睛施用，经常使用生理盐水溶液作为主要载体来制备溶液或药剂。经常用合适的缓冲液系统使眼用溶液保持在一个舒适的pH。此制剂也可含有常规的药学可接受的防腐剂、稳定剂和表面活性剂。

    可使用多种用于调节pH的缓冲剂和方法，只要所得的制剂是眼用可接受的。因此，缓冲剂包括但不限于，乙酸盐缓冲剂、柠檬酸盐缓冲剂、磷酸盐缓冲剂和硼酸盐缓冲剂。可根据需要使用酸或碱来调节这些制剂的pH。

    在另一个实施方案中，所述组合物含有防腐剂。

    可用于本文公开的药物组合物的的防腐剂包括但不限于：

     阳离子防腐剂，例如

     季铵化合物包括苯扎氯铵、聚季铵盐(polyquad)等；

     基于胍的防腐剂包括PHMB、氯己定等；

     氯丁醇；

     汞防腐剂如硫柳汞、醋酸苯汞和硝酸苯汞；以及

     氧化防腐剂例如稳定的氯氧复合物(如)。

    在另一个实施方案中，所述组合物含有表面活性剂。

    表面活性剂可用于辅助溶解赋形剂或活性剂、分散组合物中的固体或液体、增加润湿度、改变液滴大小或若干其他目的。可用的表面活性剂包括但不限于以下种类的表面活性剂：醇类；氧化胺类；嵌段聚合物类；羧化的醇或烷基酚聚氧乙烯醚类；羧酸类/脂肪酸类；乙氧基化醇类；乙氧基化烷基苯酚类；乙氧基化芳基酚类；乙氧基化脂肪酸类；乙氧基化脂肪酯类或油类(动物油和植物油)；脂肪酯类；脂肪酸甲酯乙氧基化物类；甘油酯类；乙二醇酯类；基于羊毛脂的衍生物；卵磷脂和卵磷脂衍生物；木质素和木质素衍生物；甲酯类；单甘酯及衍生物；聚乙二醇；聚合物表面活性剂；丙氧基和乙氧基脂肪酸类、醇类或烷基苯酚类；基于蛋白的表面活性剂；肌氨酸衍生物；失水山梨糖醇衍生物；蔗糖和葡萄糖酯类及衍生物。

    具体而言，使用乙氧基化物表面活性剂。

    乙氧基化物表面活性剂是一种包含基团-O(CH₂CH₂O)_n-OH的表面活性剂，其中n至少为1。

    在一个实施方案中，n为从约1到约10000。

    在另一个实施方案中，n为从约1到约1000。

    在另一个实施方案中n为从约1到约500。

    某些乙氧基化物含有一个乙氧基化基团。换言之，在每个分子上有单个乙氧基化物链。

    含有乙氧基化物基团的表面活性剂的实例包括但不限于：

    其中所述醇含有单个羟基单元的乙氧基化醇类；烷基酚聚氧乙烯醚类；乙氧基化脂肪酸类；脂肪酸甲酯乙氧基化物类；聚乙二醇；等等。

    乙氧基化物也可含有多个乙氧基化基团。换言之，存在连接在该分子的不同部分上的多个乙氧基化基团。实例包括但不限于：嵌段聚合物；乙氧基化油；失水山梨糖醇衍生物；蔗糖和葡萄糖乙氧基化物；等等。

    嵌段聚合物：这些是具有结构A-B-A’的聚合物，其中A和A’为1个或多个乙烯单元的聚乙烯链，B为1个或多个丙烯单元的聚丙烯链。通常，但并非必需，A和A’具有大致相同的长度。

    在一个实施方案中，A和A’含有从约2到约200个乙烯单元。

    在另一个实施方案中，A和A’含有从约5到约100个乙烯单元。

    在另一个实施方案中，A和A’含有从约7到约15个乙烯单元。

    在另一个实施方案中，A和A’含有约7个、约8个或约12个乙烯单元。

    在另一个实施方案中，B含有从约25到约100个丙烯单元。

    在另一个实施方案中，B含有从约30到约55个乙丙单元。

    在另一个实施方案中，B含有约30个、约34个或约54个丙烯单元。

    在另一个实施方案中，该分子的分子量为从约1000到约20000。

    在另一个实施方案中，所述分子的分子量为从约2000到约10000。

    在另一个实施方案中，所述分子的分子量为约2500、约3000、约3800或约8400。

    这些包括但不限于：

    泊洛沙林：其中A含有约12个环氧乙烷单元，B含有约34个环氧丙烷单元，A’含有约12个环氧乙烷单元，并且平均分子量为约3000。

    泊洛沙姆182：其中A含有约8个环氧乙烷单元，B含有约30个环氧丙烷单元，A′含有约8个环氧乙烷单元，并且平均分子量为约2500。

    泊洛沙姆188：其中A含有约75个环氧乙烷单元，B含有约30个环氧丙烷单元，A′含有约75个环氧乙烷单元，并且平均分子量为约8400。

    泊洛沙姆331：其中A含有约7个环氧乙烷单元，B含有约54个环氧丙烷单元，A′含有约7个环氧乙烷单元，并且平均分子量为约3800。

     乙氧基化醇类

    这些包括但不限于：

    含有从约6到约20个碳原子的直链醇类的乙氧基化物。

    在一个实施方案中，所述直链醇含有约10到约16个碳原子。

    在另一个实施方案中，n为从约1到约100。

    在另一个实施方案中，n为从约1到约50。

    在另一个实施方案中，n为从约5到约50个环氧乙烷单元。

    在另一个实施方案中，n为从约1到约20个环氧乙烷单元。

    在另一个实施方案中，n为从约30到约50个环氧乙烷单元。

     乙氧基化烷基苯酚类

    这些是乙氧基化的烷基苯酚类，即酚的OH被一个乙氧基化基团所取代。

    这些包括但不限于：

    辛基苯酚乙氧基化物，即C₈H₁₇Ph(OCH₂CH₂O)_nH。

    壬基苯酚乙氧基化物，即C₉H₁₉Ph(OCH₂CH₂O)_nH。

    上述分子式的烷基苯酚，其中n为从约1到约100。

    上述分子式的烷基苯酚，其中n为从约1到约50。

    上述分子式的烷基苯酚，其中n为从约9到约15。

    辛基苯酚1.5摩尔乙氧基化物(即n平均为约1.5)；辛基苯酚5摩尔乙氧基化物；辛基苯酚7摩尔乙氧基化物；辛基苯酚9摩尔乙氧基化物；辛基苯酚12摩尔乙氧基化物；辛基苯酚40摩尔乙氧基化物；壬基苯酚1.5摩尔乙氧基化物；壬基苯酚4摩尔乙氧基化物；壬基苯酚6摩尔乙氧基化物；壬基苯酚9摩尔乙氧基化物；壬基苯酚10摩尔乙氧基化物；壬基苯酚10.5摩尔乙氧基化物；壬基苯酚12摩尔乙氧基化物；壬基苯酚15摩尔乙氧基化物；壬基苯酚15摩尔乙氧基化物；壬基苯酚30摩尔乙氧基化物；壬基苯酚40摩尔乙氧基化物；

     乙氧基化脂肪酸类

    这些包括但不限于：

    被酯化以形成以下物质的乙氧基化物：

    单酯类，即RCO₂(CH₂CH₂O)_nOH，其中RCO₂H为脂肪酸；或者

    二酯类，即RCO₂(CH₂CH₂O)_nC(＝O)R。

    脂肪酸包括但不限于：

     饱和脂肪酸类，其不含C＝C基团并包括豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、花生酸、山酸、木蜡酸。

     不饱和脂肪酸，包括：

    单不饱和脂肪酸类，其具有一个C＝C基团，例如棕榈油酸、油酸和神经酸；

    二不饱和脂肪酸类，其具有两个C＝C基团，例如亚油酸；

    三不饱和脂肪酸类，其具有三个C＝C基团，例如α-亚麻酸和γ-亚麻酸；

    四不饱和脂肪酸类，其具有四个C＝C基团，例如花生四烯酸；以及

    五不饱和脂肪酸类，其具有五个C＝C基团，例如二十碳五烯酸。

    也可使用：

    月桂酸；14碳脂肪酸如豆蔻酸；16碳脂肪酸如棕榈酸和棕榈油酸；18碳脂肪酸如硬脂酸、油酸、亚油酸、α-亚麻酸和γ-亚麻酸；20碳脂肪酸如二十碳五烯酸；22碳脂肪酸如花生酸；以及24碳脂肪酸如木蜡酸和神经酸。

    在一个实施方案中，n为从约2到约100。

    在另一个实施方案中，n为从约5到约50。

    在另一个实施方案中，n为从约30到50。

     乙氧基化脂肪酯类或油类(动物油和植物油)

    这些是环氧乙烷与脂肪酯或油反应得到的产物。当使用脂肪油时，所述产物为存在于油中的脂肪酸的乙氧基化物、甘油的乙氧基化物、甘油单酯和甘油二酯的乙氧基化物等的混合物。

    具体实例包括但不限于：

    以下油类的乙氧基化物：茴香油、蓖麻油、丁香油、桂皮油、肉桂油；杏仁油、玉米油(Corn oil)、花生油(Arachis oil)、棉籽油、红花油、玉米油(Maize oil)、亚麻籽油、菜籽油、大豆油、橄榄油、草贡蒿油、迷迭香油、花生油(Peanut oil)、薄荷油、向日葵油、桉树油和芝麻油；芫荽油、薰衣草油、香茅油、杜松油、柠檬油、橙油、鼠尾草油、肉豆蔻油、茶树油、椰子油、动物脂油和猪油。

    在一个实施方案中，每摩尔油甘油三酯使用从1到约50摩尔的环氧乙烷。

    在一个实施方案中，每摩尔油甘油三酯使用从约30到约40摩尔的环氧乙烷。

    环氧乙烷也可与分子式为RCO₂R’的脂肪酸酯反应生成RCO₂(CH₂CH₂O)_nR’。因此，涵盖了分子式为RCO₂(CH₂CH₂O)_nR’的表面活性剂，其中RCO₂H为脂肪酸且R’为含有1到6个碳的烷基。

    一个实施方案为脂肪酸甲酯乙氧基化物，其中R’为甲基。

    在另一个实施方案中，RCO₂H为月桂酸；14碳脂肪酸如豆蔻酸；16碳脂肪酸如棕榈酸和棕榈油酸；18碳脂肪酸如硬脂酸、油酸、亚油酸、α-亚麻酸和γ-亚麻酸；20碳脂肪酸如二十碳五烯酸；22碳脂肪酸如花生酸；以及24碳脂肪酸如木蜡酸和神经酸。

     聚乙二醇是未取代的，或在两端都以氧为末尾的乙氧基化物，即HO(CH₂CH₂O)_nH；

     失水山梨糖醇衍生物：

    这些是含有给一个或多个乙氧基化链加帽的脂肪酸的乙氧基山梨酸酯。例如，聚山梨醇酯80含有一个油酸帽，如以下结构所示。

    

    这些化合物被命名为失水山梨糖醇聚氧乙烯(w+x+y+z)醚单(或者二或三)脂肪酸酯(POE(w+x+y+z)sorbitan mono(or di-or tri-)fatty acid)。

    例如，聚山梨醇酯80为POE(20)失水山梨糖醇聚氧乙烯(20)醚单油酸酯(POE(20)sorbitan monooleate)。

    因此，括号中的数字是该分子上环氧乙烷单元的总数，末尾是酸帽的数目和所述加帽酸。

    这些包括但不限于：

    失水山梨糖醇衍生物，其中环氧乙烷单元的总数为3-30；

    失水山梨糖醇衍生物，其中环氧乙烷单元的总数为4、5或20；

    失水山梨糖醇衍生物，其中所述加帽酸为月桂酸、棕榈酸、硬脂酸或油酸；

    所述失水山梨糖醇衍生物可为

    失水山梨糖醇聚氧乙烯醚单月桂酸酯；

    失水山梨糖醇聚氧乙烯醚二月桂酸酯；

    失水山梨糖醇聚氧乙烯醚三月桂酸酯；

    失水山梨糖醇聚氧乙烯醚单棕榈酸酯；

    失水山梨糖醇聚氧乙烯醚二棕榈酸酯；

    失水山梨糖醇聚氧乙烯醚三棕榈酸酯；

    失水山梨糖醇聚氧乙烯醚单硬脂酸酯；

    失水山梨糖醇聚氧乙烯醚二硬脂酸酯；

    失水山梨糖醇聚氧乙烯醚三硬脂酸酯；

    失水山梨糖醇聚氧乙烯醚单油酸酯；

    失水山梨糖醇聚氧乙烯醚二油酸酯；

    或失水山梨糖醇聚氧乙烯醚三油酸酯；

    具体实例包括：

    失水山梨糖醇聚氧乙烯(20)醚单月桂酸酯；失水山梨糖醇聚氧乙烯(4)醚单月桂酸酯；失水山梨糖醇聚氧乙烯(20)醚单棕榈酸酯；聚氧乙烯(20)醚单棕榈酸酯；失水山梨糖醇聚氧乙烯(20)醚单硬脂酸酯；失水山梨糖醇聚氧乙烯(4)醚单硬脂酸酯；失水山梨糖醇聚氧乙烯(20)醚三硬脂酸酯；失水山梨糖醇聚氧乙烯(20)醚单油酸酯；失水山梨糖醇聚氧乙烯(20)醚15单油酸酯；失水山梨糖醇聚氧乙烯(5)醚10单油酸酯；失水山梨糖醇聚氧乙烯(20)醚三油酸酯；以及

     蔗糖和葡萄糖酯及衍生物

    尽管存在若干基于蔗糖和葡萄糖的表面活性剂，然而某些蔗糖和葡萄糖酯及衍生物与上述山梨酸酯衍生物类似。换言之，所述糖的一个、若干个或全部羟基基团被乙氧基化，并且一个或多个所述乙氧基化链被羧酸加帽。其他蔗糖和葡萄糖酯只被乙氧基化，但不含有加帽羧酸。其他蔗糖和葡萄糖酯可被乙氧基化并被通过与醇反应生成的烷基基团加帽。其他蔗糖和葡萄糖酯可为带有疏水链的所述糖的酯或醚，并且在所述糖的其他位置上存在乙氧基化物取代。

    多种有用的载体可用于本文所公开的眼用配制剂。这些载体包括但不限于，聚乙烯醇、聚乙烯吡啶酮、羟丙基甲基纤维素、泊洛沙姆、羧甲基纤维素、羧乙基纤维素和丙烯酸盐(如)。

    可根据需要或在适合时加入张力调节剂。它们包括但不限于，盐尤其是氯化钠、氯化钾，甘露醇和甘油，或任何其他合适的眼用可接受的张力调节剂。

    类似地，眼用可接受的抗氧化剂包括但不限于偏亚硫酸氢钠、硫代硫酸钠、乙酰半胱氨酸、丁基羟基茴香醚和丁基羟基甲苯。

    所述眼用制剂可包括的其他赋形剂成分为螯合剂。一种可用的螯合剂为依地酸二钠，但是其他螯合剂也可代替它或与之联用。

    组合物可为水性溶液或乳液，或某些其他可接受的液体形式。对于乳液，可使用一种或多种油来形成所述乳液，并且在某些情况下需要一种或多种表面活性剂。合适的油包括但不限于茴香油、蓖麻油、丁香油、桂皮油、肉桂油、杏仁油、玉米油(corn oil)、花生油(arachis oil)、棉籽油、红花油、玉米油(maize oil)、亚麻籽油、菜籽油、大豆油、橄榄油、草贡蒿油、迷迭香油、花生油(peanut oil)、薄荷油、向日葵油、桉树油、芝麻油等。

    在一个实施方案中，所述组合物为水性溶液。

    在另一个实施方案中，所述组合物不含乙醇。

    在另一个实施方案中，所述组合物不含透明质酸。

    在另一个实施方案中，所述组合物不含维生素E TPGS。

    在另一个实施方案中，所述组合物不含环糊精A。

    在另一个实施方案中，所述组合物不含环糊精。

     实施例1

     组分组分        百分比           一次生产量为1升时所                (％w/v)          需的量(g)环孢菌素        安慰剂(P)中为0％ 安慰剂(P)中为0克                0.03％(A)         0.30(A)                0.04％(B)         0.40(B)                0.05％(C)         0.5(C)羧甲基纤维素钠  0.5               5.0聚山梨醇酯80    1.0               10.0甘油            1.0               10.0甘露醇          0.5               5.0二水合柠檬酸钠  0.4               4.0硼酸            0.25              2.5十水合硼酸钠    0.41              4.1氯化钾          0.14              1.4Purite          0.01              0.1纯水            补足至100％       补足至100％

    根据以下方法制备组合物P、A、B和C。

    1.量出一次生产量的约90％的纯水并置于合适的烧杯或容器中。

    2.用一个强力搅拌器(Rotosolver)开始混合所述水以获得强力涡流。

    3.将预先称重的羧甲基纤维素钠加入所述强力涡流中。继续强力混合至少1小时。

    4.将搅拌器减速至慢速。

    5.加入并溶解预先称重的聚山梨醇酯80。

    6.加入并溶解预先称重的甘油。

    7.加入并溶解预先称重的甘露醇。

    8.加入并溶解预先称重的二水合柠檬酸钠。

    9.加入并溶解预先称重的硼酸。

    10.加入并溶解预先称重的十水合硼酸钠。

    11.加入并溶解预先称重的氯化钾。

    12.检测pH并在必要时进行调节。目标pH为7.5+/-0.1。

    13.加入并溶解预先称重的Purite。

    14.加入补足量的纯水以达到最终一次生产量体积。这提供最终的安慰剂制剂(P)。

     制备0.03％(A)、0.04％(B)、0.05％(C)的方法

    15.量出满足一次生产量要求所需的准确量的安慰剂(9815X)并置于含有磁力搅拌子的介质瓶(media bottle)中。

    16.加入并溶解预先称重的环孢菌素。以慢速搅拌以避免发泡。通常需要过夜混合以使所述环孢菌素完全溶解。

    17.过夜混合完成后，将所述环孢菌素溶液泵过Millipore Milligard预过滤器和Pall Suporlife无菌过滤器，以无菌方式收集滤液。

    18.然后可将所述无菌滤液分装在适于眼用的多次剂量滴瓶中。

    19.应对成品的环孢菌素试样、pH、重量克分子渗透压浓度、粘性、纯度、无菌性和杀菌效果进行测试。

    20.成品应储存在室温下并避光。

     实施例2

    制备以下制剂。D和E由本领域中已知的标准方法制备。F按照上文所述的A-C制备方法进行制备，除了用Pemulen TR-2代替羧甲基纤维素钠，并省略柠檬酸盐和硼酸盐缓冲剂的加入。

       D  E  F  乳液  乳液  溶液  环孢菌素A  0.05  0.05  0.05  蓖麻油  1.25  0.30  N/A  聚氧乙烯40硬脂  酸酯，NF  N/A  0.30  N/A  聚山梨醇酯80  1.00  0.30  1.00  甘油  2.20  1.00  1.00  甘露醇  N/A  2.00  2.00  Pemulen TR-2  0.05  0.10  0.10  氢氧化钠(1N)  pH调节  pH调节  pH调节  纯水  QS  QS  QS  pH  pH＝7.4  7.39  7.35

     生物利用率

    本文公开和使用的组合物为哺乳动物提供了治疗有效量的环孢菌素A。然而，尽管并不意图以任何方式限制本发明的范围，然而所述组合物中环孢菌素A的浓度可显著低于通常与治疗有效浓度相关的那些浓度。例如，一种由Allergan，Inc.生产的商标名为的商品化制剂为一种0.05％环孢菌素A蓖麻油乳液。目前开发的其他组合物的浓度为0.1％或更高。

    本文报道的是用兔进行的体内实验的药物代谢动力学数据。然而，兔实验被认为是对其他哺乳动物包括人类中生物利用率而言有用的模型。因此，尽管权利要求公开了生物利用率参数并以其为特征，然而不应将其理解为只将所述治疗限制于兔，而是应当同样考虑将由兔中的生物利用率定义并特征的组合物用于对其他哺乳动物尤其是人类的治疗。

    在一个实施方案中，所述组合物为人的角膜提供比组合物AA更多的环孢菌素A。

    在另一个实施方案中，所述组合物为人的角膜提供比组合物BB更多的环孢菌素A。

    在另一个实施方案中，所述组合物为人的角膜提供比组合物CC更多的环孢菌素A。

    在一个实施方案中，所述组合物为人的角膜提供比组合物DD更多的环孢菌素A。

    在另一个实施方案中，所述组合物为人的角膜提供比组合物EE更多的环孢菌素A。

    在另一个实施方案中，所述组合物为人的角膜提供比组合物FF更多的环孢菌素A。

    在一个实施方案中，所述组合物为人的角膜提供比组合物GG更多的环孢菌素A。

    在另一个实施方案中，所述组合物为人的角膜提供比组合物HH更多的环孢菌素A。

    在另一个实施方案中，所述组合物为人的角膜提供比组合物II更多的环孢菌素A。

    在另一个实施方案中，所述组合物为人的角膜提供比组合物JJ更多的环孢菌素A。

    在另一个实施方案中，所述组合物为人的角膜提供比组合物KK更多的环孢菌素A。

    在另一个实施方案中，所述组合物为人的角膜提供比组合物LL更多的环孢菌素A。

    在另一个实施方案中，所述组合物为人的角膜提供比组合物MM更多的环孢菌素A。

    在一个实施方案中，所述组合物为人的结膜提供比组合物AA更多的环孢菌素A。

    在另一个实施方案中，所述组合物为人的结膜提供比组合物BB更多的环孢菌素A。

    在另一个实施方案中，所述组合物为人的结膜提供比组合物CC更多的环孢菌素A。

    在一个实施方案中，所述组合物为人的结膜提供比组合物DD更多的环孢菌素A。

    在另一个实施方案中，所述组合物为人的结膜提供比组合物EE更多的环孢菌素A。

    在另一个实施方案中，所述组合物为人的结膜提供比组合物FF更多的环孢菌素A。

    在一个实施方案中，所述组合物为人的结膜提供比组合物GG更多的环孢菌素A。

    在另一个实施方案中，所述组合物为人的结膜提供比组合物HH更多的环孢菌素A。

    在另一个实施方案中，所述组合物为人的结膜提供比组合物II更多的环孢菌素A。

    在另一个实施方案中，所述组合物为人的角膜提供比组合物JJ更多的环孢菌素A。

    在另一个实施方案中，所述组合物为人的结膜提供比组合物KK更多的环孢菌素A。

    在另一个实施方案中，所述组合物为人的角膜提供比组合物LL更多的环孢菌素A。

    在另一个实施方案中，所述组合物为人的结膜提供比组合物MM更多的环孢菌素A。

    在另一个实施方案中，对雌性新西兰白兔的每只眼睛局部给予一滴所述组合物的35μL液滴，在局部给药后30分钟时为所述兔的角膜提供至少约500ng环孢菌素A/克该兔的角膜。

    在另一个实施方案中，在对雌性新西兰白兔的每只眼睛局部给予一滴所述组合物的35μL液滴的情况下，在局部给药后30分钟时为所述兔的角膜提供至少约1000ng的环孢菌素A/克该兔的角膜。

    在另一个实施方案中，对雌性新西兰白兔的每只眼睛局部给予一滴所述组合物的35μL液滴，在局部给药后30分钟时为所述兔的角膜提供至少约1400ng的环孢菌素A/克该兔的角膜。

    在另一个实施方案中，在对雌性新西兰白兔的每只眼睛局部给予一滴所述组合物的35μL液滴的情况下，在局部给药后30分钟时为所述兔的角膜提供至少约2000ng的环孢菌素A/克该兔的角膜。

    在另一个实施方案中，对雌性新西兰白兔的每只眼睛局部给予一滴所述组合物的35μL液滴，在局部给药后30分钟时为所述兔的角膜提供至少约2400ng的环孢菌素A/克该兔的角膜。

    在另一个实施方案中，对雌性新西兰白兔的每只眼睛局部给予一滴所述组合物的35μL液滴，在局部给药后24小时内为所述兔的角膜提供至少约17000ng的环孢菌素A/克该兔的角膜。

    在另一个实施方案中，所述组合物是一种含有从0.005％到约0.04％环孢菌素A的水性溶液，在对雌性新西兰白兔的每只眼睛局部给予一滴所述组合物的35μL液滴的情况下，为所述兔的角膜提供至少约17000ng的环孢菌素A/克角膜，如通过以下方法所测定的：

    对15只雌性新西兰白兔试验受试者的每只眼睛局部给予所述组合物；并且

    在对所述受试者给药后约0.5小时、约2小时、约6小时、约12小时和约24小时的时间点测定三个受试者的角膜中环孢菌素A的量；

    其中对于每个受试者，只测定一次角膜中环孢菌素A的量。

    在另一个实施方案中，给予新西兰白兔的每只眼睛的所述组合物为所述兔的角膜提供至少约30000ng环孢菌素A/克角膜。

    在另一个实施方案中，给予新西兰白兔的每只眼睛的所述组合物为所述兔的角膜提供至少约45000ng环孢菌素A/克角膜。

    在另一个实施方案中，给予新西兰白兔的每只眼睛的所述组合物为所述兔的角膜提供至少约95000ng环孢菌素A/克角膜。

    在另一个实施方案中，给予新西兰白兔的每只眼睛的所述组合物为所述兔的角膜提供至少约155000ng环孢菌素A/克角膜。

    在另一个实施方案中，对雌性新西兰白兔的每只眼睛局部给予一滴所述组合物的35μL液滴，在局部给药后24小时内为所述兔的结膜提供至少约6000ng环孢菌素A/克该兔的结膜。

    在另一个实施方案中，所述组合物是一种含有从0.005％到约0.04％环孢菌素A的水性溶液，在对雌性新西兰白兔的每只眼睛局部给予一滴所述组合物的35μL液滴的情况下，为所述兔的结膜提供至少约6000ng的环孢菌素A/克结膜，如以下方法所测定的：

    对15只雌性新西兰白兔试验受试者的每只眼睛局部给予所述组合物；并且

    在对所述受试者给药后约0.5小时、约2小时、约6小时、约12小时和约24小时的时间点测定三个受试者的结膜中环孢菌素A的量；

    其中对于每个受试者，只测定一次结膜中环孢菌素A的量。

    在另一个实施方案中，给予新西兰白兔的每只眼睛的所述组合物为所述兔的结膜提供至少约5000ng环孢菌素A/克结膜。

    在另一个实施方案中，给予新西兰白兔的每只眼睛的所述组合物为所述兔的结膜提供至少约7000ng环孢菌素A/克结膜。

    在另一个实施方案中，给予新西兰白兔的每只眼睛的所述组合物为所述兔的结膜提供至少约10000ng环孢菌素A/克结膜。

    在另一个实施方案中，给予新西兰白兔的每只眼睛的所述组合物为所述兔的结膜提供至少约17000ng环孢菌素A/克结膜。

    在另一个实施方案中，对于在12个月中双眼被一天两次局部给予35μL所述组合物的液滴的人而言，环孢菌素A的血液水平小于0.1mg/mL。

     药物代谢动力学研究1

    将35μL的三种试验制剂之一的等分试样局部给予雌性新西兰白兔的每只眼睛(n＝3只兔/时间点)。在给药后0.5、2、6、12、24、48和144小时，采集角膜、结膜、巩膜、睑缘、鼻泪管和血液样品。从未实验的兔(n＝2)采集样品用作给药前样品。定量范围在血中为0.2-40ng/mL，在角膜和结膜中为0.1-200ng，在睑缘和鼻泪管中为0.1-100ng，在巩膜和泪腺中为0.1-20ng。

    单次眼部滴注三种0.05％环孢菌素A制剂之一后眼部组织中的环孢菌素A的药物代谢动力学参数总结于下表1中。

    表1

    

    NC＝不可计算

    BLQ＝低于定量限

    简要总结，单次眼部滴注0.05％环孢菌素A制剂后，在组合物F时观察到的环孢菌素A眼部组织接触水平最高，其次是组合物E，最后是组合物D。

    材料

    试验物品

    如上所述，使用组合物D、E和F进行这些实验。

    化学药品、试剂和供应品

    全部其他化学药品都为试剂级或更高。

    动物

    物种、品系、性别、年龄、大小、来源和标识

    从Char1es River(St.Constant，Quebec，Canada)购买重1.8-2.6kg的雌性新西兰白兔。使用永久性的耳标以标识动物。

    论证

    由于兔和人类的眼部解剖学结构相似，因此兔是一种有吸引力的动物模型。

    动物饲养：

    将全部动物圈养在环境受到控制的设施中，所述设施带有每天提供12小时光照/12小时黑暗期的时间控制荧光照明系统。室温被维持在61和72°F之间，相对湿度在30和70％之间。气流范围为每小时10到30次换气。用Edstrom Watchdog系统第4.0版监控温度、湿度和气流。

    对所述动物提供经认证的高纤维(Hi-Fiber)兔饮食。饮食认证和分析由卖商提供。除了厂商提供的分析之外不再进行分析。

    无限制提供通过反渗透方法纯化的引用水。定期检测水中可对本研究的进行造成干扰的任何污染。由厂商进行动物饲料的分析。

    动物环境适应

    在Allergan的适应期间，每日观察动物的总体健康和行为的任何变化。在本研究开始之前，将兔检疫隔离至少5天。在进行本研究之前和研究期间，所有动物都表现为健康的。

    动物处死和处置

    通过向耳缘静脉注射至少1mL的戊巴比妥钠将动物无痛杀死。

    研究设计和实验方法

    研究设计

    表1.研究设计

       动物物种和品系  新西兰白兔  性别  雌性  数量  每个时间点3只兔  给药前2只兔(生物分析对照)  体重  1.8-2.8kg  给药方案  局部眼部、单次双侧给药  剂量  35μL  试验物品  含0.05％AGN 192371(环孢菌素A)的制剂  时间点  给药后0.5、2、6、12、24、48和144小时  组织/基质  角膜、结膜、巩膜、鼻泪管、睑缘和血液  测定方法  LC-MS/MS  分析物  AGN 192371(环孢菌素A)  测定范围  血液：0.5-40ng/mL  角膜：0.1-200ng  结膜：0.1-200ng  睑缘：0.1-100ng  鼻泪管：0.1-100ng  巩膜：0.1-20ng

    单次双侧给药，每个时间点3只兔(6只眼睛和3个血液样品)。第4组的两只动物未被给药并被用作生物分析对照。给药前，对65只动物进行称重并分为4个研究组。研究设计示于表1。四个研究组示于下表2：

    表2

       组 治疗 剂量(μL)  频率  n  1 组合物F 35  单次双侧给药  每个时间点3F  (共21F)  2 组合物E 35  单次双侧给药  每个时间点3F  (共21F)  3 组合物D 35  单次双侧给药  每个时间点3F  (共21F)  4 不给药 --  --  2F  (共2F)

    n＝每组动物数

    F＝雌性

    处理前检查

    进行研究之前，对每只动物进行身体检查。用标准化数据收集表在给药前以及眼部给药后立即记录总体观察情况。

    随机化

    给药前，对65只动物进行称重并随机分为4个研究组。

    给药方法：

    在研究的第0小时，通过双侧眼部滴注对动物给药一次。临给药前，检查眼睛的任何异常，如感染、红眼或可见损伤。只使用无可见损伤的动物。轻轻地将下眼睑拉离眼睛。使用Gilson精密移液器将35-给药溶液注入每只眼睛的下结膜穹窿。记录给药时间。轻轻地使眼睛闭合大约5秒钟，确保药剂均匀分配到眼睛上。给药后进行全眼观察。对所述动物，包括被给药的眼睛，进行刺激指征的主观评价。记录观察结果。

    死亡率/发病率

    在研究中观察动物的死亡率/发病率。

    体重

    在给药的前一天对动物进行称重，然后随机分组。

    尸检前的血液收集

    在无痛致死/尸检前收集每只兔的血液。按照0.1mL/kg的体积经静脉注射氯胺酮/甲苯噻嗪混合物(87mg/mL氯胺酮，13mg/mL甲苯噻嗪)将动物麻醉。通过心脏穿刺收集血液。将大约5mL的血液收集到10mL的浅紫色顶盖(K3EDTA)试管中。将血液样品储存在约-15℃或约-15℃以下直至进行生物分析。

    安乐死

    收集血液后通过静脉注射商品化安乐死溶液将动物安乐死。

    尸检和眼组织收集

    在尸检时，从两只眼睛中收集眼部样品，在适当的部位沾干，称重并置于单独的、适当标记的、硅烷化的小瓶中。用洗涤两只眼睛以清除残留在眼表面上的残留表面制剂。

    结膜

    从每只眼睛中取出上下结膜并收集在一起，记录重量，置于单独的螺旋盖玻璃13x100硅烷化试管中并立即置于冰上。将样品储存在约-15℃下或更低直至进行生物分析。

    角膜

    从每只眼睛中取出整个角膜；记录重量，置于单独的螺旋盖玻璃13x100硅烷化试管中并立即置于冰上。将样品储存在约-15℃下或更低直至进行生物分析。

    巩膜

    从每只眼睛中取出巩膜；记录重量，置于单独的螺旋盖玻璃13x100硅烷化试管中并立即置于冰上。将样品储存在约-15℃下或更低直至进行生物分析。

    鼻泪管

    取出包含与每只眼睛相连的鼻泪管的组织；记录重量，置于螺旋盖玻璃13x100硅烷化试管中并立即置于冰上。将样品储存在约-15℃下或更低直至进行生物分析。

    睑缘

    从每只眼睛中取出睑缘；记录重量，置于单独的螺旋盖玻璃13x100硅烷化试管中并立即置于冰上。将样品储存在约-15℃下或更低直至进行生物分析。

    样品储存

    将血液和眼部组织样品储存在-15℃下或更低直至进行生物分析。

    生物分析

    使用以下方法对眼部组织和血液中的浓度进行定量。

    通过在4℃下用2.0mL甲醇浸泡过夜而提取眼部组织样品。然后用2.0mL甲醇第二次浸泡，并在室温下摇动大约1小时。从共4mL有机提取物中取出1mL的等分试样(对于泪腺样品，全部4mL都被分析)，并加入内标(20μL 500ng/mL的CsG)。将甲醇提取物蒸发至干燥，用200μL含有2mM的乙酸铵/0.4％甲酸的50∶50乙腈∶水重溶以进行LC MS/MS分析。分析血液样品的生物分析方法包括将内标CsG(10μL，500ng/mL)加入0.5mL经K3EDTA处理的兔血等分试样中。

    将血液样品在37℃下温育30分钟后，用0.1N HCL(2mL)将所述样品酸化。在每个样品中加入甲基叔丁基醚(4mL)并搅拌15分钟。取出有机层并通过加入0.1N NaOH(2mL)使其成碱性。将有机提取物从水层中分离出来，蒸发至干燥并用200μL含有2mM的乙酸铵/0.4％甲酸的50∶50乙腈∶水重溶以进行LC MS/MS分析。使用PE Sciex API 3000质谱仪(Applied Biosystems，Foster City，CA)、Leap自动取样器(Carrboro，NC)和HPLC泵(Shimadzu Scientific Instruments，Columbia，MD)，通过LC-MS/MS分析50μL一份的重溶样品。以0.3mL/min的流速用溶剂梯度洗脱液(A＝2mM乙酸铵/0.4％甲酸的水溶液，B＝乙酸铵/0.4％甲酸的乙腈溶液)，在Keystone BDS C8柱(3μm，2.1x 50mm，65℃)上进行反相HPLC。在MRM分析中所用的前体-产品离子对为：CsA的1203(MH)+→425.5和IS(环孢菌素G)的m/z 1217(MH)+→425.5。总分析时间为5分钟，CsA和CsG的保留时间分别为约1.82和1.86分钟。

    数据处理

    数据收集

    处理前后全面眼部检查

    体重：在第前1天随机化

    给药记录

    死亡率/发病率

    血液样品：尸检前

    眼组织样品：尸检后

    数据计算和离群值分析

    所有数据都用于计算，除非由于正当理由而在原始数据中被忽略。

    药物代谢动力学分析

    使用Thermo Electron WatsonTM(Philadelphia，PA)和Excel(Redmond，Washington)进行药物代谢动力学计算。使用已知的非分割(non-compartmental)法计算下列计算药物代谢动力学参数(参见Tang-Lui，et.al.Pharmaceutical Research，Vol 5，No.4，1988，238-241)。尽可能地使用描述性统计数据如平均值和标准偏差来描述药物代谢动力学数据。将浓度时间曲线下的面积(AUC)记录为复合AUC并尽可能地表示为平均值的±标准偏差(SEM)。

    

    定量限以下的值和取整

    如果超过一半的用于平均值计算的浓度值在定量限(BLQ)以下，那么将所述统计数据表示为不可计算的(NC)。如果一半或更多的值是可定量的，那么用“0”替代任何BLQ值，并且用这些被替代的值计算其平均值及其标准偏差(SD)。在每个治疗组内在每个取样时间点计算平均值和平均值的标准偏差。当样品数量小于或等于2时，只列出平均值。将所有平均值记录为3位有效数字，将标准偏差记录为小数位与它们各自的平均值的小数位相同。

    方法变化

    在第6小时的时间点收集眼部组织样品前，所述眼睛未用洗涤来清除任何残留在眼表面上的残留表面制剂。此变化被认为对此研究的结果具有最小的影响，因为通常此药物可由眼表面快速吸收。此外，在6小时内兔的眨眼也可清除任何残留的表面制剂。

    简写

      ACN  乙腈  LLOQ  定量下限 ALQ  高于定量限  M  雄性 AUC  血浆或血液药物浓度-  时间曲线下的面积  N，n，  No.，no.  数量 AUC_Extrap  从时间0到最后一次检  测时间点的血浆或血  液药物浓度时间曲线  下的外推面积  N/A，N.A.，  或n/a  不可用的 BID  每天两次  N/C，N.C.，  NC，或n/c  不可计算的 BLQ  低于定量限  NR  无结果/未报告 BMS  生物分析质谱法  NS  无样品 CFR  联邦管理法规  NZW  新西兰白兔 C0或C₀  在时间0的外推血浆或  血液药物浓度  OD  右眼 Cmax 或 C_max  最大药物浓度  OU  双眼 CONC  浓度  PKDM  药物代谢动力学和  药物代谢 DG  怀孕日(Day of  Gestat ion)  PO  通过嘴

      ACN  乙腈  LLOQ  定量下限 DSE  药物安全评估  QID  每天四次 EDTA(K₃)  乙二铵四醋酸钾  QNS  不足量 F  雌性  SD、S.D.  或sd  标准偏差 GD  怀孕日(Gestation  Day)  SE  标准误差 FDA  美国食品与药物管理  局  Sec  秒 GLP  良好的实验室规范  SMP  样品  IC  心脏内  T1/2或T_1/2  药物半衰期  IS  收到的样品不足  TA  曲安奈德  IM  肌肉内  TID  每天三次  IU  国际单位  TK  毒物代谢动力学  IV  静脉内  T_max或Tmax  观察到Cmax的时间  IVT  玻璃体内  U  单位  LC-MS/MS  液相色谱串联质谱法  ULOQ  定量上限

    注：并非全部列出的简称都会出现在此报道中。

    结果与讨论

    角膜

    平均浓度和药物代谢动力学参数总结于表3和表4中。对眼睛单次双侧给予三种0.05％环孢菌素A制剂之一后，角膜中的环孢菌素A的浓度-时间曲线示于图1。

    表3对新西兰白兔单次双侧局部眼部滴注三种0.05％环孢菌素A制剂之一后，角膜的环孢菌素A浓度的平均值。

    

    平均值表示n＝6的平均值

     ^a用于计算t_1/2的浓度时间点

    表4.对新西兰白兔单次双侧局部眼部滴注三种0.05％环孢菌素A制剂之一后，环孢菌素A在角膜中的药物代谢动力学参数。

       参数  组合物F  组合物E  组合物D  C_max(ng/g)  4050±1220  1100±190  536±138  T_max(hr)  0.500  2.00  6.00  AUC_0-t(ng·hr/g)^a  163000±7000  76200±3300  29300±2000  AUC_0-24(ng·hr/g)  59000  22100  9450  t_1/2(hr)  41.3  42.2  49.8  MRT(hr)  50.3  56.5  61.6

     ^a0-144小时的AUC区间用于这三种制剂的计算

    组合物F

    单次双侧眼部滴注组合物F后，环孢菌素A被迅速吸收到角膜中，峰值角膜浓度(C_max)为4050±1220ng/g，发生在给药后0.500小时。到最后一个可检测时间点的浓度-时间曲线下的面积值(AUC_0-t)为163000±7000ng·hr/g，其AUC_0-24值为59000ng·hr/g。最终半衰期(t_1/2)为41.3小时，平均滞留时间(MRT)为50.3小时。

    组合物E

    单次双侧眼部滴注组合物E后，环孢菌素A被吸收到角膜中，C_max值为1100±190ng/g，发生在给药后2.00小时。AUC_0-t值为76200±3300ng·hr/g，AUC_0-24值为22100ng·hr/g。最终的t_1/2为41.7小时，MRT为56.5小时。

    组合物D

    单次双侧眼部滴注组合物D后，环孢菌素A被吸收到角膜中，C_max值为536±138ng/g，发生在给药后6.00小时。AUC_0-t值为29300±2000ng·hr/g，AUC_0-24值为9450ng·hr/g。其最终的t_1/2为49.8小时，MRT为61.6小时。

    结膜

    平均浓度和药物代谢动力学参数总结于表5和表6中。对兔眼部单次双侧给予三种0.05％环孢菌素A制剂之一后结膜中的环孢菌素A的浓度-时间曲线示于图2。

    表5.对新西兰白兔单次双侧局部眼部滴注三种0.05％环孢菌素A制剂之一后，结膜的环孢菌素A浓度的平均值。

    

    平均值表示n＝6的平均值

    BLQ＝低于定量限

     ^a用于计算t_1/2的浓度时间点

    表6.对新西兰白兔单次双侧局部眼部滴注三种0.05％环孢菌素A制剂之一后，环孢菌素A在结膜中的药物代谢动力学参数。

       参数 组合物F  组合物E  组合物D  C_max(ng/g) 4460±650  2560±1070  694±410  T_max(hr) 0.500  0.500  0.500  AUC_0-t(ng·hr/g) 18100±800^a  11600±700^b  5290±480^b

       参数 组合物F  组合物E  组合物D  AUC_0-24(ng·hr/g) 17100  11600  5290  t_1/2(hr) 11.3  5.57  4.55  MRT(hr) 7.37  5.93  6.07

     ^a0-48小时的AUC区间用于计算

     ^b0-24小时的AUC区间用于计算

    组合物F

    单次双侧眼部滴注组合物F后，环孢菌素A被迅速吸收到结膜中，C_max值为4460±650ng/g，发生在给药后0.500小时。AUC_0-t值为18100±800ng·hr/g，AUC_0-24值为17100ng·hr/g。最终t_1/2为11.3小时，MRT为7.37小时。

    组合物E

    单次双侧眼部滴注组合物E后，环孢菌素A被迅速吸收到结膜中，C_max值为2560±1070ng/g，发生在给药后0.500小时。AUC_0-t值为11600±700ng·hr/g。最终t_1/2为5.57小时，MRT为5.93小时。

    组合物D

    单次双侧眼部滴注组合物D后，环孢菌素A被迅速吸收到结膜中，C_max值为694±410ng/g，发生在给药后0.500小时。AUC_0-t值为5290±480ng·hr/g。最终t_1/2为4.55小时，MRT为6.07小时。

    巩膜

    平均浓度和药物代谢动力学参数总结于表7和表8中。对兔眼部单次双侧给予三种0.05％环孢菌素A制剂之一后，巩膜中的环孢菌素A的浓度时间-曲线示于图3。

    表7.对新西兰白兔单次双侧局部眼部滴注三种0.05％环孢菌素A制剂之一后，巩膜的环孢菌素A浓度的平均值。

    

    平均值表示n＝6的平均值

    BLQ＝低于定量限

     ^a用于计算t_1/2的浓度时间点

    表8.对新西兰白兔单次双侧局部眼部滴注三种0.05％环孢菌素A制剂之一后，环孢菌素A在巩膜中的药物代谢动力学参数。

       参数  组合物F  组合物E  组合物D  C_max(ng/g)  545±98  136±43  53.0±10.9  T_max(hr)  0.500  0.500  6.00  AUC_0-t(ng·hr/g)  6110±260^a  2840±150^a  1040±50^b  AUC_0-24(ng·hr/g)  3900  1560  792  t_1/2(hr)  29.7  24.8  18.7  MRT(hr)  25.3  26.9  23.8

     ^a0-144小时的AUC区间用于计算

     ^b0-48小时的AUC区间用于计算

    组合物F

    单次双侧眼部滴注组合物F后，环孢菌素A被迅速吸收到巩膜中，C_max值为545±98ng/g，发生在给药后0.500小时。AUC_0-t值为6110±260ng·hr/g，AUC_0-24值为3900ng·hr/g。最终t_1/2为29.7小时，MRT为25.3小时。

    组合物E

    单次双侧眼部滴注组合物E后，环孢菌素A被迅速吸收到巩膜中，C_max值为136±43ng/g，发生在给药后0.500小时。AUC_0-t值为2840±150ng·hr/g，AUC_0-24值为1560ng·hr/g。最终t_1/2为24.8小时，MRT为26.7小时。

    组合物D

    单次双侧眼部滴注组合物D后，环孢菌素A被吸收到巩膜中，C_max值为53.0±10.9ng/g，发生在给药后6.00小时。AUC_0-t值为1040±50ng·hr/g，AUC_0-24值为792ng·hr/g。最终t_1/2为18.7小时，MRT为23.8小时。

    睑缘

    平均浓度和药物代谢动力学参数总结于表9和表10中。对兔眼部单次双侧给予三种0.05％环孢菌素A制剂之一后，睑缘中的环孢菌素A的浓度-时间曲线示于图4。

    表9.对新西兰白兔单次双侧局部眼部滴注三种0.05％环孢菌素A制剂之一后，睑缘的环孢菌素A浓度的平均值。

    

    平均值表示n＝6的平均值

     ^a用于计算t_1/2的浓度时间点

    表10.对新西兰白兔单次双侧局部眼部滴注三种0.05％环孢菌素A制剂之一后，环孢菌素A在睑缘中的药物代谢动力学参数。

       参数  组合物F  组合物E  组合物D  C_max(ng/g)  3120±1040  2020±980  2450±970  T_max(hr)  0.500  0.500  2.00  AUC_0-t(ng·hr/g)^a  38300±5300  42200±10800  27700±3300

       参数  组合物F  组合物E  组合物D  AUC_0-24(ng·hr/g)  19900  17600  18000  t_1/2(hr)  42.5  38.2  24.4  MRT(hr)  40.5  38.4  21.9

     ^a0-144小时的AUC区间用于三种制剂的计算

    组合物F

    单次双侧眼部滴注组合物F后，环孢菌素A被迅速吸收到睑缘中，C_max值为3120±1040ng/g，发生在给药后0.500小时。AUC_0-t值为38300±5300ng·hr/g，AUC_0-24值为19900ng·hr/g。最终t_1/2为42.5小时，MRT为40.5小时。

    组合物E

    单次双侧眼部滴注组合物E后，环孢菌素A被迅速吸收到睑缘中，C_max值为2020±980ng/g，发生在给药后0.500小时。AUC_0-t值为42200±10800ng·hr/g，AUC_0-24值为17600ng·hr/g。最终t_1/2为38.1小时，MRT为38.4小时。

    组合物D

    单次双侧眼部滴注组合物D后，环孢菌素A被吸收到睑缘中，C_max值为2450±970ng/g，发生在给药后2.00小时。AUC_0-t值为27700±3300ng·hr/g，AUC_0-24值为18000ng·hr/g。终t_1/2为24.4小时，MRT为21.9小时。

    鼻泪管

    平均浓度和药物代谢动力学参数总结于表11和表12中。对兔眼部单次双侧给予三种0.05％环孢菌素A制剂之一后，鼻泪管组织中的环孢菌素A的浓度-时间曲线示于图5。

    表11.对新西兰白兔单次双侧局部眼部滴注三种0.05％环孢菌素A制剂之一后，鼻泪管的环孢菌素A浓度的平均值。

    

    平均值表示n＝6的平均值

    BLQ＝低于定量限

    表12.对新西兰白兔单次双侧局部眼滴注三种0.05％环孢菌素A制剂之一后，环孢菌素A在鼻泪管中的药物代谢动力学参数。

       参数  组合物F  组合物E  组合物D  C_max(ng/g)  195±201  74.4±20.9  72.0±91.7  T_max(hr)  0.500  0.500  0.500  AUC_0-t(ng·hr/g)  2190±350^a  1190±212^b  279±39^c  AUC_0-12(ng·hr/g)  478±86  465±106  279±39  t_1/2(hr)  NC  NC  NC  MRT(hr)^d  17.6  24.7  12.1

    NC＝不可计算

     ^a0-144小时的AUC区间用于计算

     ^b0-48小时的AUC区间用于计算

     ^c0-12小时的AUC区间用于计算

     ^d0-12小时的时间间隔用于计算

    组合物F

    单次双侧眼部滴注组合物F后，环孢菌素A迅速流到鼻泪管中，C_max值为195±201ng/g，发生在给药后0.500小时。AUC_0-t值为2190±350ng·hr/g，AUC_0-12值为478±86ng·hr/g。MRT为17.6小时。

    组合物E

    单次双侧眼部滴注组合物E后，环孢菌素A迅速流到鼻泪管中，C_max值为74.4±20.9ng/g，发生在给药后0.500小时。AUC_0-t值为1190±210ng·hr/g，AUC_0-12值为465ng·hr/g。MRT为24.7小时。

    组合物D

    单次双侧眼部滴注组合物D后，环孢菌素A迅速流到鼻泪管中，C_max值为72.0±91.7ng/g，发生在给药后0.500小时。AUC_0-t值为279±39ng·hr/g。MRT为12.1小时。

    血液

    血液中环孢菌素A的平均浓度总结在表13中。

    表13.对新西兰白兔单次双侧局部眼部滴注三种0.05％环孢菌素A制剂之一后，环孢菌素A的血液浓度的平均值。

    

    平均值表示n＝3的平均值

    BLQ＝低于定量限

    组合物F

    单次双侧眼部滴注组合物F后，在给药后0.5和2小时在血液中检测到环孢菌素A的浓度分别为2.21±0.33ng/g和0.463±0.021ng/mL。在随后的全部时间点，环孢菌素A水平都低于定量限。

    组合物E

    单次双侧眼部滴注组合物E后，在给药后0.5小时在血液中检测到环孢菌素A的浓度为0.441±0.126ng/g。在随后的全部时间点，环孢菌素A水平都低于定量限。

    组合物D

    单次双侧眼部滴注组合物D后，环孢菌素A水平在全部时间点都低于定量限。

    对兔给予组合物F通常将最高水平的环孢菌素A递送到眼组织中，从而观察到浓度时间-曲线下的面积(AUC)与组合物D相比平均增加5倍。对兔给予组合物E使得其AUC与组合物D相比平均增加2倍。在本研究中，对新西兰白兔给予组合物D后观察到的药物代谢动力学曲线与之前报告的数据很好地吻合。

    通常，对于组合物F观察到的最终半衰期和平均滞留时间最长，其次是组合物E，最后是组合物D。因此，除了报道了角膜、结膜、巩膜和睑缘在24小时内的AUC和鼻泪管在12小时内的AUC以外，到最后一个可检测时间点的AUC值也被报告，从而对一天一次给药后相同的区间内所达到的药物水平进行评估。综上，在比较AUC_0-t值时所观察到的趋势与在比较AUC_0-24或AUC_0-12时所观察到的趋势一致。

    最后，当药物被制剂为水性组合物F时，单次眼部滴注0.05％环孢菌素A制剂后观察到的环孢菌素A眼组织接触水平最高，其次是组合物E，最后是组合物D。在血液药物接触中观察到了一致的趋势。

    并非意图限制本发明的范围，这些药物代谢动力学结果被认为表明，明显低于之前所知浓度的环孢菌素A浓度可用于局部眼用组合物并仍然能获得治疗有效量的环孢菌素A。

     药物代谢动力学研究2

    按照与制备组合物D、E和F类似的方式制备了以下组合物。

       制剂  组合物G  组合物H  组合物D  组分  水性溶液  水性溶液  乳液  环孢菌素A  0.020  0.030  0.050  Purite  0.01％(100  ppm)  0.01％(100  ppm)  0.0％(0  ppm)  聚山梨醇酯80  1.0  1.0  1.0  甘油  1.0  1.0  2.2  甘露醇  0.5  0.5  N/A  羧甲基纤维素钠  (CMC)-7LFPH  0.5  0.5  N/A  二水合柠檬酸钠  0.4  0.4  N/A  硼酸  0.25  0.25  N/A  十水合硼酸钠  0.41  0.41  N/A  氯化钾  0.14  0.14  N/A

       制剂  组合物G  组合物H  组合物D  蓖麻油  N/A  N/A  1.25  Pemulen TR-2  N/A  N/A  0.05  氢氧化钠  N/A  N/A  pH 7.4  纯水  QS  QS  N/A

    使用与已述方法相同的分析方法进行药物代谢动力学研究。参数如下。

    ·试验制剂：             G、H和D

    ·动物物种/品系：        NZW兔

    ·性别：                 雌性

    ·数量：                 2只兔/时间点(2只空白兔)

    ·给药途径：             局部眼用

    ·给药方式：             双侧、QD(水性溶液)/BID(组合物D)-5天

    ·剂量：                 35μL

    ·时间点：               第1天和第5天-给药后0.5、2、6、12、24小时

    ·检测方法：             LC-MS/MS

    ·分析物：               环孢菌素A

    ·数据分析：             C_max、AUC_0-24、剂量标准化的AUC

    角膜、眼泪和血液中的结果示于下表。

    表14.角膜中的环孢菌素生物利用率。

    

    表15.血液中的环孢菌素生物利用率。

    

    n＝只兔/时间点

    BLQ-低于检测限(0.2ng/mL)

    表16.眼泪中的环孢菌素生物利用率。

    

     标准组合物

    这些组合物(AA-MM)特别地被考虑用作对本文所公开组合物的特征进行比较的标准品。

    以下组合物意图表示与在Kanai et.al.，Transplantation Proceedings，Vol 21，No 1(February)，1989：3150-3152中所公开的组合物相同的那些组合物，所述文献以引用的方式纳入本文中：

    组合物AA：一种由0.025％环孢菌素A、40mg/mLα-环式糊精和水组成的溶液；

    组合物BB：一种由0.009％环孢菌素A、20mg/mLα-环式糊精和水组成的溶液；以及

    组合物CC：一种由0.003％环孢菌素A、10mg/mLα-环式糊精和水组成的溶液。

    以下组合物意图表示与在Cheeks et.al.，Current Eye Research，Vol11，No 7(1992)，641-649中所公开的组合物相同的那些组合物，所述文献以引用的方式纳入本文中：

    组合物DD：一种含有0.025％环孢菌素A的40mg/mL的α-环式糊精溶液。

    以下组合物意图表示与在Tamilvanan，Stp Pharma Sci Nov-Dec；11(6)：421-426中所公开的组合物相同的那些组合物，不同之处在于环孢菌素A浓度不同，所述文献以引用的方式纳入本文中。

    组合物EE：一种由环孢菌素A(0.05w/w％)、蓖麻油(2.5w/w％)、硬脂酰胺(0.12w/w％)、α-生育酚(0.01w/w％)、苯扎氯(0.01w/w％)和补足至100w/w％的水组成的乳液。

    以下组合物意图表示与美国专利5,051,402(column 7)中所公开的样品C-E相同的那些组合物。所述公开内容以引用的方式整体纳入本文中。

    组合物FF：0.25mL/mL的环孢菌素A、40mg/mL的α-环式糊精和7.79mg/mL的氯化钠；

    组合物GG：0.10mL/mL的环孢菌素A、20mg/mL的α-环式糊精和8.40mg/mL的氯化钠；以及

    组合物HH：0.05mL/mL的环孢菌素A、10mg/mL的α-环式糊精和8.70mg/mL的氯化钠。

    以下组合物意图表示与在Abdulrizak，Stp Pharma Sci Nov-Dec；11(6)：427-432中所公开的组合物相同的组合物，不同之处在于环孢菌素A浓度不同，所述文献以引用的方式纳入本文中。

    组合物II：一种由环孢菌素A(0.05w/w％)、蓖麻油(2.5w/w％)、泊洛沙姆188(0.425w/w％)、甘油(2.25w/w％)、类脂E-80(0.5w/w％)、硬脂酰胺(0.12w/w％)、生育酚(0.01w/w％)、苯扎氯(0.01w/w％)和水组成的乳液。

    以下组合物意图表示与在Kuwano Mitsuaki et al.Pharm Res 2002Aug；19(1)：108-111中所公开的组合物相同的组合物。

    组合物JJ：一种由环孢菌素A(0.0865w/w％)、乙醇(0.1％)、MYS-40(2％)、HPMC(0.3w/v％)、磷酸二氢钠(0.2w/v％)和EDTA二钠(0.01％w/v％)、用于将张力调节为287mOsm的氯化钠和水组成的溶液。

    组合物KK意图表示在US20010041671中作为表1中的制剂1而被公开的组合物，所述公开以引用的方式纳入本文中。组合物LL是在US20010041671中作为制剂3而被公开的组合物，不同之处在于环孢菌素的浓度有所减少。

    组合物KK：环孢菌素A(0.02％)、透明质酸钠(0.05％)、Tween 80(0.05％)、Na₂HPO₄·12H₂O(0.08％)、山梨糖醇(5.46％)、补足至100mL的纯水，pH 7.0-7.4，mosm/L＝295-305。

    组合物LL：环孢菌素A(0.2％)、透明质酸钠(0.10％)、Tween 80(5.00％)、Na₂HPO₄·12H₂O(0.08％)、山梨醇(5.16％)、补足至100mL的纯水，pH 7.0-7.4，mosm/L＝295-305。

    以下组合物意图表示在US 5,951,971的实施例2中所公开的组合物，所述公开以引用的方式纳入本文中。

    组合物MM：环孢菌素A(0.025％)、硬脂酸-40-聚烃氧基酯(0.5g)、羟丙基甲基纤维素(0.2g)、丁基羟基甲苯(0.0005g)、乙醇(0.1g)、氯化钠(0.73g)、磷酸二氢钠(0.2g)、依地酸钠(0.1g)、用于将pH调节至6.0的氢氧化钠和补足至100mL的水。

    在另一个实施方案中，对雌性新西兰白兔的眼睛局部给予一滴本发明组合物或组合物AA后30分钟，其中所述组合物的液滴与组合物AA的液滴的体积相同，所述组合物为雌性新西兰白兔的角膜提供的环孢菌素A比组合物AA提供的更多。

    在另一个实施方案中，对雌性新西兰白兔的眼睛局部给予一滴本发明组合物或组合物BB后30分钟，其中所述组合物的液滴与组合物BB的液滴的体积相同，所述组合物为雌性新西兰白兔的角膜提供的环孢菌素A比组合物BB提供的更多。

    在另一个实施方案中，对雌性新西兰白兔的眼睛局部给予一滴本发明组合物或组合物CC后30分钟，其中所述组合物的液滴与组合物CC的液滴的体积相同，所述组合物为雌性新西兰白兔的角膜提供的环孢菌素A比组合物CC提供的更多。

    在另一个实施方案中，对雌性新西兰白兔的眼睛局部给予一滴本发明组合物或组合物DD后30分钟，其中所述组合物的液滴与组合物DD的液滴的体积相同，所述组合物为雌性新西兰白兔的角膜提供的环孢菌素A比组合物DD提供的更多。

    在另一个实施方案中，对雌性新西兰白兔的眼睛局部给予一滴本发明组合物或组合物EE后30分钟，其中所述组合物的液滴与组合物EE的液滴的体积相同，所述组合物为雌性新西兰白兔的角膜提供的环孢菌素A比组合物EE提供的更多。

    在另一个实施方案中，对雌性新西兰白兔的眼睛局部给予一滴本发明组合物或组合物FF后30分钟，其中所述组合物的液滴与组合物FF的液滴的体积相同，所述组合物为雌性新西兰白兔的角膜提供的环孢菌素A比组合物FF提供的更多。

    在另一个实施方案中，对雌性新西兰白兔的眼睛局部给予一滴本发明组合物或组合物GG后30分钟，其中所述组合物的液滴与组合物GG的液滴的体积相同，所述组合物为雌性新西兰白兔的角膜提供的环孢菌素A比组合物GG提供的更多。

    在另一个实施方案中，对雌性新西兰白兔的眼睛局部给予一滴本发明组合物或组合物HH后30分钟，其中所述组合物的液滴与组合物HH的液滴的体积相同，所述组合物为雌性新西兰白兔的角膜提供的环孢菌素A比组合物HH提供的更多。

    在另一个实施方案中，对雌性新西兰白兔的眼睛局部给予一滴本发明组合物或组合物II后30分钟，其中所述组合物的液滴与组合物II的液滴的体积相同，所述组合物为雌性新西兰白兔的角膜提供的环孢菌素A比组合物II提供的更多。

    在另一个实施方案中，对雌性新西兰白兔的眼睛局部给予一滴本发明组合物或组合物JJ后30分钟，其中所述组合物的液滴与组合物JJ的液滴的体积相同，所述组合物为雌性新西兰白兔的角膜提供的环孢菌素A比组合物JJ提供的更多。

    在另一个实施方案中，对雌性新西兰白兔的眼睛局部给予一滴本发明组合物或组合物KK后30分钟，其中所述组合物的液滴与组合物KK的液滴的体积相同，所述组合物为雌性新西兰白兔的角膜提供的环孢菌素A比组合物KK提供的更多。

    在另一个实施方案中，对雌性新西兰白兔的眼睛局部给予一滴本发明组合物或组合物LL后30分钟，其中所述组合物的液滴与组合物LL的液滴的体积相同，所述组合物为雌性新西兰白兔的角膜提供的环孢菌素A比组合物LL提供的更多。

    在另一个实施方案中，对雌性新西兰白兔的眼睛局部给予一滴本发明组合物或组合物MM后30分钟，其中所述组合物的液滴与组合物MM的液滴的体积相同，所述组合物为雌性新西兰白兔的角膜提供的环孢菌素A比组合物MM提供的更多。

    在另一个实施方案中，对雌性新西兰白兔的眼睛局部给予一滴本发明组合物或组合物AA后30分钟，其中所述组合物的液滴与组合物AA的液滴的体积相同，所述组合物为雌性新西兰白兔的结膜提供的环孢菌素A比组合物AA提供的更多。

    在另一个实施方案中，对雌性新西兰白兔的眼睛局部给予一滴本发明组合物或组合物BB后30分钟，其中所述组合物的液滴与组合物BB的液滴的体积相同，所述组合物为雌性新西兰白兔的结膜提供的环孢菌素A比组合物BB提供的更多。

    在另一个实施方案中，对雌性新西兰白兔的眼睛局部给予一滴本发明组合物或组合物CC后30分钟，其中所述组合物的液滴与组合物CC的液滴的体积相同，所述组合物为雌性新西兰白兔的结膜提供的环孢菌素A比组合物CC提供的更多。

    在另一个实施方案中，对雌性新西兰白兔的眼睛局部给予一滴本发明组合物或组合物DD后30分钟，其中所述组合物的液滴与组合物DD的液滴的体积相同，所述组合物为雌性新西兰白兔的结膜提供的环孢菌素A比组合物DD提供的更多。

    在另一个实施方案中，对雌性新西兰白兔的眼睛局部给予一滴本发明组合物或组合物EE后30分钟，其中所述组合物的液滴与组合物EE的液滴的体积相同，所述组合物为雌性新西兰白兔的结膜提供的环孢菌素A比组合物EE提供的更多。

    在另一个实施方案中，对雌性新西兰白兔的眼睛局部给予一滴本发明组合物或组合物FF后30分钟，其中所述组合物的液滴与组合物FF的液滴的体积相同，所述组合物为雌性新西兰白兔的结膜提供的环孢菌素A比组合物FF提供的更多。

    在另一个实施方案中，对雌性新西兰白兔的眼睛局部给予一滴本发明组合物或组合物GG后30分钟，其中所述组合物的液滴与组合物GG的液滴的体积相同，所述组合物为雌性新西兰白兔的结膜提供的环孢菌素A比组合物GG提供的更多。

    在另一个实施方案中，对雌性新西兰白兔的眼睛局部给予一滴本发明组合物或组合物HH后30分钟，其中所述组合物的液滴与组合物HH的液滴的体积相同，所述组合物为雌性新西兰白兔的结膜提供的环孢菌素A比组合物HH提供的更多。

    在另一个实施方案中，对雌性新西兰白兔的眼睛局部给予一滴本发明组合物或组合物II后30分钟，其中所述组合物的液滴与组合物II的液滴的体积相同，所述组合物为雌性新西兰白兔的结膜提供的环孢菌素A比组合物II提供的更多。

    在另一个实施方案中，对雌性新西兰白兔的眼睛局部给予一滴本发明组合物或组合物JJ后30分钟，其中所述组合物的液滴与组合物JJ的液滴的体积相同，所述组合物为雌性新西兰白兔的结膜提供的环孢菌素A比组合物JJ提供的更多。

    在另一个实施方案中，对雌性新西兰白兔的眼睛局部给予一滴本发明组合物或组合物KK后30分钟，其中所述组合物的液滴与组合物KK的液滴的体积相同，所述组合物为雌性新西兰白兔的结膜提供的环孢菌素A比组合物KK提供的更多。

    在另一个实施方案中，对雌性新西兰白兔的眼睛局部给予一滴本发明组合物或组合物LL后30分钟，其中所述组合物的液滴与组合物LL的液滴的体积相同，所述组合物为雌性新西兰白兔的结膜提供的环孢菌素A比组合物LL提供的更多。

    在另一个实施方案中，对雌性新西兰白兔的眼睛局部给予一滴本发明组合物或组合物MM后30分钟，其中所述组合物的液滴与组合物MM的液滴的体积相同，所述组合物为雌性新西兰白兔的结膜提供的环孢菌素A比组合物MM提供的更多。

    在人类或动物中对两种组合物的比较可通过将所要求保护的组合物给予一只眼睛并将第二种组合物给予第二只眼睛等方式而进行。

    在另一个实施方案中，对雌性新西兰白兔的眼睛局部给予一滴本发明组合物或组合物AA后的24小时内，其中所述组合物的液滴与组合物AA的液滴的体积相同，所述组合物为雌性新西兰白兔的角膜提供的环孢菌素A比组合物AA提供的更多。

    在另一个实施方案中，对雌性新西兰白兔的眼睛局部给予一滴本发明组合物或组合物BB后的24小时内，其中所述组合物的液滴与组合物BB的液滴的体积相同，所述组合物为雌性新西兰白兔的角膜提供的环孢菌素A比组合物BB提供的更多。

    在另一个实施方案中，对雌性新西兰白兔的眼睛局部给予一滴本发明组合物或组合物CC后的24小时内，其中所述组合物的液滴与组合物CC的液滴的体积相同，所述组合物为雌性新西兰白兔的角膜提供的环孢菌素A比组合物CC提供的更多。

    在另一个实施方案中，对雌性新西兰白兔的眼睛局部给予一滴本发明组合物或组合物DD后的24小时内，其中所述组合物的液滴与组合物DD的液滴的体积相同，所述组合物为雌性新西兰白兔的角膜提供的环孢菌素A比组合物DD提供的更多。

    在另一个实施方案中，对雌性新西兰白兔的眼睛局部给予一滴本发明组合物或组合物EE后的24小时内，其中所述组合物的液滴与组合物EE的液滴的体积相同，所述组合物为雌性新西兰白兔的角膜提供的环孢菌素A比组合物EE提供的更多。

    在另一个实施方案中，对雌性新西兰白兔的眼睛局部给予一滴本发明组合物或组合物FF后的24小时内，其中所述组合物的液滴与组合物FF的液滴的体积相同，所述组合物为雌性新西兰白兔的角膜提供的环孢菌素A比组合物FF提供的更多。

    在另一个实施方案中，对雌性新西兰白兔的眼睛局部给予一滴本发明组合物或组合物GG后的24小时内，其中所述组合物的液滴与组合物GG的液滴的体积相同，所述组合物为雌性新西兰白兔的角膜提供更多的环孢菌素A比组合物GG提供的。

    在另一个实施方案中，对雌性新西兰白兔的眼睛局部给予一滴本发明组合物或组合物HH后的24小时内，其中所述组合物的液滴与组合物HH的液滴的体积相同，所述组合物为雌性新西兰白兔的角膜提供的环孢菌素A比组合物HH提供的更多。

    在另一个实施方案中，对雌性新西兰白兔的眼睛局部给予一滴本发明组合物或组合物II后的24小时内，其中所述组合物的液滴与组合物II的液滴的体积相同，所述组合物为雌性新西兰白兔的角膜提供的环孢菌素A比组合物II提供的更多。

    在另一个实施方案中，对雌性新西兰白兔的眼睛局部给予一滴本发明组合物或组合物JJ后的24小时内，其中所述组合物的液滴与组合物JJ的液滴的体积相同，所述组合物为雌性新西兰白兔的角膜提供的环孢菌素A比组合物JJ提供的更多。

    在另一个实施方案中，对雌性新西兰白兔的眼睛局部给予一滴本发明组合物或组合物KK后的24小时内，其中所述组合物的液滴与组合物KK的液滴的体积相同，所述组合物为雌性新西兰白兔的角膜提供的环孢菌素A比组合物KK提供的更多。

    在另一个实施方案中，对雌性新西兰白兔的眼睛局部给予一滴本发明组合物或组合物LL后的24小时内，其中所述组合物的液滴与组合物LL的液滴的体积相同，所述组合物为雌性新西兰白兔的角膜提供的环孢菌素A比组合物LL提供的更多。

    在另一个实施方案中，对雌性新西兰白兔的眼睛局部给予一滴本发明组合物或组合物MM后的24小时内，其中所述组合物的液滴与组合物MM的液滴的体积相同，所述组合物为雌性新西兰白兔的角膜提供的环孢菌素A比组合物MM提供的更多。

    在另一个实施方案中，对雌性新西兰白兔的眼睛局部给予一滴本发明组合物或组合物AA后的24小时内，其中所述组合物的液滴与组合物AA的液滴的体积相同，所述组合物为雌性新西兰白兔的结膜提供的环孢菌素A比组合物AA提供的更多。

    在另一个实施方案中，对雌性新西兰白兔的眼睛局部给予一滴本发明组合物或组合物BB后的24小时内，其中所述组合物的液滴与组合物BB的液滴的体积相同，所述组合物为雌性新西兰白兔的结膜提供的环孢菌素A比组合物BB提供的更多。

    在另一个实施方案中，对雌性新西兰白兔的眼睛局部给予一滴本发明组合物或组合物CC后的24小时内，其中所述组合物的液滴与组合物CC的液滴的体积相同，所述组合物为雌性新西兰白兔的结膜提供的环孢菌素A比组合物CC提供的更多。

    在另一个实施方案中，对雌性新西兰白兔的眼睛局部给予一滴本发明组合物或组合物DD后的24小时内，其中所述组合物的液滴与组合物DD的液滴的体积相同，所述组合物为雌性新西兰白兔的结膜提供的环孢菌素A比组合物DD提供的更多。

    在另一个实施方案中，对雌性新西兰白兔的眼睛局部给予一滴本发明组合物或组合物EE后的24小时内，其中所述组合物的液滴与组合物EE的液滴的体积相同，所述组合物为雌性新西兰白兔的结膜提供的环孢菌素A比组合物EE提供的更多。

    在另一个实施方案中，对雌性新西兰白兔的眼睛局部给予一滴本发明组合物或组合物FF后的24小时内，其中所述组合物的液滴与组合物FF的液滴的体积相同，所述组合物为雌性新西兰白兔的结膜提供的环孢菌素A比组合物FF提供的更多。

    在另一个实施方案中，对雌性新西兰白兔的眼睛局部给予一滴本发明组合物或组合物GG后的24小时内，其中所述组合物的液滴与组合物GG的液滴的体积相同，所述组合物为雌性新西兰白兔的结膜提供的环孢菌素A比组合物GG提供的更多。

    在另一个实施方案中，对雌性新西兰白兔的眼睛局部给予一滴本发明组合物或组合物HH后的24小时内，其中所述组合物的液滴与组合物HH的液滴的体积相同，所述组合物为雌性新西兰白兔的结膜提供的环孢菌素A比组合物HH提供的更多。

    在另一个实施方案中，对雌性新西兰白兔的眼睛局部给予一滴本发明组合物或组合物II后的24小时内，其中所述组合物的液滴与组合物II的液滴的体积相同，所述组合物为雌性新西兰白兔的结膜提供的环孢菌素A比组合物II提供的更多。

    在另一个实施方案中，对雌性新西兰白兔的眼睛局部给予一滴本发明组合物或组合物JJ后的24小时内，其中所述组合物的液滴与组合物JJ的液滴的体积相同，所述组合物为雌性新西兰白兔的结膜提供的环孢菌素A比组合物JJ提供的更多。

    在另一个实施方案中，对雌性新西兰白兔的眼睛局部给予一滴本发明组合物或组合物KK后的24小时内，其中所述组合物的液滴与组合物KK的液滴的体积相同，所述组合物为雌性新西兰白兔的结膜提供的环孢菌素A比组合物KK提供的更多。

    在另一个实施方案中，对雌性新西兰白兔的眼睛局部给予一滴本发明组合物或组合物LL后的24小时内，其中所述组合物的液滴与组合物LL的液滴的体积相同，所述组合物为雌性新西兰白兔的结膜提供的环孢菌素A比组合物LL提供的更多。

    在另一个实施方案中，对雌性新西兰白兔的眼睛局部给予一滴本发明组合物或组合物MM后的24小时内，其中所述组合物的液滴与组合物MM的液滴的体积相同，所述组合物为雌性新西兰白兔的结膜提供的环孢菌素A比组合物MM提供的更多。

    在一个实施方案中，对雌性新西兰白兔的每只眼睛局部给予一滴35μL的所述组合物，在局部给药后30分钟时，为所述兔的角膜提供至少约500ng的环孢菌素A/克该兔的角膜。

    在另一个实施方案中，对雌性新西兰白兔的每只眼睛局部给予一滴35μL的所述组合物，在局部给药后30分钟时，为所述兔的角膜提供至少约2000ng的环孢菌素A/克该兔的角膜。

    在另一个实施方案中，对雌性新西兰白兔的每只眼睛局部给予一滴35μL的所述组合物，在局部给药后30分钟时，为所述兔的角膜提供至少约2400ng的环孢菌素A/克该兔的角膜。

    在另一个实施方案中，对雌性新西兰白兔的每只眼睛局部给予一滴35μL的所述组合物，在局部给药后24小时内，为所述兔的角膜提供至少约17000ng的环孢菌素A/克该兔的角膜。

    在另一个实施方案中，对雌性新西兰白兔的每只眼睛局部给予一滴35μL的所述组合物，在局部给药后的24小时内，为所述兔的结膜提供至少约3300ng的环孢菌素A/克该兔的结膜。

    在另一个实施方案中，所述组合物是一种含有从0.005％到约0.04％环孢菌素A的水性溶液，对雌性新西兰白兔的每只眼睛局部给予一滴35μL的所述组合物，为所述兔的角膜提供至少约17000ng的环孢菌素A/克角膜，这由以下以下步骤测定：

    对15只雌性新西兰白兔试验受试者中的每一只的每只眼睛局部给予所述组合物，并且

    在对所述受试者给药后约0.5小时、约2小时、约6小时、约12小时和约24小时的时间点测定三个受试者的角膜中环孢菌素A的量，

    其中对于每个受试者，只测定一次角膜中环孢菌素A的量。

    在另一个实施方案中，所述组合物是一种含有从0.005％到约0.04％环孢菌素A的水性溶液，对雌性新西兰白兔的每只眼睛局部给予一滴35μL的所述组合物，为所述兔的结膜提供至少约17000ng的环孢菌素A/克结膜，这通过以下方法测定：

    对15只雌性新西兰白兔试验受试者中的每一只的每只眼睛局部给予所述组合物，并且

    在对所述受试者给药后约0.5小时、约2小时、约6小时、约12小时和约24小时的时间点测定三个受试者的结膜中环孢菌素A的量，

    其中对于每个受试者，只测定一次结膜中环孢菌素A的量。

    如上所述，这些组合物适用于除兔以外的其他哺乳动物，包括人。因此，在本申请的权利要求中或别处的以兔体内生物利用率表征的任何组合物都被考虑用于人或其他哺乳动物。借助兔中的生物利用率定义组合物不应被认为将使用所述组合物的治疗方法局限于用于兔，相反，用所述组合物的治疗应被解释为包括对人和其他哺乳动物的治疗。

    前面的描述细化了可用于实行本发明的具体方法和组合物，并给出了涵盖的最佳方式。然而，本领域普通技术人员明了，可以类似的方式制备具有所需药理学性质的其他组合物。因此，尽管前文的字里行间可能出现了细节描述，但其不应被解释为对本文总体范围的限制；相反，本发明的范围应只为权利要求的法律解释所规定。