一种细胞接种方法.pdf

本发明提供了一种细胞接种方法，属于微藻养殖领域，能够有效解决微藻固定化养殖过程中细胞层起泡问题，有效促进营养液在细胞之间的传输，从而提高微藻的养殖产量。所述方法包括：制备含微藻细胞的溶液；预置养殖载体；将所述含微藻细胞的溶液与具有微孔性状的微孔物质附着到所述载体上。本发明可用于微藻固定化养殖的细胞接种过程。

1.  一种细胞接种方法，其特征在于，所述方法包括：
制备含微藻细胞的溶液；
预置养殖载体；
将所述含微藻细胞的溶液与具有微孔性状的微孔物质附着到所述载体上。

2.  根据权利要求1所述的细胞接种方法，其特征在于，
所述将所述含微藻细胞的溶液与具有微孔性状的微孔物质附着到所述载体上包括：
所述含微藻细胞的溶液与所述微孔物质形成混合溶液，将所述混合溶液附着到所述载体上。

3.  根据权利要求2所述的细胞接种方法，其特征在于，所述微孔物质的用量为，所述含微藻细胞的溶液的体积与所述微孔物质的堆积体积之比为20:1-1:5。

4.  根据权利要求2所述的细胞接种方法，其特征在于，在所述将所述混合溶液附着到所述载体上之后，所述方法还包括：
将含微藻细胞的溶液附着到已附着有所述混合溶液的载体上。

5.  根据权利要求1所述的细胞接种方法，其特征在于，
所述将所述含微藻细胞的溶液与具有微孔性状的微孔物质附着到所述载体上包括：
将所述含微藻细胞的溶液与所述微孔物质依次附着到所述载体上。

6.  根据权利要求5所述的细胞接种方法，其特征在于，所述将所述含微藻细胞的溶液与所述微孔物质依次附着到所述载体上包括：
先将所述微孔物质附着到所述载体上，然后将所述含微藻细胞的溶液附着到已附着有所述微孔物质的载体上。

7.  根据权利要求5所述的细胞接种方法，其特征在于，在所述将所述含微藻细胞的溶液与所述微孔物质依次附着到所述载体上之前，所述方法还包括：
将粘性物质涂抹于所述载体上。

8.  根据权利要求1-7任一项所述的细胞接种方法，其特征在于，所述微孔物质包括硅酸钙、活性炭、二氧化硅、微孔陶瓷、丝状藻。

9.  根据权利要求1-7任一项所述的细胞接种方法，其特征在于，所述单个微孔物质的体积与单个微藻细胞的体积之比为10-100：1。

10.  根据权利要求1-7任一项所述的细胞接种方法，其特征在于，所述含微藻细胞的溶液的浓度为0.1-100g/L。

一种细胞接种方法
技术领域
本发明涉及微藻养殖领域，尤其涉及一种细胞接种方法。
背景技术
微藻固定化养殖是指将游离的微藻细胞固定在载体上，使细胞处于相对静止的状态，而营养液具有相对流动状态的一种养殖方式。然而，目前普遍存在的问题是，微藻细胞附着在载体上进行培养，微藻细胞在生长过程中伴随着由于光合作用吸收二氧化碳而放出氧气，但由于细胞之间附着生长会形成紧密的接触，产生的氧气不能及时排出到环境中，因此在固定化养殖过程中细胞层出现起泡的情况。由于气泡的形成，使得营养液在细胞之间的传输较慢，从而导致细胞在营养方面的传质效果较差，进而导致细胞由于缺乏营养而逐渐衰亡，微藻的养殖产量下降。
发明内容
本发明提供了一种细胞接种方法，能够有效解决微藻固定化养殖过程中细胞层起泡问题，有效促进营养液在细胞之间的传输，从而提高微藻的养殖产量。
为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明提供一种细胞接种方法，所述方法包括：
制备含微藻细胞的溶液；
预置养殖载体；
将所述含微藻细胞的溶液与具有微孔性状的微孔物质附着到所述载体上。
具体地，所述将所述含微藻细胞的溶液与具有微孔性状的微孔物质附着到所述载体上包括：所述含微藻细胞的溶液与所述微孔物质形成混合溶液，将所述混合溶液附着到所述载体上。
其中，所述混合溶液中微孔物质的用量为，所述含微藻细胞的溶液的体积与所述微孔物质的堆积体积之比为20:1-1:5。
优选地，在所述将所述混合溶液附着到所述载体上之后，所述方法还包括：
将含微藻细胞的溶液附着到已附着有所述混合溶液的载体上。
具体地，所述将所述含微藻细胞的溶液与具有微孔性状的微孔物质附着到所述载体上包括：将所述含微藻细胞的溶液与所述微孔物质依次附着到所述载体上。
优选地，所述将所述含微藻细胞的溶液与所述微孔物质依次附着到所述载体上包括：先将所述微孔物质附着到所述载体上，然后将所述含微藻细胞的溶液附着到已附着有所述微孔物质的载体上。
可选地，在所述将所述含微藻细胞的溶液与所述微孔物质依次附着到所述载体上之前，所述方法还包括：将粘性物质涂抹于所述载体上。
具体地，所述微孔物质包括硅酸钙、活性炭、二氧化硅、微孔陶瓷、丝状藻。
优选地，单个微孔物质的体积与单个微藻细胞的体积之比为10-100：1。
优选地，所述含微藻细胞的溶液的浓度为0.1-100g/L
本发明提供了一种细胞接种方法，将含微藻细胞的溶液与具有微孔性状的微孔物质都附着到了养殖载体上，这样，微孔物质的微孔可为气体流通提供气体通道，养殖过程中微藻产生的氧气可以及时由该气体通道排出到环境中，从而避免因导致细胞层起泡而阻碍了营养液在细胞之间的传输，进而确保细胞营养充足，提高微藻的养殖产量。
附图说明
图1为本发明实施例提供的一种细胞接种方法的流程图；
图2为本发明实施例提供的细胞与微孔物质附着在养殖载体上的分布示意图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
如图1所示，本发明实施例提供一种细胞接种方法，所述方法具体可以包括：
制备含微藻细胞的溶液；
预置养殖载体；
将所述含微藻细胞的溶液与具有微孔性状的微孔物质附着到所述载体上。
本发明实施例提供一种细胞接种方法，将含微藻细胞的溶液与具有微孔性状的微孔物质都附着到了养殖载体上，这样，微孔物质能够为气体流通提供气体通道，养殖过程中微藻产生的氧气可以及时由该气体通道排出到环境中，从而避免因导致细胞层起泡而阻碍了营养液在细胞之间的传输，进而确保细胞营养充足，提高微藻的养殖产量。
在接种前，一般先将待接种的微藻细胞配置成一定浓度的含微藻细胞的溶液，为简便起见，下文可以将含微藻细胞的溶液简称为藻细胞液。藻细胞液的浓度一般可以为0.1-100g/L，优选为10-50g/L。浓度太大，会使细胞在生长过程中彼此之间接触更加紧密；浓度太小，则会造成对养殖过程中所提供的光、营养液等资源的浪费，本发明所提供这一浓度既提供了适宜的微藻细胞接种量，又可以充分利用光、营养液等资源。
在接种过程中，将藻细胞液与具有微孔性状的微孔物质附着到载体上可以包括如下两种具体方式：
1)可以将藻细胞液与微孔物质预先混合，然后同时附着到载体上，具体可以为：先将上述藻细胞液与微孔物质形成混合溶液，然后将所述混合溶液附着到所述载体上。
2)将藻细胞液与微孔物质依次附着到所述载体上。
对于方式1)，可以将这种接种方法看作为“藻细胞液+微孔物质”接种模式，如图2所示，原理性示出了接种后的载体上微藻细胞与微孔物质的分布，微孔物质1与藻细胞2都均匀地附着到了载体上，藻细胞与微孔物质在载体上形成的是藻细胞与微孔物质的混合层3，微孔物质在一定程度上分隔了细胞，避免藻细胞全部聚集在一起，形成紧密接触，在此基础上，微孔物质的微孔还能为微藻产生的氧气提供气体通道，使氧气由微孔排出到环境中，消除了由于气体不能及时排出导致的细胞层起泡问题。
其中，微孔物质可以为具有微孔性状的固体颗粒，例如硅酸钙、活性炭、二氧化硅、微孔陶瓷等，其表面和内部具有大量的微小气孔，这些气孔可以提供气体流体的通道；微孔物质也可以是丝状藻，丝状藻的藻体一般为由圆筒状细胞相连而成的单列、不分枝的丝状体，是一类较为特殊的微藻，生长过程中细胞彼此之间不会形成致密接触，会留有较为疏松的空隙，养殖过程中产生的气体可由此空隙排出。
微孔物质的用量要适当，既要能够提供足够的气体通道，还要保证微藻细胞的接种量，具体地，以体积计，在混合溶液中微孔物质的用量为，藻细胞液的体积与微孔物质的堆积体积之比为20:1-1:5，例如可以为20:1、15:1、10:1、5:1、5:2、1:1、1:3、1:5等，也就是以藻细胞液的体积和微孔物质的堆积体积来确定微孔物质的用量，这样便于称量微孔物质，在实际应用中直接、方便。需要说明的是，微孔物质的堆积体积可以理解为用容器称量微孔物质时微孔物质在容器中所占据的空间体积，也是容器的刻度值。
单个微孔物质的体积也要大小适宜，大了会增加接种层的厚度，而小了又不能有效地将微藻产生的气体排出。在本发明优选实施例中，单个微孔物质的体积与单个微藻细胞的体积之比可以为10-100：1，例如10:1、15:1、20:1、50:1、70:1。
进一步地，在本发明另一优选实施例中，将混合溶液附着到所述 载体上之后，还可以将含微藻细胞的溶液附着到已附着有所述混合溶液的载体上。
可以将这种接种方法看作为“(微孔物质+细胞)-细胞”接种模式。在该模式中，先取一定体积的藻细胞液与微孔物质形成混合溶液，然后首先将混合溶液在载体上形成一层微孔物质与藻细胞液的混合接种层，其次再取一定体积的藻细胞液接种于该混合接种层之上，即接种后的细胞层可以分为下、上两个层面，下面的层面为利用微孔物质与藻细胞混合，形成细胞-微孔物质均匀混合的混合层，该层具有将本层细胞和上面的细胞层由于光合作用所产生的氧气通过该层的微孔通道传导出去，可防止细胞表层的起泡情况。上层的细胞层避免微孔物质暴露在表层而影响太阳光的接收总量，进一步促进了各细胞层细胞的正常生长。
对于方式2)，将藻细胞液与微孔物质依次附着到载体上具体可以包括：先将微孔物质附着到载体上，然后将藻细胞液附着到已附着有微孔物质的载体上。可以将这种接种方法看作为“微孔物质-细胞”接种模式，载体上首先形成一层微孔物质层，然后在该层的基础上形成一层细胞层，微孔物质层将细胞层由于光合作用所产生的氧气通过该层的微孔通道传导出去，可防止细胞表层的起泡情况。
可以理解的是，方式1)中对于微孔物质的描述及限定同样也适用于方式2)中。
为了提高微孔物质在载体上的附着强度，可以在将其附着到载体上之前，尤其当微孔物质选择为固体颗粒时，先将粘性物质涂抹于载体上，即“粘性物质-微孔物质-细胞”接种模式；当然也可以先将粘性物质与微孔物质混合，然后一起附着到载体上，形成粘性物质和微孔物质的混合层，即“(粘性物质+微孔物质)-细胞”接种模式。
具体地，粘性物质可以是任何对细胞生长无毒性且不与载体发生反应的、具有粘性的物质，例如一些粘结剂或微藻细胞。这里，微藻细胞由于自身具有一定的粘性，因而也同样可以用作粘性物质，此时， 本发明所述接种方法为：先将很少量的藻细胞液附着到载体上，然后再依次附着微孔物质、藻细胞液，这种接种方法可以看作是“细胞-微孔物质-细胞”接种模式，首次附着到载体上的藻细胞液的主要目的是起到类似于粘性物质的作用，提高微孔物质与载体的附着强度。
可以理解的是，常用的喷雾、抽滤、涂覆、浸泡等接种方式都适用于本发明所述方法，例如以抽滤为例，可以将上述藻细胞液添加到抽滤装置中，然后加压抽滤将藻细胞液附着到载体上，完成接种。本发明在此不作进一步限定。
下面通过具体实施例进一步详细说明本发明实施例提供的细胞接种方法。
待接种的微藻细胞均以小球藻为例，在接种前制备成浓度为1g/L的含微藻细胞的溶液(藻细胞液)50ml。
对比例：
利用负压抽滤的方式将50ml藻细胞液接种到直径47mm的醋酸纤维滤膜上(105℃烘至恒重，记录质量)，滤膜再固定在衬板上进行培养，人工光源150umol/m2/s，过程控制藻细胞液pH值在7-9范围内，温度控制在23-27℃，经过5天的培养，将藻细胞和醋酸纤维滤膜一同放置105℃烘箱烘至恒重，利用差值法计算藻细胞增加的重量，微藻的受光面积产量为12.0g/m2/d。
实施例1：
微孔物质使用二氧化硅颗粒。
按藻细胞液的体积为50ml、藻细胞液的体积：二氧化硅的堆积体积为5:1量取二氧化硅颗粒。
先利用负压抽滤的方式将二氧化硅颗粒附着到直径47mm的醋酸纤维滤膜上，然后再次利用负压抽滤的方式将藻细胞液接种到该醋酸纤维滤膜上(105℃烘至恒重，记录质量)，滤膜再固定在衬板上进行培养，人工光源150umol/m2/s，过程控制藻细胞液pH值在7-9范围内，温度控制在23-27℃，经过5天的培养，将藻细胞和醋酸纤维滤膜一同 放置105℃烘箱烘至恒重，利用差值法计算藻细胞增加的重量，微藻的受光面积产量为13.8g/m2/d，与对比例相比提高15％。
实施例2：
微孔物质使用活性炭颗粒。
按藻细胞液的体积为50ml、藻细胞液的体积：活性炭的堆积体积为8:3取活性炭颗粒。
将活性炭颗粒与藻细胞液混匀后形成混合溶液，然后利用负压抽滤的方式将该混合溶液接种到直径47mm的醋酸纤维滤膜上(105℃烘至恒重，记录质量)，滤膜再固定在衬板上进行培养，人工光源150umol/m2/s，过程控制藻细胞液pH值在7-9范围内，温度控制在23-27℃，经过5天的培养，将藻细胞和醋酸纤维滤膜一同放置105℃烘箱烘至恒重，利用差值法计算藻细胞增加的重量，微藻的受光面积产量为14.3g/m2/d，与对比例相比提高19.2％。
实施例3：
微孔物质使用二氧化硅颗粒。
按藻细胞液的体积为35ml、藻细胞液的体积：二氧化硅的堆积体积为10:1量取二氧化硅颗粒。
将二氧化硅颗粒与藻细胞液混匀后形成混合溶液，利用负压抽滤的方式将其接种到直径47mm的醋酸纤维滤膜上(105℃烘至恒重，记录质量)，形成含有颗粒的藻细胞层，再在这层基础上利用抽滤方式将剩余15ml藻细胞液均匀抽滤至其表面上，再固定在衬板上进行培养，人工光源150umol/m2/s，过程控制藻细胞液pH值在7-9范围内，温度控制在23-27℃，经过5天的培养，将藻细胞和醋酸纤维滤膜一同放置105℃烘箱烘至恒重，利用差值法计算藻细胞增加的重量，微藻的受光面积产量为15.5g/m2/d，与对比例相比提高29％。
实施例4：
微孔物质使用丝状藻。
按藻细胞液的体积为35ml、藻细胞液的体积：丝状藻的堆积体积 为1:1量取丝状藻。
将丝状藻与藻细胞液混匀后形成混合溶液，利用负压抽滤的方式将其接种到直径47mm的醋酸纤维滤膜上(105℃烘至恒重，记录质量)，形成含有颗粒的藻细胞层，再在这层基础上利用抽滤方式将剩余15ml藻细胞液均匀抽滤至其表面上，再固定在衬板上进行培养，人工光源150umol/m2/s，过程控制藻细胞液pH值在7-9范围内，温度控制在23-27℃，经过5天的培养，将醋酸纤维滤膜上的藻细胞利用培养基洗至烧杯中，按顺序使用200、300目筛绢对藻细胞液的进行过滤3次，去除藻细胞液中的丝状藻细胞，形成小球藻藻细胞液。再使用培养所用的醋酸纤维滤膜(用前烘至恒重，记录质量)将小球藻藻细胞液进行抽滤，将藻细胞和醋酸纤维滤膜一同放置105℃烘箱烘至恒重，利用差值法计算藻细胞增加的重量，受光面积产量为15.0g/m2/d，与对比例相比提高25％。
由上述结果可知，与对比例相比，实施例1-4采用本发明所述细胞接种方法，将微孔物质与小球藻藻细胞液都附着到载体上，有效排除养殖过程产生的气体，避免了气泡现象，确保了细胞的正常生长；与实施例1、2相比，实施例3、4采用了“微孔物质+细胞—细胞”接种模式，上层细胞层覆盖了微孔物质，提高了微藻细胞对光照的接收从而促进微藻细胞的生长，提高了养殖产量。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围。